Генотипиране на българското пастирско охранително куче

Н.с. д-р Андрей Мицулов, доц. д-р Атанаска Тенева, доц. д-р Тодор Маринков

Лесотехнически университет

Резюме
От край време в българското животновъдство за охрана на добитъка и имуществото на стопаните му се използват респектиращи със своя твърд характер и внушителен ръст пастирски охранителни кучета. Тяхният произход и до днес не е достатъчно изяснен. В последните двадесет години широко започна да се дискутира въпросът за разчленяване на отродието, обособявайки го главно в две отделни породи: Каракачанско куче и Българско овчарско куче. Морфометрично е доказано многообразието на екстериорните и конституционални форми сред него. За установяване на породностната му структура е извършен ДНК анализ с помощта на 10 микросателитни маркери. Подбрани са по специална методика експериментални обекти, които са продължители на генеалогично известни ползвателни линии. Данните дават основание да се счита, че кучетата от въпросната експериментална група структурно оформят порода, наименована като Българско овчарско куче.

В последните двадесет години широко започна да се дискутира въпросът за разчленяване на отродието, обособявайки го главно в две отделни породи: каракачанско куче и българско овчарско куче [ ]. Многократно извършваните морфометрични изследвания, недвусмислено доказаха многообразието на различни екстериорни и конституционални форми сред пастирско-охранителния контингент на българските кучета [ ].

Поредното доказателство за многообразието на пастирските охранителни кучета би могло да бъде резултатът от генотипирането им. Настоящето изследване си постави следните цели:

1. 
   Да се подберат най-представителните екземпляри ( пробанди) чрез Анализ на ползвателните качества
   
2. 
   Да се подберат екземпляри според Морфометричен анализ.
   
3. 
   Да се извърши Генеалогичен анализ на пробандите.
   
4. 
   Да се извърши Анализ на класното потомство
   
5. 
   Да извърши ДНК анализ, с помощта на микросателитни маркери.
   

В последните години селекционерите все повече използват молекулярната биология и ДНК маркерите за целите на селекцията. ДНК анализа е надежден метод за идентификация на животните и доказване на бащинство. Анализът на микросателитните локуси показва, че до настоящият момент са амплифицирани около 100 микросателити на автозомите при кучета, което дава възможност съвсем точно да се идентифицира произхода на всеки индивид. Следователно породността на кучетата може да бъде определена на молекулярно ниво на базата на малък брой микросателитни маркери.

Целта на настоящето изследване е идентификация на кучета от Каракачанската порода и валидиране на кита за генотипиране на базата на оценка на информационната стойност на 10 микросателитни маркера.

В настоящият експеримент беше използван StockMarks кита за кучета на Applied Biosystems, който амплифицира най-често използваните микросателитни маркери, от основните регистри на кучета, препоръчани от American Kennel Club.

Използвана е ABI Prism® системата с мултиплексна флуоресцентно-белязана технология за мултиплексен PCR анализ

Използването на PCR праймерите, белязани с 4 флуоресцентни бои, дава възможност да бъдат амплифицирани едновременно в една реакция на GeneAmp ® PCR система 9600 и анализирани на ABI Prism® 310.

В таблица 1 са дадени изследваните микросателитни локуси, размер и локализация на съответната хромозома.
Таблица 1 . Микросателитен маркер, описание на маркера и хромозомна локализация

Локус	Вид на микросателита	Големина в бази	Хромозомна локализация
PEZ01	tetra	92-136	-
PEZ03	tri	95–154	CFA13/19
PEZ05	tetra	97–121	CFA12
PEZ06	tetra	164–214	CFA16
PEZ08	tetra	222–260	S16
PEZ12	tetra	250–320	CFA3
PEZ20	tetra	170–201	Некартиран
FHC2010	tetra	210–260	S5
FHC2054	tetra	140–184	CFA12
FHC2079	tetra	263–299	S5

Експериментът протече на следните етапи:

• 
  вземане на проби от генетичен материал / косми, букална лигавица/;
  
• 
  изолиране на ДНК
  
• 
  амплифициране на микросателитните локуси;
  
• 
  фрагментен анализ
  

ДНК бе изолирана по протокол за изолиране на човешка ДНК.

Маркерите бяха амплифицирани в 10 µl реакция. Амплификационният праймер микс, съдържащ 10 праймерна мрежа беше приготвен по следния начин /табл.2/:
Таблица 2. Компоненти на мастер микса

Компоненти	Обем за 1 реакция в µl	Обем за мултиплексна реакция в µl
StockMarks PCR буфер	1.4	15.3
25 мМ МgCl 2	0.36	4.0
dNTP микс	2.2	24.2
AmpliTaq Gold DNA	0.36	4.0
Амплификационен праймер микс	2.8	30.8
Дейонизирана вода	1.9	20.8

Към така приготвеният микс се добави 1.0 µl матрична ДНК в концентрация от 10 ng /µl до 100 ng /µl.

Амплификацията се проведе при следните PCR условия на термосайкъл 9600 с Hot Start.

1. 
   Инициална стъпка – 1 цикъл на 95°С за 30 сек – х20 цикъла.
   
2. 
   Анилинг – на 58°С за 30 сек – х20 цикъла.
   
3. 
   Елонгация – на 58°С за 30 сек – х20 цикъла.
   

Последвалият фрагментен анализ на амплифицираната ДНК бе осъществен на ABI Prism 310 при следните процедури:

1. 
   Разреждане на всяка PCR амплификация с 20 µl дейонизирана вода.
   
2. 
   Смесване на 1.0 µl от разредените амплифицирани продукти с 11.5 µl Формамид и 0.5 µl GeneScan-350 ROX Size стандарт.
   

Таблица 3 Големина на алелите /в базови двойки/ в микросателитните локуси при изследваните кучета

Всички изследвани микросателитни локуса са полиморфни. Общият брой алели за всеки локус е следният:

• 
  PEZ01 – 5 алела;
  
• 
  PEZ03- 5 алела;
  
• 
  PEZ05 – 3 алела.
  
• 
  PEZ06- 5 алела;
  
• 
  PEZ08- 3 алела;
  
• 
  PEZ12 – 4 алела;
  
• 
  PEZ20 – 4 алела;
  
• 
  FHC2010 – 3 алела;
  
• 
  FHC2054 – 6 алела;
  
• 
  FHC2079 – 3 алела
  

ОБЕКТИ НА НАБЛЮДЕНИЕ И ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА МЕТОДИКА

В настоящето изследване възприехме обследването на екземпляри само от мъжки пол. Произходът им беше установен с подробни генеалогични данни най-малко с четири пълни /до осем непълни / родословни пояса, взети от Националната племенна книга на НК за Българско овчарско куче. Те са подбрани сред всеобщо признатите с ползвателните си качества достойни продължители на известни линии от прочути родоначалници. /Таблица 1/

Таблица 1

Генеалогична последователност на линията

Родоначалник на линията:....................................................................................................;

Селекционер, наблюдаващ линията: .................................................................................; адрес:................................................................; тел:................................................................;

Продължители на линията: Майка:

VІІІ-ми пояс: ...........................................................; ............................................................;

VІІ-ми пояс: ...........................................................; ...........................................................;

VІ-ти пояс: ............................................................. ; ...........................................................;

V-ти пояс: .............................................................. ; ..........................................................;

ІV-ти пояс: ............................................................ ; ........................................................;

ІІІ-ти пояс: .............................................................. ; ..........................................................;

ІІ-ри пояс: ............................................................... ; .........................................................;

І-ви пояс: ................................................................ ; .........................................................;

Пробанд : ....................................................

F1 – продължител: .................................................; майка на F1: ....................................;

F2 – продължител: ................................................ ; майка на F2: .................................... ;

F3 – продължител: ............................................... ; майка на F3: ..................................... ;

F4 – продължител: ..................................................

Изисквания към породните продуктивни качества

Екземплярите бяха изследвани за тяхните породни продуктивни качества посредством подробен анализ на ползвателните им качества, като доказана специализация на работата им /Таблица 2/ и тествани породни поведенчески показатели /Таблица 3/.

Таблица 2.

Ползвателни качества

1. Отношение към хищници: А - прогонва /дистанцира/; Б - търси и влиза в схватка; В - избягвя контакта

2. Отношение към домашни животни: А - пренебрежително индиферентно; Б - толерантно; В – охранително; Г – прогонва; Д – убива.

2.1. Към поверените му за охрана или на стопанина му:

• 
  Избирателно охранително отношение към видовете (овце, кози, коне, говеда, гъски, пуйки, други)
  
• 
  Специализирано охранително отношение само към определен вид - ................;
  
• 
  Комплесно охранително отношение: ...................................................................... ;
  
• 
  Индиферентно отношение към: ...............................................................................
  

2.2. Към чуждите домашни животни:

3. Отношение към кучета: А- резервирано, Б –недоверчиво; В – непредсказуемо; Г- толерантно; Д - пренебрежително индиферентно; Е –екипно; Ж- дистанциращо; З –агресивно.

3.1. Към кучетата от неговия работен екип: ..................................................................;

3.2. Към кучетата извън неговия екип: .......................................................................... ;

3. Отношение към хора: А- доверчиво подчинено; Б - изпълнително подчинено; В – резервирано; Г - недоверчиво; Д – толерантно; Е - пренебрежително индиферентно.

3.1. Към стопанина му:

3.2. Към членовете на семейството:

3.3. Към познати на стопанина:

3.4. В поверената му за охрана територия

3.5. Извън поверената му за охрана територия

3.6. Към чужди и непознати:

4. Начин на работа с повереното му стадо: А – подкарва; Б – задържа; В – маневрира; Г – вкарва; Д - охранява с поглед; Е – съпровожда; Ж - претърсва терена; З - търси изгубено животно; И - остава да охранява родилката и новороденото; Й – други действия......

4.1. По самоинициатива ................................................................................................:

4.2. По команда ............................................................................................................

5. Връзка със стопанина - оценка: (много добра- 3, слаба- 1, липсваща - 0)

5.1. Изпълнителност на команди: ( А - тест за отзоваване; Б – сядане; В - водене на повод);

5.2. Дисциплинираност (тест : А - показване на зъби; Б - оставане на място);

5.3. Своенравство: (наблюдения върху: А - опит за посягане; Б- предупредително ръмжене; В - нахвърляне).

Таблица 3.

Поведенчески качества

1. Преобладаващ тип поведенческа реакция:

1. 
   Активно отбранителна: А – дистанцираща; Б - предупреждение с ръмжене/лай; В - незабавна атака; Г – агресивна; Д – файтнес.
   
2. 
   Пасивно отбранителна: А- дистанциране; Б - отстъпване; В - избягвяне.
   

1.3. Хранителна

1.4. Полова

1.5. Смесен тип

6. 
   Непредсказуем тип
   

2. Преобладаващ тип висша нервна дейност /характеристика на нервните процеси/:

2.1. Уравновесеност: А –отлична; Б - добра; В – слаба.

2.2. Подвижност: А – отлична; Б – добра; В – слаба.

2.3. Сила: А- отлична; Б – добра; В – слаба.

2.4. Доминантност: А – възбуда; Б – задържане.

5. 
   Праг на дразнимост: А – нисък; Б – среден; В - висок.
   
2. 
   Степен на сетивна развитост (ниска, средна, висока)
   

3.1. Слух

3.2. Зрение

3.3. Обоняние

Класно потомство

Подбраните екземпляри са доказани с класното им потомство от не по-малко десет /10/ сибси и полусибси, произведени с различни партньорки. То притежава отличен общ екстериор, демонстрира ярък породен стил и характерност на линията към която принадлежи. В потомството манифестира във висша степен конституцията на родоначалника.

Морфометричен анализ

Морфометричен анализ на отродието на българското пастирско куче е извършван периодично и на различен брой екземпляри. По значими са през 1994 г на 23 кучета по около 30 морфометрични показатели, през 2006 г на 53 кучета по над 80 показатели. Данните за пробандите в последното изследване са в доверителния интервал на отклоненията от средните стойности на въпросните 80 морфометрични параметри. Изследването е докладвано на Научната конференция на ЛТУ през 2007 г стр.67 от Сборника.

РЕЗУЛТАТИ ОТ ГЕНОТИПИРАНЕТО

Генотипирането бе извършено посредством микросателитен анализ на проби, взети от епитела на устната кухина на подбраните пробанди. ДНК анализът бе извършен посредством 10 микросателитни маркери. Данните бяха обработени и честотата на алелите от 10-те изследвани локуса за Българското овчарско куче са представени в Таблица 4.

Таблица 4

Честота на алелите от 10 маркерни локуса за Българското овчарско куче

Генетичен маркер	Големина в бази	Алел А	Честота Алел А	Алел В	Честота Алел В	Алел С	Честота Алел С	Алел Д	Честота алел Д
PEZ 1	92-136	110	8	114	6	118	8	122	4
FHC 2054	140-184	150	14	154	3	154	3	162	4
FHC 2010	210-260	235	11	231	10	227	7
PEZ 5	97-121	102	9	106	8	110	4	114	4
PEZ 20	170-201	175	16	183	3	171	3	179	3
PEZ 12	250-320	269	13	277	3	289	2
PEZ 3	95-154	119	8	125	6	122	4	128	3
PEZ 6	164-214	172	8	184	4	188	6	180	4
PEZ 8	222-299	239	11	235	9	227	6
FHC 2079	263-299	273	14	289	5	269	5	281	2

Установена е генетичната структура на група кучета от породата Българско овчарско куче по 10 микросателитни локуса.

Данните за съответните пробанди продължители на известни линии са представени в Таблица 5.

Данни за пробандите – продължители на линии на Българското овчарско куче

Таблица 5

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Линия Водещ линията Пробанд Селекционер Начало на Коеф. Линията Хетер.
ГОРАН Д. Драганов Фаргус Горан Тодор Петров 1981 г 48

ШАБАН Д. Драганов Ханджар Тодор Петров 1970 г 50

РАЧО КОСТЕНЕЦА Л. Бояджиев Борко Д. Лозанов 1970 г 54

КАРАМАН ПЧЕЛИН Добревски Караман S Bg Ст. Добревски 1970 г 58

БЕЛОВСКИ МУРАД Л. Дамянов Караман Ш Л. Дамянов 1971 г 35

КАРАМАН КЬОР А. Петков Караман Авиюп А. Петков 1976 г 50

ТИТО КАВЛАК А. Петков Еро Авиюп А. Петков 1973 г 35

БОЖУР Д. Катев Дико Д. Катев 1965 г 58

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

ИЗВОДИ ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО

Установена е генетичната структура на една представителна част на българското пастирско охранително отродие от линиите, наблюдавани от Националния клуб за Българско овчарско куче.

Получените резултати от ДНК анализа показват, че използваният кит за генотипиране на Аплайд Биосистемс е валидиран и може да се прилага за идентификация, произход и доказване на бащинство на кучетата от тази порода.

Коефициентът на хетерозиготност е в границите от 35 до 58, което дава основание да се преценяват въпросните линии като селекционна основа за по- нататъшно усъвършенстване на породата.

Каталог: users -> files
files -> Списък на публикациите на ст н. с. І ст дтн инж. Оханес Сантурджян до края на 2010
files -> Автобиография професор Атанас Дерменджиев
files -> С п и с ъ к №1 на научните доклади и публикации на
files -> Иформация за публикациите (2000–2010 г.) На доц. Д-р алберт бенбасат монографии, учебници, студии и др
files -> Конкурс за редовен асистент по "Персийска литература и култура" в су "Св. Климент Охридски", където постъпва на работа в Центъра за източни езици и култури към Факултета по класически и нови филологии
files -> Богомил николов
files -> Биография На член кореспондент проф д-р Владимир Атанасов Овчаров Адрес: Катедра по анатомия и хистология, Медицински факултет, Медицински
files -> Сп и с ъ к на публикациите на проф дин Казимир Попконстантинов награди
files -> Книга за учителя на първа група в детската градина : Ч. 1 / Под ред на Елка Петрова. София : Нар просв., 1984 Ч. Надежда Витанова и др.; Под ред на Елка Петрова
files -> Д ф н донка петканова I. Книги Дамаскините в българската литература

Изтегляне 159.08 Kb.

Сподели с приятели: