Проект! Р е п у б л и к а б ъ л г а р и я министерство на здравеопазването

МИНИСТЕРСТВО НА ЗДРАВЕОПАЗВАНЕТО

№ …………

(2) Дейността по диагностика на вирусните инфекции от специалността вирусология се осъществява при спазване на стандарта по ал. 1 и се изпълнява от всички лечебни и здравни заведения и регионалните здравни инспекции, в които се осъществява дейност по вирусология.

1.1. Дефиниция, основни цели и задачи.

Медицинската специалност „Вирусология” е с преобладаваща клинико-диагностична насоченост, която осигурява необходимите познания и практически умения за изясняване на етиологията на заболяванията с вирусна генеза при хората чрез използването на количествени и качествени методи. Тя се занимава с комплексното проучване на голям брой патогенни агенти - вируси, с изразени характерни и строго специфични морфологични и генетични особености. Вирусите са способни само на вътреклетъчно размножаване, което основно ги отличава от останалите патогенни микроорганизми заедно с редица други характеристики.

В Република България специалността „Вирусология” е застъпена в извънболничната и в болничната помощ. Присъства в програмите за обучение в университетското образование. Представлява самостоятелна медицинска специалност в системата на здравеопазването на Република България и се придобива чрез следдипломна квалификация на завършилите висше медицинско образование и висше немeдицинско образование, специалност биология.

Основната цел на медицинския стандарт по „Вирусология” е да осигури качеството на диагностичната дейност на вирусологичните лаборатории, осъществяващи своята дейност на територията на Република България.
1.2. Дейности в обхвата на медицинската специалност.

Медицинският стандарт по „Вирусология” съдържа задачи, изисквания и показатели за дейности, свързани с определяне на етиологичната диагноза на вирусните инфекции при хората, проследяване хода на инфекциозния процес и ефекта от лечението на вирусните заболявания, както и оценка на ефективността на вирусните ваксини. Този стандарт регламентира основните изисквания, на които една вирусологична лаборатория трябва да отговаря за извършване на серологични и вирусологични изследвания. Той покрива изследванията, извършвани в нея, използвайки стандартизирани методи, методи, непокрити от стандартизираните, и методи, разработвани от лабораториите.

1.3.1. По време на диагностичния процес с оглед спецификата и сходството на клиничната симптоматика на заболяванията с вирусен и бактериален произход се осъществява връзка и координация със специалисти с придобита специалност „Микробиология”, работещи в микробиологични лаборатории, особено при необходимост от диференциална диагноза.

1.3.2. Дейностите по точка 1.3.1 могат да включват, без да се ограничават до обмен на биологични проби за продължаване на изследванията, консултации между специалисти и др.

1.3.3. При липса на специалисти по „Вирусология” в лечебни заведения, здравни заведения или в съответната регионална здравна инспекция (РЗИ) на територията на общината, част от дейностите по т. 4 могат да бъдат извършвани от медицински специалисти със придобита специалност „Микробиология”, в чиято програма за обучение е включено придобиването на знания и умения по специалността „Вирусология”. Дейностите по т. 4, които могат да бъдат извършвани от медицински специалисти със придобита специалност „Микробиология” са дефинирани във всяко ниво на компетентност.

1.3.4. При необходимост се осъществява връзка и със специалисти от специалностите: „Инфекциозни болести”, „Паразитология”, „Детски болести” и други, съобразно спецификата на заболяването с вирусен произход и необходимостта от допълнителна информация, свързана с пациента, чиято биологична проба се изследва.
1.4. Основни изисквания към дейността на вирусологичните лаборатории.

1.4.1. Този стандарт е приложим за всички вирусологични лаборатории независимо от обхвата и мащабите на дейността или от броя на персонала. Лабораториите, извършващи изследвания като нуклеотиден анализ или амплификация на част/цял вирусен геном следва да изпълняват изискванията на настоящия станадарт.

1.4.2. Този стандарт е предназначен за прилагане от лаборатории при разработването на техните системи по качество, така че да удовлетворява техните дейности. Той може да бъде използван от пациенти на лаборатории, контролни или акредитиращи органи, установяващи съответствието или регистриращи компетентност на лаборатории.

1.4.3. Персоналът на лабораторията носи отговорност за осъществяваните от нея дейности по начин, удовлетворяващ изискванията на този стандарт и нуждите на пациентите, както и законно упълномощените органи, извършващи акредитация.

1.4.4. Персоналът на лабораторията носи отговорност за осъществяваните дейности при работа с материали, отговарящи на изискванията за качествено извършване на изследванията.

1.4.5. Материалите, постъпващи за изследване в лабораторията, трябва да са съпроводени от медицински направления, съдържащи достатъчно информация, свързана с пациента и неговото заболяване.

1.4.6. Лабораторията създава, поддържа и съхранява необходими документи, свързани с нейната работа (лабораторни журнали, процедури и др.).

1.4.7. Лабораторията използва и съхранява правилно всички външни документи, свързани с нейната дейност (наредби, инструкции, стандарти, методи и др.).

1.4.8. Лабораторната документация се осъвременява в съответствие с настъпилите изменения в методите и оборудването на лабораторията.

1.4.9. Действащите и утвърдените документи трябва да са на разположение на определените работни места в лабораторията, доколкото са свързани с естеството на работа.

1.4.10. Остарелите и излезли от употреба документи, съхранявани в лабораторията, трябва да са подходящо обозначени и архивирани.

1.4.11. Резултатите от изследванията се изпращат на пациентите чрез подходящи за целта бланки.

1.4.12. Лабораториите от извънболничната помощ, лабораториите в структурата на регионалните здравни инспекции (РЗИ) и лабораториите от второ ниво на компетентност в рамките на лечебно заведение за болнична помощ изпращат получените материали на референтните лаборатории за допълнителни изследвания и /или за потвърждение на резултатите при всяка възникнала необходимост, като неясни и съмнителни резултати, възникване на епидемичен взрив с неясна етиология и вероятен вирусен причинител и др.

1.4.13. Лабораториите имат право на отказ от исканото лабораторно изследване при липса на данни от заявителя на изследването, данни за изследвания материал или данни за пациента, неправилна индикация за изследване и ако материалът за изследването е видимо замърсен или контаминиран, както и съхраняван и транспортиран в условия, които биха опорочили лабораторното изследване.

1.4.14. Пробите, предназначени за изследване, трябва да постъпват във вирусологичните лаборатории, не по-късно от 2 часа, от началото на транспортирането им, освен в случаите когото има основателна причина за удължаване на този срок.

2. Изисквания към персонала на лабораториите, извършващи специализирана дейност по този стандарт.

Персоналът на лабораторията трябва да има необходимите за дейността си квалификация, практически опит и умения в областта на вирусологията.

2.1. Ръководството се осъществява от лекар с придобита специалност „Вирусология”. В състава на лабораторията могат да бъдат включени лекари и специалисти с образователно-квалификационна степен магистър с професионална квалификация биолог. В лабораторията работят правоспособни медицински специалисти с квалификация „Медицински лаборант”.

2.2. Медицинският персонал трябва системно да повишава своята квалификация.

2.3. Началникът (ръководителят) на лабораторията планира нуждите от допълнителна квалификация.

2.4. Изборът на форми за обучение (външни, вътрешни) трябва да осигурява адекватна на извършваната дейност квалификация, която е подходящо документирана (сертификати, лични планове и др.).

2.5. Лабораторията трябва да има длъжностни характеристики за ръководителя и изпълнителския персонал.

2.6. Началникът (ръководителят) на лабораторията трябва да определи точно задълженията и отговорностите на персонала, както и взаимоотношенията между целия персонал.

3.1. Характеристика на вирусологичните лаборатории, извършващи специализирана дейност:

3.1.1. Вирусологичната лаборатория е медико-диагностична лаборатория в рамките на лечебно заведение за извънболнична или болнична помощ, здравно заведение, РЗИ или самостоятелна медико-диагностична лаборатория.

3.1.2. Лабораторията трябва да е ясно обозначена в организационната структурна схема на лечебното заведение и да са описани точно взаимоотношенията с останалите звена, като ясно са дефинирани дейностите, които извършва.

3.1.3. Лабораторията трябва да има кадрова и материална осигуреност за извършване на определен минимум серологични и вирусологични изследвания за нуждите на диагностичната, лечебно-профилактичната и други дейности на съответния вид лечебно заведение, здравно заведение или РЗИ.

3.1.4. Лабораторията трябва да използва постоянен персонал, като числеността му се определя от обема на извършваната дейност.

3.1.5. Лабораторията трябва да има процедура и апаратура или договор за обезвреждане на опасните отпадъци от своята дейност.
3.2. Изисквания към помещенията:

3.2.1 Лабораторията трябва да има помещения, които благоприятстват извършването на изследванията, за които е предназначена, и не влияят отрицателно върху изискваното качество на работа.

3.2.2. Броят на помещенията трябва да бъде съобразен с извършваните изследвания, така че да не се компрометира качеството на работата и безопасността на персонала.

3.2.3. При вирусологични изследвания, изискващи стерилни условия, трябва да има специално обособени за целта помещения/боксове.

3.2.4. Помещенията, свързани с качеството на извършваните изследвания, трябва да са разположени по начин, позволяващ контрол върху достъпа и до използването им.

3.2.5. В лабораторията трябва да има обособени работни места, като се вземат мерки за предотвратяване на възможните замърсявания.

3.3.1. Температурата в помещенията, свързани с качеството на извършваните изследвания, трябва да бъде в граници, които не влияят отрицателно върху персонала (стайна температура), както и да отговаря на изискваната от спецификациите на използваната апаратура.

3.3.2. Осветлението на обособените работни места трябва да благоприятства извършваните изследвания.

3.3.3. Въздухът в работните помещения по отношение на влажност, запрашеност, електромагнитни влияния трябва да благоприятства качеството на извършваните изследвания.

3.3.4. Електрическото захранване на използваната апаратура трябва да бъде осигурено по начин, който гарантира непрекъсваемост на диагностичните процедури (инкубация).

3.3.5. Повърхността на стените и на работните плотове трябва да бъде с покритие, позволяващо ефективно извършване на дезинфекция.

3.3.6. Трябва да се поддържа постоянен контрол върху достъпа до използваните помещения или места, влияещи върху качеството на работата.

3.3.7. Помещенията в лабораторията трябва да се поддържат в изряден вид и хигиена.

4.1. Изисквания към организация на дейността на вирусологична лаборатория от извънболничната помощ - самостоятелна медико-диагностична лаборатория или медико-диагностична лаборатория в рамките на лечебно заведение за извънболнична помощ.

4.1.1. Изисквания за медицинска апаратура, необходима за извършване на вирусологични и серологични изследвания.

4.1.1.1. Отчитащо устройство за имуноензимен тест (ELISA) или други автоматични анализатори.

4.1.1.2. Принтер.

4.1.1.3. Термостат.

4.1.1.4. Хладилник.

4.1.1.5. Центрофуга.

4.1.2. Изисквания към персонала на лабораторията.

4.1.2.1. Персонал с висше медицинско и биологично образование - от 1 до 2 лекари и биолози, като ръководителят на лабораторията трябва да е лекар с придобита специалност „Вирусология”.

4.1.2.2. Медицински лаборанти - от 2 до 4 души.

4.1.2.3. Помощен персонал – от 1 до 2 души.

4.1.3. Обем показатели за извършване на изследвания.

Изследване на кръвен серум или плазма по имуноензимен метод (ELISA) или други сходни методи (MEIA, ChLIA, ELFA):

4.1.3.1. Откриване на повърхностен антиген на хепатитeн В вирус (HBV) - HBsAg.

4.1.3.2. Откриване на anti-HBc IgM и HBeAg.

4.1.3.3. Откриване на антитела срещу HIV 1/2 или HIV Ag/Ab - бързи тестове и / или ELISA.

4.1.3.4. Откриване на маркeри на хепатитен С вирус (HCV) - anti-HCV или HCV Ag/Ab.

4.1.3.5. Откриване на маркeр на хепатитен А вирус (HАV) - anti-HAV IgM.

4.1.3.6. Откриване на маркери за рубеолна инфекция - anti-Rubella IgM, IgG.

4.1.3.7. Откриване на маркери за морбилна инфекция - anti-Measles IgM, IgG.

4.1.4. Изисквания към резултата от осъществяване на дейността.

Количествен показател за годишен обем на медицински дейности - минимален брой изследвания 500.

4.1.5. Дейността може да бъде извършвана и в микробиологична лаборатория при изпълнение на изискванията по т. 1.3 като обема и вида изследвания трябва да отговаря на посочените в т. 4.1.3.

4.2.1. Изисквания за медицинска апаратура, необходима за извършване на вирусологични и серологични изследвания.

4.2.1.1. Към изискванията по т. 4.1.1 се прибавят следните изисквания:

4.2.1.2. Сух стерилизатор.

4.2.1.4. Ламиниран бокс (боксово помещение).

4.2.2. Изисквания към персонала на лабораторията.

4.2.2.1. Персонал с висше медицинско и биологично образование - от 1 до 2 лекари и биолози, като ръководителят на лабораторията трябва да е лекар с придобита специалност „Вирусология”.

4.2.2.2. Медицински лаборанти - от 2 до 4 души.

4.2.2.3. Помощен персонал – от 1 до 2 души.

4.2.3. Обем показатели за извършване на изследвания.

4.2.3.1. Към изискванията по т. 4.1.3 се прибавят следните изисквания:

Изследване на кръвен серум или плазма по имуноензимен метод (ELISA) или други сходни методи (MEIA, ChLIA, ELFA и др.).

4.2.3.2. Маркери за хепатит В вирусна инфекция - anti-HBs.

4.2.3.3. Маркер за хепатит D вирусна инфекция - anti-HDV.

4.2.3.4. Маркери срещу цитомегаловирус (CMV) и Епщайн-Бар вирус (EBV).

4.2.3.5. Изследване на кръвен серум за откриване антитела срещу грипни вируси тип А и В -ELISA.

4.2.3.6. Изследване на фекална проба - определяне на ротавируси във фекална проба - имунохроматографски/ELISA.

4.2.3.7. Изследване на фекална проба - определяне на норовируси във фекална проба - имунохроматографски/ELISA.

4.2.3.8. Изследване на носоглътъчен смив за доказване на грипни вируси и вируси на остри респираторни заболявания (ОРЗ) с бързи имуносорбентни тестове.

4.2.4. При липса на кадри със специалност „Вирусология” дейността може да бъде извършвана и в микробиологична лаборатория при изпълнение на изискванията по т. 1.3 като обема и вида изследвания трябва да отговаря на посочените в т. 4.2.3.

4.2.5. Изисквания към резултата от осъществяване на дейността.

Количествен показател за годишен обем на медицински дейности - минимален брой изследвания 1000.

Референтната лаборатория, освен медико-диагностична дейност, извършва и експертна дейност.

4.3.1. Изисквания към дейността на лабораторията.

4.3.1.1. Организира и осъществява национална система за външна оценка на качеството на лабораторната диагностика в лаборатории по „Вирусология” в страната.

4.3.1.2. Потвърждава лабораторен резултат от биологичен материал, изпратен от други лаборатории.

4.3.1.3. Изследва материали при получени неясни, нови или съмнителни симптоми и/или резултати.

4.3.1.4. Осъществява качествени и количествени методи за определяне на вирусна нуклеинова киселина.

4.3.1.5. Извършва анализ за резистентност чрез молекулярно-генетични методи, когато е необходимо.

4.3.1.6. Извършва нуклеотиден анализ на вирусни геноми, когато е необходимо.

4.3.2. Изисквания към персонала на лабораторията.

4.3.2.1. Персонал с висше медицинско и биологично образование с придобита специалност „Вирусология” – от 2 до 4 лекари и биолози с образователно-квалификационна степен магистър, като ръководителят на лабораторията трябва да е хабилитирано лице.

4.3.2.2. Медицински лаборанти - от 2 до 4 души.

4.3.2.3. Помощен персонал - от 1 до 2 души.

4.3.3. Изисквания за медицинска апаратура за извършване на вирусологични и серологични изследвания.

4.3.3.1. Към изискванията по т. 4.2.1 се прибавят следните изисквания:

4.3.3.2. Инкубатор СО₂.

4.3.3.3. Ламинарен бокс клас 2.

4.3.3.4. Ултра центрофуга.

4.3.3.5. Ултразвуков дезинтегратор.

4.3.3.6. PH метър.

4.3.3.7. Вортекс миксер.

4.3.3.8. Компютърни конфигурации.

4.3.3.9. Електронна везна.

4.3.3.10. Инвертен микроскоп.

4.3.3.11. Флуоресцентен микроскоп.

4.3.3.12. Вани за вертикална и хоризонтална електрофореза.

4.3.3.13. Апаратура за провеждане на нуклеотидни анализи.

4.3.3.14. Апарат за поддържане на циклични температурни режими с цел амплификация на вирусни геноми.

4.3.3.15. Апаратура за секвениране на вирусни геноми.

4.3.4. Обем показатели и дейности за извършване на вирусологични и серологични изследвания - показатели за изследвания и дейности, свързани с референтна диагностика, консултантска, учебна и научна дейности.

4.3.4.1. Осигуряване на потвърдителна и референтна диагностика с интерпретация.

4.3.4.2. Вирусологични изследвания за изолиране на вируса-причинител и за доказване на вирусни антигени.

4.3.4.3. Вирусологично изследване на клетъчни култури за изолация и типизация на вирусите на полиомиелита и други ентеровируси.

4.3.4.4. Вирусологично изследване на кокоши ембриони за изолация и типизация на грипни вируси.

4.3.4.5. Вирусологично изследване на клетъчни култури за изолация и типизация на някои вируси на ОРЗ (аденовируси, парагрипни вируси, РС вируси).

4.3.4.6. Вирусологично изследване на клетъчни култури за изолация и типизация на херпес симплекс вирус тип 1 и тип 2.

4.3.4.7. Вирусологично изследване на новородени бели мишки за изолиране и типизиране на вируса на Кримско-хеморагична треска (КХТ).

4.3.4.8. Вирусологично изследване на новородени бели мишки за изолиране и типизиране на причинителя на Хеморагична треска с бъбречен синдром (ХТБС).

4.3.4.9. Вирусологично изследване на новородени бели мишки за изолиране и типизиране на причинителя на Лимфоцитарен хориоменингит (ЛХМ).

4.3.4.10. Вирусологично изследване на новородени бели мишки и клетъчни култури за изолиране и типизиране на причинителите на сезонни енцефалити: вирус Западен Нил/флави вируси/Синдбис/алфа вируси/, кърлежови енцефалити.

4.3.4.11. Изследване на кокоши ембриони и бели мишки за изолиране и индентифициране на причинителите на Ку-треска (C. Burnetii) и Марсилска треска, кърлежови петнисти трески (R. conorii и др.).

4.3.4.12. Изследване на кокоши ембриони и бели мишки за изолиране и индентифициране на C. psittaci.

4.3.4.13. Имунофлуоресцентна диагностика на носоглътъчни смивове за доказване на причинителя на грипни вируси тип А и В.

4.3.4.14. Имунофлуоресцентна диагностика на носоглътъчни смивове за доказване на някои респираторни вируси (адено-, парагрипни, РС и др.).

4.3.4.15. Имунофлуоресцентна диагностика на трупен материал за доказване причинителя на КХТ.

4.3.4.16. Имунофлуоресцентна диагностика на трупен материал за доказване на причинителя на ХТБС.

4.3.4.17. Серологични изследвания за доказване на вирусни антитела и антигени.

4.3.4.18. Вируснеутрализираща реакция за ентеровируси.

4.3.4.19. Вирус неутрализираща реакция за Коксаки вирус.

4.3.4.20. Изследване на ротавируси и норовируси във фекална проба - PCR.

4.3.4.21. Реакция за задръжка на хемаглутинацията (РЗХА) за индентификация на грипни вируси. Серологична диагностика на грипни вируси РЗХА/ELISA.

4.3.4.22. Имуноензимна реакция (ELISA) за доказване на маркери на хепатотропни вируси: HAV, HBV, HCV, HDV, HEV.

4.3.4.23. Имуноензимна реакция ELISA за вируси на ОРЗ (аденовируси, парагрипни вируси, РС вирус и др.).

4.3.4.24. Имуноензимна реакция (ELISA) за доказване на маркери на морбили, паротит и рубеола.

4.3.4.25. Серологична диагностика на вирусите Западен Нил, Синдбис, кърлежов енцефалит - ELISA, имунофлуоресцентно диагностика на вирусите.

4.3.4.26. Серологична диагностика на КХТ, ХТБС и ЛХМ - ELISA.

4.3.4.27. Определяне на имуноглобулиновия клас (IgG, IgM, IgA) на антитела срещу рикетсии.

4 3.4.28. Откриване на P 24 антиген на HIV/Anti - p 24 антитела срещу HIV.

4.3.4.29. Неамплифициращи методи: хибридизационни реакции за детекция на вирусни геноми.

4.3.4.30. Амплифициращи методи за детекция на вирусни геноми: верижна полимеразна реакция (PCR), и/ или multiplex PCR Real-timePCR, BranchDNA, TMA.

4.3.4.31. Електрофоретично разделяне на вирусни геноми.

4.3.4.32. Фрагментно-рестриктазен анализ за типизиране на вируси.

4.3.4.33. Секвенционен анализ на вирусни геноми.

4.3.4.34. Електрофоретично разделяне на вирусни антигени.

4.3.4.35. Имуноблот за вирусни антитела.

4.3.4.36. Определяне на генотипа/субгенотипа на вируси чрез хибридизация на специфични олигонуклеотидни проби с амплифициран вирусен геном (line probe assay).

4.3.5. Изисквания към резултата от осъществяване на дейността.

Количествен показател за годишен обем на медицински дейности - минимален брой изследвания 2 000.

4.4.1. Изисквания за медицинска апаратура, необходима за извършване на вирусологични и серологични изследвания.

4.4.1.1. Към изискванията по т. 4.1.1 се прибавят следните изисквания:

4.4.1.2. Сух стерилизатор.

4.4.1.3. Ламиниран бокс (боксово помещение).

4.4.2. Изисквания към персонала.

4.4.2.1. Персонал с висше медицинско и биологично образование - от 2 до 4 лекари и биолози, като ръководителят на лабораторията трябва да е лекар с придобита специалност „Вирусология”.

4.4.2.2. Медицински лаборанти - от 2 до 4 души.

4.4.2.3. Помощен персонал - от 1 до 2 души.

4.4.3. Обем показатели за извършване на изследвания.

4.4.3.1. Към изискванията по т. 4.1.3 се прибавят следните изисквания:

Изследване на кръвен серум или плазма по имуноензимен метод (ELISA) или други сходни методи (MEIA, ChLIA, ELFA и др.).

4.4.3.2. Маркери за хепатит В вирусна инфекция - anti-HBs.

4.4.3.3. Маркер за хепатит D вирусна инфекция - anti-HDV.

4.4.3.4. Маркери срещу цитомегаловирус (CMV) и Епщайнбар вирус (EBV) anti-CMV IgM/IgG, antiEBV-VCA IgM, anti EBV-NA IgM.

4.4.3.5. Изследване на кръвен серум за откриване антитела срещу грипни вируси тип А и В - ELISA.

4.4.3.6. Изследване на фекална проба - определяне на ротавируси във фекална проба - имунохроматографски/ELISA.

4.4.3.7. Изследване на фекална проба - определяне на норовируси във фекална проба - имунохроматографски/ELISA.

4.4.3.8. Изследване на носоглътъчен смив за доказване на грипни вируси и вируси на ОРЗ с бързи имуносорбентни тестове.

4.4.4. Изисквания към резултата от осъществяване на дейността.

Количествен показател за годишен обем на медицински дейности - минимален брой изследвания 1200.

4.4.5. При липса на кадри със специалност „Вирусология”, дейността може да бъде извършвана и в микробиологична лаборатория при изпълнение на изискванията в т. 1.3.

4.5.1. Изисквания към персонала.

4.5.1.2. Персонал с висше медицинско и биологично образование с придобита специалност „Вирусология” - от 2 до 4 лекари и биолози с образователно-квалификационна степен магистър, като ръководителят на лабораторията трябва да е лекар с придобита специалност „Вирусология”.

4.5.1.3. Медицински лаборанти - от 2 до 4 души.

4.5.1.4. Помощен персонал - от 2 до 3 души.

4.5.2. Изисквания за медицинска апаратура, необходима за извършване на вирусологични и серологични изследвания.

4.5.2.1. Към изискванията по т. 4.4.1 се прибавят следните изисквания:

4.5.2.2. Ламинарен бокс клас 2.

4.5.2.3. PH метър.

4.5.2.4. Вортекс миксер.

4.5.2.5. Компютърни конфигурации.

4.5.2.6. Електронна везна.

4.5.2.7. Флуоресцентен микроскоп.

4.5.2.8. Вани за вертикална и хоризонтална електрофореза.

4.5.2.9. Апарат за поддържане на циклични температурни режими за амплификация на вирусни геноми.

4.5.3. Обем показатели за извършване на изследвания.

4.5.3.1. Към изискванията по т. 4.4.3 се прибавят следните изисквания:

4.5.3.2. Имунофлуоресцентна диагностика на носоглътъчни смивове за доказване на причинителя на грипни вируси тип А и В.

4.5.3.3. Имунофлуоресцентна диагностика на носоглътъчни смивове за доказване на някои респираторни вируси (адено-, парагрипни, РС и др.).

4.5.3.4. Изследване на ротавируси и норовируси във фекална проба – ELISA, PCR.

4.5.3.5. Серологична диагностика на грипни вируси ELISA.

4.5.3.6. Имуноензимна реакция (ELISA) за вируси на ОРЗ (аденовируси, парагрипни вируси, РС вирус и др.).

4.5.3.7. Серологична диагностика на Q треска - ELISA.

4.5.3.8. Серологична диагностика на вирусите Западен Нил, Синдбис, кърлежов енцефалит - ELISA, имунофлуоресцентна диагностика на вирусите.

4.5.3.9. Серологична диагностика на КХТ, ХТБС и ЛХМ - ELISA.

4.5.3.10. Имуноензимна реакция (ELISA) за доказване на маркери на хепатотропни вируси: HAV, HBV, HCV, HDV, HEV.

4.5.3.11. Откриване на P 24 антиген на HIV/Anti - p 24 антитела срещу HIV.

4.5.3.12. Неамплифициращи методи: хибридизационни реакции за детекция на вирусни геноми.

4.5.3.13. Амплифициращи методи за детекция на вирусни геноми: верижна полимеразна реакция (PCR) и/или Real-timePCR.

4.5.3.14. Имуноблот за вирусни антитела.

4.5.4. Изисквания към резултата от осъществяване на дейността.

Количествен показател за годишен обем на медицински дейности - минимален брой изследвания 1500.

Необходимо е да се използват аналитичните принципи за осъществяване дейността на вирусологичните лаборатории, възприети от Националния комитет за клинични лабораторни стандарти (NCCLS, USA), Българското научно дружество по вирусология и подзаконовите нормативни актове.

4.6.1. Изследвания за изолиране и индентификация на вируса-причинител:

4.6.1.1. Вирусологични изследвания, свързани със заразяване на кокоши ембриони. Материали от болни (носоглътъчни смивове, трупни материали) се инокулират на кокоши ембриони с цел изолация на вируса-причинител.

4.6.1.2. Вирусологични изследвания, свързани със заразяване на клетъчни култури. Материали от пациенти (носоглътъчни смивове, трупни материали, везикуларна течност, ликвор, фекални проби и др.) се инокулират на биологичен модел - клетъчни култури, с цел изолация на вируса-причинител.

4.6.1.3. Вирусологични изследвания, свързани със заразяване на опитни животни. Материали от болни (кръвни проби, трупни материали и др.) се инокулират на биологичен модел - опитни животни, с цел изолация на вируса-причинител.

4.6.2. Изследвания за откриване на вирусни антигени и/или антитела срещу тях:

4.6.2.1. Реакция имунофлуоресценция (РИФ):

Конюгираните с флуоресцеин-изотиоцианат специфични антисеруми се свързват с хомоложните антигени в материали от болни, което прави виден комплекса антиген-антитяло с флуоресцентен микроскоп.

4.6.2.2. Реакция за задръжка на хемаглутинацията (РЗХА):

Основава се на свойството на вирусни антихемаглутинини да възпрепятстват специфичната хемаглутинация, причинена от изследваните вируси.

4.6.2.3. Вирус неутрализираща реакция (ВНР):

Методът се използва за идентификация на вирусен причинител, доказан в клинични проби или за доказване наличието на анти-вирусни неутрализиращи антитела в серумни проби. Основава се на свойството на специфични вируснеутрализиращи антитела от изследвани или референтни серуми да неутрализират индуциран от вируса (причинител или референтен щам) цитопатичен ефект на клетъчна култура

4.6.2.4. Реакция свързване на комплемента (РСК):

Основава се на свойството на антителата от серума да се свързват специфично с вирусните антигени в присъствие на комплемента и да възпрепятства хемолизата в хемолитичната система.

4.6.2.5. Имуноензимен метод (ELISA; EIA):

Методът има различни модификации и варианти. Основава се на специфичното свързване на търсените антигени и антитела имобилизирани на твърда фаза с последваща специфична имуноензимна реакция с конюгирани с ензим антитела или антигени. Цветната реакция след прибавянето на субстрата се отчита спектрофотометрично. Методът се използва за качествено доказване на вирусни антигени/антитела и за качествено и количествено определяне на вирусни антигени/антитела.

Конкурентният вариант на метода се базира на инхибиция на имуноензимната реакция вследствие на конкуренцията на търсените и конюгираните с ензим антитела за едно и също количество антиген.

Сходни методи са: микрочастици EIA-MEIA, имунохемилуминесценция - СhLIA, ензимносвързана флуоресценция - ELFA, електрохемилуминесценция - ECLIA и др.

4.6.2.6. Електрофоретично разделяне на вирусни антигени - идентифициране на вирусните антигени според молекулните им тегла на денатуриращи полиакриламидни гелове, визуализирани с комаси или сребърен нитрат.

4.6.2.7. Имуноблот - доказване на вирусни специфични антитела срещу отделни вирусни антигени. Принципът на метода е на основата на взаимодейвие на електрофоретично разделен вирус - специфични протеини, имобилизирани върху твърди носители с нерадиоактивно белязани вирусни поликлонални/моноклонални антитела. Специфичните антиген-антитяло комплекси се визуализират с ензимно-субстратна реакция.

4.6.3. Изследвания за доказване и идентифициране на вирусни генетични последователности:

4.6.3.1. Полиакриламидна гел-електрофореза:

Методът се използва за доказване на вируси със сегментиран геном. Основава се на разделянето на геномните сегменти в полиакриламиден гел под действие на електрично поле на база размера и молекулното им тегло. Техниката включва етапи на екстрахиране на вирусната нуклеинова киселина от клиничен материал, подлагането й на електрофореза при неденатуриращи условия и визуализиране (детекция) чрез оцветяване със сребърен нитрат.

4.6.3.2. Фрагментно-рестриктазен анализ за типизиране на вируси:

Методът типизира вирусни щамове въз основа на консервативни последователности от вирусния геном, които се разпознават от специфични екзонуклеазни ензими.

4.6.3.3. Полимеразна верижна реакция (PCR):

Техниката се използва за доказване и типова идентификация на вирусни геноми. За изходен материал се използва вирусна нуклеинова киселина, екстрахирана от биологични течности, тъкани и клетъчни популации. Реакцията се основава на ензимно експоненциално намножаване (амплифициране) на дефинирани консервативни нуклеотидни последователности от вирусния геном с помощта на специфични синтетични олигонуклеотиди. Отчитането на резултата е автоматизирано спектрофотометрично, изотермално или друго (при real-time технологията) или визуално на УВ-трансилюминатор или друго спрямо подходящ молекулен маркер при провеждане на агарозна гел-електрофореза и оцветяване на получения гел с етидиев бромид или други оцветители. Когато вирусният обект е PHK, съдържащ вирус, предварително се прилага ензимна обратно-транскриптазна реакция in vitro (RT) с използване на неспецифични или специфични синтетични олигонуклеотиди.

Техниката се прилага също за определяне на наличие (качествено) или концентрация (количествено) на вирусни геноми в биологични течности/тъкани, както и за проследяване на вирусното размножение - количествено или качествено (наличие, липса) и за оценка на ефекта при прилагане на антивирусни терапии.

Разновидности на реакцията по отношение начина на отчитане са хибридизационните техники (line probe assay, microarray и други). Тези разновидности се използват и за генотипова/субгенотипова идентификация.

4.6.3.4. Секвенционен анализ:

Методът се използва за доказване на вирусни геноми и за идентификация на вирусен щам/генотип/вариант. Техниката представлява автоматизирано определяне на линейната последователност от нуклеотидни бази, изграждащи вирусен геном или негов участък. За изходен материал се използва продукт на PCR-реакцията или клонирани в подходящ векторен плазмид вирусни гени. Основава се на формиране на маркирани с флуоресцентни багрила, радиоактивни изотопи и други различни по дължина фрагменти-копия на даден вирусен участък и разделяне на така формираните белязани олигонуклеотиди чрез електрофореза, при непрекъснато сканиране с лазерен лъч.

Методът дава възможност за пълно идентифициране на нуклеотидните последователности на вирусния геном и определяне на единични точкови мутации. Намира все по-широко приложение за определяне на резистентност при прилагане на антивирусни терапии. Съществуват различни методи за определяне на вирусните секвенции.

4.6.3.5. Определяне на генотипа/субгенотипа на вируси чрез хибридизация със специфични олигонуклеотидни проби (line probe assay). Амплифицирани чрез RT-PCR нуклеотидни последователности на изследвания вирус се хибридизират специфично с имобилизирани на нитроцелулозни стрипове, специфични за генотипа/субгенотипа на търсения вирус олигонуклеотидни проби. След прибавяне на специфичен ензимен конюгат и субстрат се отчита цветна реакцията върху използваните стрипове, като по този начин се определя генотипът/субгенотипът на изследвания вирус.