Ganoderma lucidum и нейните фармакологично активни съединения Ganoderma lucidum

Bojana Boh¹, Marin Berovic²'¹, Jingsong Zhang³ and Lin Zhi-Bin⁴

Различните групи фармакологично активни химични съединения са изолирани от мицела и плодното тяло на различните видове Ganoderma: тритерпеноиди, полизахариди, протеини, аминокиселини, нуклеозиди, алкалоиди, стероиди, лактони, мастни киселини и ензими [1,3]. Най-важните фармакологично активни съставки на гъбите Ganoderma са тритерпеноидите и полизахаридите.

Фиг. 1. Плодно тяло на Ganoderma lucidum (MZKI G97) изолирано първоначално от Словенската гора.

Изкуственото култивиране на G. lucidum придобива особена важност, за да се посрещат нуждите на международните пазари при твърде оскъдното разпространение на гъбата в природата (Фиг. 3).

Основни традиционни методи за култивиране на плодното тяло на G. lucidum си остава култивирането в дървени стърготини в торби или бутилки или върху естествени дънери на дървета. И двете технологии на култивиране зависят от едни и същи съществени фактори на околната среда, каквито са температурата, влагата и кислородът [24]. Мицелът се развива при 10-38°C, като оптималната температура за инкубирането му е между 25°C и 32°C. Оптималното съдържание на влага в субстрата от дървени стърготини е 65-70%, а тази в дънера – около 40%. За оптимално pH се счита 4.2-5.3. За растежа на мицела не е необходимо да има непременно светлина. Кислородът обаче е задължителен за растежа на мицела, тъй като G. lucidum е стриктен аероб. В следващия стадий на култивиране, образуването на примордиум, G. lucidum дава плод и се развива при 20-34°C, като оптималната температура е 27-32°C. В помещението за отглеждане трябва да се поддържа влажност около 90% по време на примордиалния стадий, 70-80% по време на образуването на щапчица и 30-40% по време на крайния стадий от развитието на плодното тяло. По време на примордиалното формиране и развитието на плодното тяло се изисква светлина между 50 и 450 лукса. След образуването на шапчицата помещението, където се отглежда гъбата, трябва да бъде добре вентилирано.

Chen [25] публикува подробна информация за формулирането на субстрата за отглеждане на G. lucidum. Тъй като G. lucidum е лигнин разграждаща гъба, причиняваща бяло загниване на твърди дървета, естествен субстрат за отглеждането й са дървените стърготини. За образуването на гъбата е необходим тиамин, който се съдържа в пресните непреработени

сурови трици. Необходимо е невисоко съдържание на захар (1% захароза), за да се задейства формирането и активирането на лигнин разграждащите ензими. Калцият изглежда подтиква диференцирането на гъбата. Наличието на вода в субстрата пречи на кислородния обмен и спира притока на кислород. Правилният кислороден обмен се затруднява, когато дървените частици на субстрата са твърде фини. От друга страна, ако в субстрата има груби тресчици, те могат да пробият торбата и да благоприятстват замърсяването му.

В миналото за отглеждане на видовете Ganoderma в Китай са се използвали естествени дънери, дълги по един метър, без предварително стерилизиране. Култивирането на плодни тела върху дълги дънери е много трудоемко. За да се получат зрели плодни тела върху такива субстрати е бил необходим дълъг инкубационен период (2-3 години) [24,26].

От края на 1980-те години има нова тенденция – да се използват къси дънери. Почти всички хора, занимаващи се с естествено отглеждане на Ganoderma spp.в Китай, Япония, Съединените щати и другаде, са възприели отглеждането върху къси дънери, при което се получава голяма реколта за по-кратко време на култивиране. Култивирането върху къси дънери изисква само 4-5 месеца за инкубация на мицела, а плодните тела могат да се събират още същата година. Процедурите за култивиране върху къси дънери са описани подробно в други публикации [24,26-28].

• 
  Подготовка на дънери. Могат да се използват повечето широколистни дървета с твърда дървесина. Стандартните размери са диаметър 15 см и дължина 15-24 cм. Съдържанието на влага трябва да е 35-40%.
  
• 
  Поставяне на дънерите в торби, стерилизиране. Използват се запечатани с топлина полипропиленови или полиетиленови торби, на които има прозорчета от микрофилтър.
  
• 
  Мицелиране. Могат да се използват различни мицели като например чиста култура от течен мицел, зърнен мицел и мицел в дървени стърготини и трици. Обикновено за всеки дънер се използват по 5 – 10 грама мицел.
  
• 
  Развъждането на мицела се прави на тъмно и този процес изисква по-малко кислород. Специално внимание трябва да се отдели на осигуряването на правилна мицелна колонизация в дънера. Липсата на кислород или лошото аериране, каквото има при голямо водно съдържание на дънера води до слабо развитие на мицела и бавен растеж.
  
• 
  Начало на примордиите. Примордиите на Ganoderma spp. обикновено се образуват 50-60 дни след поставянето на мицела. Излагането за кратко време на много слаба светлина дава начален тласък на образуване на примордиите на Ganoderma spp. Кислородът също има отношение към образуването на примордии.
  
• 
  Поставяне в почва. След образуването на примордии колонизираните дънери се забиват директно вертикално в почвата, като примордиите остават над нивото на земята. За задържане на влагата почвата се покрива с начупена слама.
  
• 
  Поддържане на подходящи параметри на растеж. Най-критичният фактор за слагане на начало на примордиите е високата влажност, за предпочитане 90-95%, докато най-критичният фактор по време на диференциране на гуглата в плод, е повишаването на вентилацията за редуциране на CO₂ натрупан по време на драстичното повишаване на дишането при съзряването на Ganoderma spp. Процесът на диференцирането в плод на Ganoderma spp. е много чувствителен към концентрацията на CO2, което определя, дали ще се образуват разклонени като еленови рога плодни тела (CO₂ > 0.1%) или ще се образуват плодни тела с добре оформена гугла (CO₂<0.1%). За продуцирането на гъби с гугли (шапчици), е необходима концентрация на CO₂ 0.04-0.05% или колкото е възможно по-близо до концентрацията на пресния въздух (0.03% CO_2). Необходимата влажност на въздуха може да се осигури чрез доставяне на фина мъгла (1-2 или 3-4 пъти дневно).
  
• 
  Прибиране на гъбената реколта. От формирането на примордии до наличието на плодни тела за прибиране минават приблизително 25 дни. Зрелостта на плодовете се установява по изчезването на недиференцирания бял растеж по ръба на плодното тяло. След това култивирането продължава при намалена влажност на въздуха до 60-85% за още 7-10 дни, през които се очаква увеличаване на дебелината и твърдостта на гуглата. Прибирането на реколтата става чрез отрязване на дръжката (стъблото), като само 2 cм от него остават с гуглата.
  

Култивиране на плодните тела върху субстрат от дървени стърготини

Според Royse [29], по-голямата част от култивирането на G. lucidum се извършва на дървени стърготини, доставяни в топлоустойчиви полипропиленови бутилки или торби. Стърготините, получени от дървета с твърд лигнин, обикновено се смесват с оризови трици (10%) и CaCO₃ (3%). Сместа се овлажнява с вода и се поставя в количество от по 700 грама в пластмасови торби. След това на всяка торба се поставя пластмасова яка и торбата се запушва с памучна тапа. Следва третиране на субстрата с топлина (95-100°C за 5 часа) и последващо охлаждане в продължение на една нощ. След това се инокулира със зърнен мицел или такъв в дървесни стърготини. Инокулираният субстрат се инкубира в продължение на 3-4 седмици или докато мицелът колонизира напълно субстрата. Производството на гъбите започва чрез поддържане температурата на въздуха на около 28°C при относителна влажност в границите на 85-90%. Базидокарпите започват да се появяват около 1-2 седмици след този начален момент. Приблизително 2-3 месеца след появата на примодиите гъбите са готови за прибиране на реколтата. Една гъба се счита за зряла, когато белезникавият ръб по края на базидокарпа стане червен. Субстратът може да даде още една реколта след прибирането на първата.

За култивиране на Ganoderma Chen [25] препоръчва следната формулация на субстрата: дъбови стърготини 80%, пресни сурови непреработени пшенични трици 18%, към които са добавени захароза 1%, калциев карбонат (или калциев сулфат) 1% и приблизително 67-70% вода. За 500 грама сух субстрат (съдържащ 400 грама дъбови стърготини и 90 грама пшеничени трици) се добавя 1 литър вода, в която има 5 грама захароза и 5 грама калциев карбонат. Хора, занимаващи се с отглеждане на гъби в Съединените щати, успешно прилагат тази формулация, увеличавайки я пропорционално. Друга обширна статия върху култивирането на Ganoderma в торби (синтетични дънери) може да се намери в референциите [30].

Няколко публикации описват култивирането на G. lucidum в торби при неконвенционални условия. В японски патент [31] се заявява, че се извършва култивиране в торби на плодни тела на G. lucidum с форма на еленови рога. Nascimento [32] отглежда G. lucidum в полипропиленови торби върху тресчици от твърдо дърво и стърготини от две чилийски местни червени дървета, Nothofagus obliqua и Nothofagus alpine. Той не е наблюдавал никаква разлика в плодния стадий между двата вида на трите дървета. Gonzalez-Matute et al. [33] проучват възможностите за култивиране на G. lucidum в торби върху обелки от слънчогледови семки в качеството на основен хранителен източник (синтетична дънерова система). Заключението от тяхното проучване е, че обелките от слънчогледови семки могат да се използват като главен енергиен и хранителен източник в субстрати за култивиране на G. lucidum при добавяне на 5% малц за подобряване растежа на гъбата. Yang et al. [34] използват за култивиране G. lucidum в полипропиленови торби стелажно зърно останало от дестилацията на оризов спирт.

Поради високото си съдържание на въглехидрати и азот стелажното зърно е обсъждано като хранителен субстрат за мицели. Оптимални за продукцията на плодови тела се оказали дървените стърготини, към които е добавено стелажно зърно в съотношение 4:1 и водно съдържание 60%. Hsieh et al. [35] използват за култивиране на G. lucidum в полипропиленови торби соеви остатъци от производството на тофу. Плодните тела се развивали напълно само при съотношение на C и N 70 към 80.

Субстрати от дървени стърготини в бутилки и гърнета

Kim [36] отгледал двадесет и един изолата от девет вида Ganoderma (включително G. lucidum) върху солидни субстрати на основата на дървени стърготини в 2l стерилизуеми пластмасови бутилки. Субстратът бил приготвен чрез смесване на дъбови стърготини и пшеничени трици (8:2, v/v) с добавяне на вода до 65% от общия обем. В помещението за култивиране до примордиалното формиране се поддържала температура 28-31 °C и относителна влажност 85%, а след това помещението било вентилирано по един или два пъти за по 10-20 минути. След образуването на гугла, вентилирането било по-често (5-6 пъти дневно), и била поддържана относителна влажност 80-85%.

Японски патент [37] описва култивиране на G. lucidum и други гъби в бутилки, в които се прилага отрицателно напрежение, чрез което се активира производство на висококачествени гъби за кратко време. Друг японски патент описва метод за култивиране на Ganoderma в гърнета с пластмасов капак за предпазване на развъдното легло от навлизане на бактерии. В труда на Shigeru [39] за култивиране на G. lucidum в бутилки фино нарязани изтънени цитрусови плодове и остатъци от цитрусов сок са прибавени към средата за култивиране от оризови трици в съотношение около 10:2. За развитието на плодни тела Ganoderma е култивирана на около 25-30°C при влажност 60-90%.

Субстрати от дървени стърготини в подноси и легла

Chen [28] съобщава за култивиране на G. lucidum в северна Америка на подноси или в легла. В статията се казва, че леглата от тресчици или дървени стърготини спестяват труд, при условие, че се избягва контаминирането им. Субстратът от тресчици с добавени дървени стърготини, дебел 12 см е разстлан равномерно върху подноси или легла за култивиране. Колонизираните дървени стърготини, зърно или течна среда с дебелина 0.5 см или повече се засява повърхностно при неподвижност на въздуха и се покрива с лист пластмаса. След 3-5 дни се появява слой от бял мицел, който започва да прониква в субстрата. Пластмасовият лист се отстранява след 1-2 месеца, когато са се образували примордии. В една трета от помещението се поддържа дифузна светлина, относителна влажност 85-95% и температура 25°C. Три до пет пъти дневно се извършва циркулиране на въздуха или аерация за по 5-10 минути.

Словенски патент [40] описва процес на отглеждане на G. lucidum върху солиден субстрат за култивиране в хоризонтално раздвижван биореактор. Процесът позволява прецизно ръководене и мониторинг на гъбичния растеж при стерилни условия. При този процес могат да се получат големи количества биомаса от продукти, подходящи за фармацията. Биомасата може да се използва също като солиден инокулум за по-нататъшно култивиране на G. lucidum.

В един световен патент с китайски приоритет [41] се описва метод за пропагиране на гъбите и продуциране на фунгални метаболити с медицински действия при използване на процес на ферментация в солидна среда и култивиране в бутилки. Изобретението описва също субстрати за фунгално култивиране на G. lucidum, Cordyceps sinensis, Antrodia camphorata, Trametes versicolor и Agaricus blazei в малки и големи мащаби.

Chen [28] съобщава, че в северна Америка мицелните препарати на Ganoderma за човешка консумация се получават чрез ферментация в субстрати на зърнена или соева основа

Авторите използват субстрати с различен състав за култивиране на мицели на G. lucidum чрез потапяне. Такава среда, дадена в [28] се състои от захароза 50.0 г, амониев сукцинат 3.2г, KH₂PO₄ 1.0 г, MgSO₄ • 7H₂O 0.3 г, FeSO₄ • 7H₂O 13.0мг, ZnSO₄ • 7H₂O 4.0мг, дрождев или малцов екстракт 10.0г, нагласена на pH 5.2 чрез концентриран амоняк, вода до 1 литър.

Chang et al. [42] съобщават за култивиране на потопена култура на G. lucidum в шейкър с оптимизирана среда, състояща се от1.88 g/l CaCO₃, 71.4 кафява захар, 12.1 g/l малцов екстракт, 2.28 g/l дрождев екстракт, 18.4g/l обезмаслено мляко, 3.44g/l олио от шафранови семена, 3.96 g/l зехтин при pH 6.5. Образуването на мицел се подобрило значително в сравнение с използването на не оптимизиран субстрат, от 1.70 g/l на 18.70 g/l, а полизахаридната продукция се увеличила от 0.140 g/l на 0.420 g/l.

Hsieh et al. [43] изучават продуцирането на полизахариди от G. lucidum в шейкър при ограничаване на различни нутриенти, включително източниците на въглерод, азот, фосфат, магнезий и разтворен кислород. При различни ограничения на нутриентите е наблюдавана различна продукция на полизахариди. Словенски патент [44] описва процедура за приготвяне на инокулум от G. lucidum в разклащана култура и продуцирането на мицели в биореактор при ферментиране в течна среда. Съгласно описанието в патента, обраслият от гъбата G. lucidum картофено-декстрозен агар с обща площ 100-200 мм² се пренася в 500 милилитрова Ерленмайерова колба, съдържаща 100 мл субстрат. Вегетативният субстрат съдържа филтрат от белени варени картофи 300 g/l, 20 g/l глюкоза и 2% v/v зехтин и се допълва с дестилирана вода с pH 5.8 до общ обем от 1 литър. Културата в тази среда се разклаща в продължение на 80-160 часа при температура 20-30°C и 80-160 завъртвания на минута. Субстратът се стерилизира в биореактор при температура 110-130°C и размесва при 200-400 завъртания в минута в продължение на около половин час. След охлаждане до 30°C стерилният субстрат в биореактора се инокулира с 17% v/v от вегетативния инокулум, съдържащ мицел на G. lucidum, продуциран в разклащана култура в продължение на 120-170 часа. Растежът на мицела продължава 160 часа, по време на което концентрацията на разтворения кислород се поддържа чрез аериране на 6-15 литра в минута при 200-600 завъртвания в минута, максимален редокс потенциал по време на растежа, достигащ до 410-460 mV и минимално парциално налягане на кислорода от 25 до 33% v/v при pH от 4.10 до 4.30.

Yang и Liau [45] изучават влиянието на параметрите на култивиране върху образуването на полизахариди от потопени култури на G. lucidum. Субстратът им се е състоял от глюкоза 50 g/l; K2HPO4 0.5 g/l; KH2PO4 0.5 g/l; MgSO4 • 7H20 0.5 g/l; дрождев екстракт 1 g/l и амониев хлорид 4 g/l. Оптималната температура била 30-35°C, а pH 4-4.5. Концентрацията на полизахариди достигнала 1.6mg/ml. Разклащането и аерирането са оказали влияние върху образуването и секретирането на полизахариди. Оптималната скорост на въртене на 7-дневни култури в колба била 150 rpm, а скоростта на разклащане на културата във ферментора имала голямо влияние върху количеството и максималната концентрация на полизахаридите. Въпреки че по-високата скорост увеличавала ефикасността на смесването и отделянето на полизахариди, по-високият режещ натиск имал пагубен ефект върху растежа на мицела и образуването на полизахариди.

Lee [46] съобщава, че контролът върху рН при култивирането на мицел от G. lucidum влияе съществено върху растежа на мицелните клетки и продукцията на екзополизахарид. Ферменторът бил от типа с концентрична вътрешна тръба, при който режещият натиск е значително по-малък отколкото при ферментора от ротационен тип. Пет процента (v/v) от културата била инокулирана във ферментора и култивирана на 25°C с доставяне по време на производството на въздух със скорост от 2.5 vvm. Двуетапната техника за контрол на pH, при която pH се променя в началната фаза на експоненциалния растеж от 3 на 6 повишава продукцията на екзополизахарид от 4.1 g/l при култивирането без контрол върху pH на 20.1 g/l. Тя запазва желаната морфология на мицела по време на култивирането, води до малък вискозитет и осъществяване на слаб натиск върху културелния бульон. Fang and Zhong [47] проучват ефектите от началното pH върху едновременното продуциране на ганодерова киселина и полизахариди от G. lucidum. Стойността на началното pH, варираща в границите на 3.5-7.0, има съществен ефект върху клетъчния растеж и продуктовата биосинтеза. При начално pH 6.5 се получава максимална биомаса със сухо тегло 17.3 ± 0.12 g/l, както и максимална специфична продукция на ганодерова киселина от 1.20 ± 0.03mg/100mg сухо тегло и обща продукция от 207.9 ± 2.7mg/l. Снижаването на началното pH от 6.5 на 3.5 постепенно води до по-голяма продукция на екстрацелуларен полизахарид и по-висока специфична продукция на интрацелуларен полизахарид. Същата група изследователи [48] проучва ефектите на азотния източник и първоначалната глюкозна концентрация при ферментация с потапяне на G. lucidum върху едновременната продукция на биоактивна ганодерова киселина и полизахариди. Клетките не са можели да растат добре при използване само на дрождев екстракт или пептон като единствен източник на азот. Едновременното добавяне на дрождев екстракт 5 g/l и пептон 5 g/l било оптимално за клетъчния растеж и продукцията на метаболити. Първоначалната глюкозна концентрация в границите на 20-65 g/l оказвала голямо влияние върху клетъчния растеж и биосинтеза на продукти. Най-високи нива на клетъчна плътност (16.7 g сухо тегло на литър), интрацелуларен полизахарид (1.19 g/l) и ганодерова киселина (212.3 mg/l) били получени при начална концентрация на глюкозата 50 g/l.

Fang et al. [49] също съобщават за значението на контрола върху инокулационната плътност за продукцията на полизахариди и ганодерова киселина при култивиране на G. lucidum чрез потапяне. Контролът върху инокулационната плътност е въжен за клетъчния растеж, морфологията и продукцията на полизахариди и ганодерова киселина. Максимална клетъчна концентрация от 15.7 грама сухо клетъчно тегло на литър е получена при инокулационна плътност 330 мг сухо тегло/литър. Голямата инокулационна гъстота от порядъка на 70-670 мг сухо тегло/литър води до образуване на малка топчица и висока продукция на екстрацелуларни и интрацелуларни полизахариди, докато при ниска инокулационна плътност се образува сравнително голяма топчица с високо съдържание на ганодерова киселина. Наблюдавано е също, че малкият размер на топчицата е свързан с голямо производство на полизахариди, а големият й размер – с голямо производство на ганодерова киселина

В труда на Berovic et al. [20] G. lucidum е култивирана в течен субстрат на база картофена декстроза и зехтин. Авторите проучват влиянието на инокулума и парциалното налягане на кислорода при партидното производство и култивиране по технология „fed-batch” в 10 литров лабораторен разбъркващ реактор. Условията на култивиране са били следните: T = 30°C; смесване, N = 300 min^-1; аериране, Qg = 10l min^-1; средни стойности на pH, 5.8-4.2; парциално налягане на кислорода, 70-80% и редокс потенциал, Eh = 300-400 mV. Установява се, че фунгалната биомаса е чувствителна на кислород и срязване. При използване на 17% (мокро тегло) 6 дневен вегетативен инокулум и обикновено култивиране се получават 9.6 g l - ^l суха биомаса, а при „fed-batch” - 15.2 g l^_l. Изолирани са екстрацелуларните (9.6g l^_l) и интрацелуларните (6.3 g l^_l) полизахаридни фракции. Получена е една екстрацелуларна полизахаридна фракция и четири интрацелуларни полизахаридни фракции. След това полизахаридите са сепарирани посредством йонен обмен, афинитетна хроматография Изолираните полизахариди са предимно b-D-глюкани. Имуностимулиращите въздействия на изолатите са тествани за индукция на синтез на цитокини (тумор некротизиращ фактор a (TNF-a) и интерферон g (IFN-g)) в първични култури от човешки мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) изолирани от т.нар buffy coat². Степента на активиране на TNF-a била сравнима с тази на Romurtide, който се използва като поддържаща терапия при раково болни, третирани с радиотерапия и/или химиотерапия.

Tang and Zhong [50] изучават ефекта на източника на въглерод и началната захарна концентрация върху продукцията на ганодерова киселина и полизахариди при култивиране на G. lucidum по метода „fed-batch” в разклащащи колби и в биореактор със струйно размесване. Захарозата като източник на въглерод се оказала подходяща за продуциране на екстрацелуларните полизахариди въпреки, че клетките не растели добре. Лактозата била благотворна за клетъчния растеж и продуцирането на ганодерова киселина и интрацелуларните полизахариди. Когато обаче началната концентрация на лактозата надхвърляла 35 g/l, се забелязвало намаляване в натрупването на ганодерова киселина. Продукцията на ганодерова киселина се подобрявала значително при ударно вкарване на лактоза, при което нейната остатъчна концентрация била 10 g/l и 5 g/l.

Ферментирането на G. lucidum чрез потапяне се счита за бърза и рентабилна алтернатива за ефикасно производство на полизахариди и ганодерови киселини от G. lucidum. Но култивирането на мицелите чрез потапяне е свързано с повишаване вискозитета на бульона като последица от повишаващата се клетъчна концентрация и натрупването на екстрацелуларни полизахариди. Това променя драматично реологичните характеристики на ферментационния бульон и създава серия от проблеми за решаване, един от които е снабдяването с кислород. Кислородът влияе върху клетъчния растеж, морфологията на клетките, използването на нутриентите и метаболитната биосинтеза. Tang et al. [51] описват ефектите на снабдяването с кислород при култивиране на G. lucidumin чрез потапяне в 3.5- литров разбъркващ биореактор с два шест-лопаткови турбинни ротора. Аерацията се осъществява чрез пръстеновиден разпръсквач с големина на порите 0.8 мм. Ферментацията се извършва на тъмно при 30°C. Култивиращата среда се състои от 35 g/l лактоза, 5 g/l пептон, 2.5g/l дрождев екстракт, 1 g/l KH2PO4 • H2O, 0.5 g/l MgSO4 • 7H2O и 0.05g/l витамин B1. Резултатите показват, че стойности на началния коефициент на волуметричен кислороден пренос (K_La) в границите на 16.4-96.0 h^_1 оказват значителен ефект върху клетъчния растеж, морфологията на клетките и биосинтеза на метаболитните. Повишаване на началния K_La води до по-голям размер на мицилните агрегати и по-висока продукция на ганодерови киселини. Fang et al. [49] изучават значението на плътността на инокулума и на размера на топчицата в потопената култура на G. lucidum за продуцирането на полизахариди и ганодерова киселина. Тествани са инокулуми с големина 70, 170, 330 и 670 мг сухо клетъчно тегла (DW) за литър. Плътността на инокулума значително е повлиявала процеса на култивиране. Малкият размер на топчиците е бил свързан с висока продукция на полизахариди, а големият размер – с висока продукция на ганодерова киселина. Топчици с диаметър по-малък от 1.2 мм, 1.2-1.6 мм и по-голям от 1.6 мм са имали следното съдържание на ганодерова киселина: 0.98, 1.27 и 1.62 мг/100мг DW.

Някои автори съобщават за култивиране на мицели на G. lucidum чрез потапяне в неконвенционални субстрати, включително течни отпадни материали като фини стелажи и депротеинизирана суроватка. Hsieh et al. [52] продуцират полизахариди на G. lucidum чрез повторно използване на фини стелажи (от заводи, произвеждащи вино³) в култура, поставена в разклащащи колби. Чрез регулиране на pH до стойност 5, фин 60% стелаж е бил успешно използван за отглеждане на мицели на G. lucidum с най-висока клетъчна концентрация

(7.8 g/l) и полизахаридна продукция от 7.50 g/l. Добавянето на меласа е предизвикало най-висока скорост на растеж на мицелите и нарастване на клетъчната концентрация до 12.7 g/l. Добавянето на глюкоза е довело до нарастване на общата продукция на полизахаридите до 3.69g/l. Продукцията на полизахариди с молекулно тегло от 10 000 до 200 000 Da също е била три пъти по-висока отколкото при отглеждането само във фин стелаж.

Lee et al. [53,54] използват за култивиране на мицели на G. lucidum депротеинизирана суроватка от сирене в биореактор чрез потапяне. Тяхното заключение е, че култивирането на мицели от G. lucidum може да е рентабилно решение за алтернативна употреба на депротеинизираната суроватка на сиренето.

Главни фармакологично активни съединения в G. lucidum

Най-важните фармакологично активни съставки на гъбите Ganoderma са тритерпеноидите и полизахаридите (Фиг. 4).

Тритерпеноиди от гъбите Ganoderma

В Ganoderma spp.са открити над 150 тритерпеноиди каквито са ганодеровите (високо оксигенирани C₃₀ тритерпеноиди от ланостанов тип), луциденовите, ганодермовите ганодереновите, ганолуцидовите и апланоксидовите киселини, луцидоните, ганодералите и ганодеролите [5-64]. Репрезентативни примери са показани на фигурите 5-13.

Boh et al. [65] съобщават, че количеството на тритерпеноидите е различно в по-старите и по-младите части от плодните тела на G. applanatum. Най-голямо количество тритерпеноидни киселини са намерени в пънчетата (6.4мг в грам изсушено на въздух тегло), следвани от по-младия тъмен слой на гуглата (2.5мг/грам), по-стария слой (0.6мг/грам) и горната повърхност на плодното тяло (0.6мг/грам).

Тритерпеноидите имат многобройни фармакологични действия, които са в резюме следните:

Антихепатотоксично и хепатопротективно действие

Hirotani et al. [55] са изолирали успешно R и S ганодерови киселини от култивирани мицели и са доказали техния силен антихепатотоксичен ефект чрез галактозамин индуцирания цитотоксичен тест с първично култивирани хепатоцити от плъх. Kim et al. [66] съобщават за бета-глюкуронидаза инхибиторен и хепатопротективен ефект на G. lucidum.

Изолираните от мицели на Ganoderma ганодерови киселини Z, Y, X, W, V и T показват in vitro цитотоксична активност върху клетки от хепатома [67].

Фиг. 4. Основни фармакологични ефекти на G. lucidum.







Фиг. 5. Ганодермна киселина F (12p-acetoxy-3,7,11,15,23-pentaoxo-5a-lanost-8-en-26- oic acid).




Фиг. 6. Ганодермна киселина R ((24E)-3a,15a-diacetoxy-5a-lanosta-7,9(11),24-triene- 26-oic acid).


Фиг. 7. Ганодермна киселина A ((20E)-7p,15a-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5a-lanosta-8,20- dien-26-oic acid).

Lin et al. [68] съобщават, че тритерпеновата фракция от G. lucidum инхибира значително растежа на Huh7 клетките на човешката хепатома, което може би се дължи на индуциране на оксидативен стрес. Същият тритерпеноиден екстракт има много малко въздействие върху клетъчна линия от нормални чернодробни клетки.

Фиг. 9. Ганолуцидова киселина A (15a-hydroxy-3,11,23-trioxo-5a-lanost-8-en-26-oic acid)

Gao et al. [69] са изолирали от плодни тела на G. lucidum три нови тритерпен алдехиди от ланостантов тип, наречени луциалдехиди А-С. Луциалдехидите B и C показват цитотоксични ефекти върху белодробен карцином на Люис (LLC), T-47D, саркома 180, Meth-A туморни клетъчни линии. Луциалдехид С упражнява най-мощна цитотоксичност срещу тестваните клетъчни линии със стойности на ED50 респективно 10.7, 4.7, 7.1 и 3.8mg/l. Шест нови високо оксигенирани тритерпени от ланостанов тип, изолирани от спори на Ganoderma, също са показали директна цитотоксичност in vitro върху Meth-A и LLC туморни клетъчни линии [70]. Предполага се също, че фракцията WEES-G6, приготвена от мицели на G. lucidum и обогатена с тритерпен, инхибира растежа на човешки хепатомни Huh-7 клетки. Третиране с WEES-G6 предизвиква незабавно намаляване на активността на протеина, регулиращ клетъчния растеж (PKC) и активиране на JNK и p38 MAP киназите, което води до пролонгиране на клетъчната циклична фаза G2 и силно инхибиране на растежа на хепатомните клетки [71].

Алкохолният екстракт от G. lucidum също инхибира клетъчната пролиферация в зависимост от дозата и времето на въздействие, което може би става чрез възходяща регулация на p21/Waf1 и низходяща регулация на циклин D1. Нещо повече, той може директно да индуцира апоптоза в клетките MCF-7, което може би става чрез възходяща регулация на проапоптоичния Bax протеин, а не чрез имунната система (Hu et al., 1999a). Два алкохолни екстракта (I и III) от спори на G. lucidum инхибират силно растежа на клетките HeLa. Нещо повече, екстракт III е показал, че е способен да блокира клетъчния цикъл на преход от G1 в S фаза и да индуцира забележимо снижаване в нивото на вътреклетъчния калций. Тези резултати подсказват, че ефективният екстракт може да повлияе върху клетъчния цикъл и клетъчната сигнална трансдукция, променяйки калциевата транспортна система [72].

Yu et al. [73] съобщават за съществуването на корелация между интрацелуларните тритерпени от мицели на G. lucidum в различни стадии на растеж, култивирани чрез потапяне и инхибиращия ефект върху K562 туморни клетки. Резултатите показват, че интрацелуларните тритерпени се продуцират главно в по-късния период на ферментацията. Интрацелуларните тритерпени от различните стадии на ферментацията варират по отношение на типовете, количеството и относителната пропорция и оказват различен инхибиращ ефект върху туморните клетки. Оптималните културелни условия за продуциране на интрацелуларни тритерпени, инхибиращи клетките K562 е имало в разклащащите колби.

Резултатите на Liu et al. [74] показват, че тритерпеноидната фракция на G. lucidum може да бъде полезен ингредиент на третирането на доброкачествената хиперплазия на простатната жлеза. При кастрирани плъхове етаноловият екстракт на G. lucidum е показал инхибираща активност върху двата изозима (типове 1 и 2) на 5α-редуктазата и супресивен ефект върху вентралния простатен растеж, индуциран от тестостерон, но не и от дихидротестостерона. Активно ръководеното фракциониране и TLC анализът показват, че активните принципи in vivo са тритерпеноидите.

Резултатите на Mueller et al. [75] показват, че екстрактът от G. lucidum extract има сериозно действие срещу левкемия, лимфома и клетките на мултиплената миелома и може да стане нова допълнителна терапия при третирането на хематологичните малигнитети. Тези автори са скринирали екстракт от G. lucidum по отношение на неговото антипролиферативно действие, използвайки панел от 26 човешки ракови клетъчни линии.

Kimura et al. [76] съобщават, че противотуморните и противометастатични действия на тритерпеноидната фракция на G. lucidum, съдържаща ганодерова киселина F, се дължат на инхибирането на ангиогенезата, индуцирана от тумора. Тритерпеноидната фракция (100 и 200mg/kg) на плодните тела на G. lucidum инхибира растежа на първичния солиден тумор на далака, чернодробните метастази и вторичния метастатичен туморен растеж в черния дроб при интраспленален белодробен карцином на Люис (LLC), имплантиран на мишки. Освен това тритерпеноидната фракция (800 mmg/ml) инхибира в in vivo модел ангиогенезата, индуцирана от Matrigel (разтворим мембранен екстракт от тумора на Engelbreth-Holm-Swarm), допълнен с васкуларен ендотелен растежен фактор (VEGF) и хепарин.

Morigiwa et al. [57] откриват, че някои тритерпени на G. lucidum инхибират ангиотензин превръщащия ензим, а Kabir et al. [77] съобщават за диетичния ефект на G. lucidum върху кръвното налягане и нивата на липидите при плъхове със спонтанна хипертония.

Lin and Shiao [60] съобщават за инхибиращо действие на ганодеровата киселина Mf и ганодермната киселина T-O върху синтеза на холестерола.

Kohda et al. [78] са проучили биологично активните съставки на G. lucidum и са установили, че тритерпени като ганодермните киселини C и D инхибират освобождаването на хистамин.

Wang et al. [79,80] съобщават, че ганодермната киселина S упражняват амфипатичен ефект върху агрегирането на тромбоцитите. Тромбоцитите агрегират при високи концентрации на ганодермната киселина S, а при ниски концентрации агрегирането им се инхибира. Инхибирането зависи от концентрацията и времето на въздействие.

Su et al. [81,82] съобщават, че колаген индуцираното агрегиране на тромбоцитите от ганодермната киселина S се дължи на блокиране на Ca мобилизация по тромбоксан A2-зависимата пътека на отговора на човешките тромбоцити на колагена и че ганодермната киселина повишава простагландин E (1)-индуцирания цикличен AMP в човешките тромбоцити

Комплемент инхибиращ ефект

Min et al. [83] съобщават, че ганодериол F, ганодерманондиолът и ганодерманонтриолът от спорите на G. lucidum упражняват силно антикомплементарно въздействие, чрез което тези субстанции могат да повлияят върху хуморалната имунна система на човешката защита.

През 1997г. Kim et al. [12] съобщиха, че водноразтворимият екстракт от G. lucidum инхибира цитопатичния ефект на HIV-1, а Hattori et al. [13] съобщиха за инхибиращи ефекти на компоненти на G. lucidum върху растежа на човешкия имунодефицитен вирус (HIV) и на неговата протеазна активност. El-Mekkway et al. [14] проучиха anti-HIV-1 и anti-HIV-1 протеазни субстанции от G. lucidum. Ганодериол F и ганодерманонтриол са показали активност като анти-HIV-1 агенти в концентрация 7.8 мг/мл. Няколко други тритерпеноиди на Ganoderma са инхибирали умерено HIV-1 протеазната му активност в концентрации 0.17-0.23 mM. Подобни резултати с друг набор от тритерпеноиди на G. lucidum се съобщават от Min et al. [15]. Ганодеровата киселина β, ганодерманондиол, ганодерманонтриол, ганолуцидна киселина A и луцидомол B са показали силна анти-HIV-1 протеазна активност с IC₅₀ стойности от 20-90 mM.