Селскостопанска академия

ЙОНИТА ЙОРДАНОВА ПЕРФАНОВА

ПРИЛОЖЕНИЕ НА АЗОТФИКСИРАЩИ И ДРУГИ ПОЧВЕНИ

МИКРООРГАНИЗМИ ПРИ ОТГЛЕЖДАНЕ НА НАХУТ

АВТОРЕФЕРАТ

на дисертация за присъждане на образователна и научна

степен „доктор”

научна специалност „Почвознание”

Доцент доктор Радка Алтимирска

София, 2011 г.

Дисертационният труд е написан на 111 страници включително 17 таблици, 14 фигури и 11 фото изображения. В списъка на използваната литература са включени 189 източника ( 32 на кирилица и 157 на латиница).

Дисертационният труд е обсъден и насочен за защита от разширен научен съвет към секция „Микробиология на почвата” при ИП „Н. Пушкаров”, София.

2
УВОД
В съвременните условия на земеделие при рязко повишени цени на минералните торове и намалени финансови възможности на селскостопанските производители, с особена актуалност стои въпросът за търсене на нови начини за запазване на почвеното плодородие и повишаване на добивите . Един успешен начин за постигане на тези цели е увеличаване дела на "биологичния" азот в растителната продукция чрез използване на бобовите култури. В симбиоза с бактериите от родовете Rhizobium и Bradyrhizobium те фиксират атмосферен азот и обогатяват почвата с 4 до 30 кг азот на декар в зависимост от вида на бобовата култура и условията за симбиотична азотфиксация.

Настъпилото през последните години глобално затопляне постави редица сериозни проблеми пред съвременната наука. В тази връзка по-детайлното изучаване на бобови култури, устойчиви към засушаване, е особено актуално и се налага от факта, че сушата е един от основните стресови фактори, оказващи неблагоприятно въздействие върху нормалното функциониране на симбиотичната система грудкови бактерии – бобово растение. Това може да бъде ограничено до голяма степен чрез използването в съвременните земеделски практики на алтернативни бобови култури , каквато е нахутът. В световното земеделие тази култура е трета по важност след фасула и граха. През последните години се завръща интересът на производителите към отглеждането на нахута и у нас. По данни на МЗХ за 2008 г. той заема второ място по площ от бобовите култури ( 17 670 da ) след зрелия фасул. Освен с високите хранителни качества на семената, богати с висококачествен белтък, мазнини, аминокиселини и витамини, нахутът се отличава с висока азотфиксираща способност, понижена взискателност към почвените условия и голяма сухоустойчивост. Това го прави особено ценна в техническо , екологическо и икономическо отношение култура.

У нас с нахута е работено предимно в селекционен аспект . Изследвания на симбиотичната система “нахут - бактерии от вида Bradyrhizobium sp.(cicer)” не са правени. Ефективността на тази система зависи от различни фактори. Един от тях е взаимодействието между грудковите бактерии и останалите почвени микроорганизми от естествените микробиоценози. На тези отношения, и по- специално на синергизма, се основава практиката на смесена инокулация на бобовите култури.

3

Много автори от различни страни съобщават за повишаване ефективността на симбиотичната система чрез използване на биоинокуланти с азотфиксиращи микроорганизми. От всичко казано дотук смятаме, че изследванията в този аспект са актуални и представляват голям научен и практически интерес.

За постигане на тази цел са разработени следните задачи:

1. Изолиране на симбиотични и несимбиотични азотфиксиращи бактерии и на актиномицети от почвата и ризосферата на нахут и други култури.

2. Изследване на взаимоотношенията между щамове Bradyrhizobium sp.(cicer) и други почвени микроорганизми с оглед използването им за съвместна инокулация.

3. Установяване на оптимални норми на минерално хранене за ефективна азотфиксация при нахут.

4. Установяване влиянието на самостоятелната и смесена инокулация на нахута върху количеството и качеството на добива и микробиологичната активност в ризосферата.

Предварителните агрохимични изследвания на алувиално – ливадната почва, с която са проведени съдовите и полските опити ( табл. 1 ) показват, че тя е с неутрална до слабо кисела реакция. Съдържанието на органично вещество ( от 0, 95 до 1,5% ) определя почвата като слабо хумусна. Съдържанието на общ азот и общ фосфор е ниско. По отношение на усвоимите форми изследваната почва е слабо запасена с подвижен азот и добре запасена с фосфор и калий.

Излужената смолница се характеризира с неутрална реакция. Почвата е добре запасена с органично вещество - съдържанието на хумус е от 4,9 до 5.3 % . По
4

съдържание на общ азот тя е средно, а на фосфор – слабо запасена. В съответствие с хумусното съдържание смолницата е добре запасена с усвоимите форми на азот и фосфор и има благоприятен калиев режим.

1. Израелска хибридна линия ( хл ) № 27

2. Сорт Балкан

Бактериални щамове и изолати

От грудките на нахут, отгледан на излужена смолница, Садово, са изолирани 30 бактериални култури. След идентификация на тези култури и изследване на взаимоотношенията им с другите микроорганизми е направен подбор и в съдовите и полски опити са изпитани щамовете №7 и №10 Bradyrhizobium sp. ( cicer ) и американския щам № 3352 от колекцията грудкови бактерии на секция „Микробиология на почвата”, ИП „Н. Пушкаров”

При смесената инокулация са използвани следните азотфиксиращи и други ризосферни микроорганизми:

- бразилския щам Azospirillum brasilense sp. 107 ( CATEC )

- от 25 щама Azotobacter chroococcum, изолирани от алувиално-ливадна почва от с.Цалапица, Пловдивско, са подбрани 14.

5

- от 140 актиномицетни изолата от ризосферата на бобови и житни култури, отгледани върху алувиално – ливадна почва от (с. Цалапица, Пловдивски окръг), излужена смолница ( с. Божурище, Софийско ), карбонатен чернозем ( опитно поле на ИЗС „Образцов чифлик” – Русе), излужена канелена почва ( с. Суходол, Софийско) и от геологични материали ( района на мини „Марица – Изток”) за изследванията са подбрани два изолата.

За характеристика на изолираните от грудките на нахута бактериални култури са проучени някои културални и физиологични свойства . Отчетен е растежът им на специфичните за тях диагностични среди. Изследвана е преживяемостта им в условията на различно рН на средата. Щамовете са култивирани в течна дрождено-манитна среда с различни стойности на рН ( от 4,0 до 6,0 ) при 28 ⁰ С в продължение на 10 дни. Измененията в техния растеж са определени чрез отчитане на оптическата плътност на суспензиите на спектрофотометър при дължина на вълната 480 nm.

Изследвани са взаимоотношенията между 10 щама Bradyrhizobium sp. ( cicer ) и 140 актиномицетни изолати. Грудковите бактерии, специфични за нахута, са култивирани 7 дни върху дрожден агар. Актиномицетните изолати са култивирани 5 дни върху твърда хранителна среда на Гаузе ( Гущеров, 1970 ). След посявката на изследваните щамове Bradyrhizobium sp. ( cicer ) върху петри с дрожден агар са пренесени дискове с предварително култивираните актиномицети.След инкубация от 7 дни при 28 ⁰С са измерени зоните на стимулация , респективно инхибиция ( в mm ), образувани вследствие дейността на актиномицетите. Диаметърът на агаровия диск е 10 mm.

От ризосферата на нахут, отгледан в условията на полски опит в опитна база Цалапица са изолирани щамове Azotobacter chroococcum за изследване взаимоотношенията им с щамове Bradyrhizobium sp. ( cicer ) . Грудковите бактерии ( 3 щама ) са култивирани върху дрожден агар за 7 дни. 25 щама Azotobacter chroococcum са култивирани за 6 дни върху хранителна среда на Ешби. Изследванията са извършени, както при опит ІІ.

6

Съдови опити

І опит

С цел установяване на оптимален фон за развитието на нахута при двете почви са изпитани три нарастващи дози азот ( 35, 70 и 140 mg.kg ^-1 почва ), три дози фосфор

( 80, 160 и 240 mg.kg ^-1 почва ) и съотношенията между тях. Опитът е изведен по следната схема:

1. 
   Контрола, неинокулирана 8. P2КN₁
   
2. 
   Контрола, инокулирана 9. P2КN₂
   
3. 
   Р1К 10. P2КN₃
   
4. 
   Р1КN₁ 11. P3К
   
5. 
   Р1КN₂ 12. P3КN₁
   
6. 
   Р1КN₃ 13. P3КN₂
   
7. 
   Р2К 14. P3КN₃
   

Фосфорът е внесен като KH₂PO₄, а азотът – като NH₄NO₃. Използвани са съдове с вместимост 1,200 kg въздушно суха почва за алувиално – ливадната почва и 1,000 kg за излужената смолница в четири повторения. Семената на нахута са инокулирани със суспензия от седемдневна култура от американския щам №3352 с титър 10⁸ клетки на ml. Влажността на почвата е поддържана на 60% от ППВ.

Във фаза зрялост са отчетени надземната маса и добива от зърно .
ІІ опит

На предварително установения за двете изследвани почви фон ( NРК) е проучен ефектът от самостоятелната и смесена инокулация на нахут с щамове Bradyrhizobium sp.( cicer ) , Azospirillum brasilense sp. 107 и актиномицетни изолати.

Във съдове с вместимост 1,200 kg въздушно суха почва за алувиално – ливадната почва и 1,000 kg излужена смолница са отгледани по две растения нахут, хибридна линия № 27, в четири повторения. Опитът е изведен по следната схема и за двете почви:

1.контрола – неторена, неинокулирана 6. щам № 10

2. фон ( NРК) 7. щам №10 + A. brasilensе

3. щам №7 8. щам №10 + act.№22

4. щам №7 + A. brasilense 9. щам № 3352

5. щам №7 + act.№28 10. щам № 3352 + A. brasilensе 7

В двете почви са внесени 70 mg.kg ^-1 азот и 160 mg.kg ^-1 фосфор, съответно като NH₄NO₃ и KH₂PO₄. Влажността на почвата е поддържана на 60% от ППВ. Изпитани са щамовете №№ 7 и 10 Bradyrhizobium sp.( cicer ), изолирани от нахут,отгледан на излужена смолница, Садово, американския щам №3352, щам Azospirillum brasilense sp. 107 и актиномицетните изолати №№ 28 и 22, показали най-добър синергичен ефект при изследванията in vitro. Самостоятелната инокулация на семената е извършена със суспензия от изследваните щамове с титър 10⁸ cells . cm^-3, а смесената - с еднакво количество от всички щамове и актиномицетни изолати. Влажността на почвата през вегетацията на растенията е поддържана на 60% от ППВ.

Във фаза цъфтеж – начало на образуване на бобове са отчетени количеството на образуваните грудки и основните физиологични групи микроорганизми в ризосферата на нахута. Отчетен е полученият добив от зърно. Определени са някои структурни елементи на добива и съдържанието на протеин в зърното.

За изследване на ефекта от инокулацията на нахут, сорт Балкан, с два щама Bradyrhizobium sp.(cicer) и Azospirillum brasilense sp. 107 върху добива и нитрогеназната активност е проведен съдов опит с излужена смолница от Божурище, Софийско.

В съдове с вместимост 1 kg въздушно суха почва са отгледани по две растения в четири повторения. Като фон в почвата са внесени 70 mg.kg ^-1 азот и 160 mg.kg ^-1 фосфор, съответно като NH₄NO₃ и KH₂PO₄ .Влажността на почвата е поддържана на 60% от ППВ. Изпитани са щамовете Bradyrhizobium sp.(cicer) - № 7, изолиран от излужена смолница, Садово и американския щам №3352, както и щам Azospirillum brasilense sp. 107. Инокулацията на семената е извършена с бактериална суспензия с титър 10⁸ . Извършен е биохимичен анализ на интактни грудки за определяне на нитрогеназната им активност. Опитът е проведен по следната схема:
1.контрола – неторена, неинокулирана;

2. щам №7; 3. щам №7 + A. brasilense sp. 107;

4. щам № 3352; 5.щам № 3352 + A. brasilense sp. 107 .
8

Полски опит
През периода 2007 – 2009 г. в опитната база на ИП „Н. Пушкаров” в с. Цалапица, Пловдивско, при неполивни условия е заложен опит за проучване влиянието на самостоятелната и смесената инокулация на нахута с 3 щама Bradyrhizobium sp. (cicer) и щам A. brasilense sp. 107 върху добива и микробиологичната активност в ризосферата на растенията. По време на вегетацията на нахута през 2008 г. се появи кореново гниене, което компрометира добива и затова представяме данни от две години. Използван е методът на Рюмкер в четири повторения и големина на реколтната парцелка 25,6 m² . С основната обработка на почвата са внесени като фон 15 kg.da^-1 комбиниран тор ( NPK).

Опитът е проведен по следната схема:

1. контрола; 2. щам №7; 3. щам №7 + A. brasilense sp. 107;

4. щам №10; 5. щам №10 + A. brasilense sp. 107;

6. щам № 3352; 7. щам №3352 + A. brasilense sp. 107.

Семената на нахута, хибридна линия № 27, са инокулирани със суспензия (титър 10⁸) от седемдневни култури на изследваните щамове Bradyrhizobium sp. ( cicer ) и А. brasilense sp. 107. Сеитбата е извършена ръчно и непосредствено след нея почвата е валирана.

Във фаза цъфтеж – начало на образуване на бобове са определени броят на образуваните грудки и са извършени микробиологични анализи на почвата от ризосферата. Отчетен е получения добив и е определено съдържанието на суров протеин в зърното. Определени са някои структурни елементи на добива от нахут – височина на растенията, брой и тегло на чушките и семената от едно растение и теглото на 1000 семена.
Методи

Микробиологични

1. Метод на аналитичната селекция за изолация и идентификация на бактериалните култури ( Методы иссл. кл. бакт.,1981; Vincent, 1970; Somasegaran and Hoben, 1994).

2. Метод на агаровите дискове ( Гущеров и др. 1970).

3. Метод на 10 –кратните разреждания за отчитане количеството на основните физиологични групи почвени микроорганизми върху общоприетите хранителни среди:

9

месопептонен агар ( МПА ) за отчитане броя на бактериите, използващи органичен азот; скорбяло-амонячен агар (САА)- за бактериите, използващи минерален азот и за актиномицетите; среда на Хътчинсон – за целулозоразлагащи микроорганизми; среда на Чапек – за микроскопичните гъби, среда на Ешби – за азотобактер, дрождено манитен агар за Bradyrhizobium sp. ( cicer), среда на Гаузе – за актиномицети.

( Методы общей бактериологии, 1984 )

1. Метод на ацетиленовата редукция за определяне на нитрогеназната активност на щамовете Bradyrhizobium sp. ( Hardy et al., 1973 ) с модификация за анализ на интактни грудки (Методика оценки симб. азотфиксации, 1984)

Използван е газхроматограф “ Perkin Elmer 3920 B” с пламъчно – йонизационен детектор и колона, запълнена с Al₂O₃ .Като газ-носител е използван азот със скорост

на потока 60 ml/min. Анализите се проведоха при температура на детектора 140 ⁰С и на колонката – 55 ⁰С . За построяване на калибровъчната крива е използван чист етилен.

В херметически затворени, стъклени флакони с обем 130 cm³ се поставят отрязани корени с грудки от съответните варианти. Във флаконите се вкарват 10% ацетилен за 2 часа, след което един ml от газовата смес се анализира на газхроматографа. Нитрогеназната активност е изразена в nM етилен на растение за час, преизчислена на µg азот на растение за час .

Химични

Основните химични и агрохимични показатели на изследваните почви са определени по следните методи:

- Механичен състав по класификация на международната почвоведска асоциация и фракция < 0,01 мм по Н. А. Качинский (1958 )

- Хумус – по Тюрин (Аринушкина, 1962 )

- Хидролизуем азот – по Бремнер ( 1965 )

- Подвижни форми на фосфор и калий – по Иванов (1984)

- рН – потенциометрично

Статистически

Получените експериментални данни са обработени статистически чрез SPSS.

10

РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ
Културални и физиологични свойства на щамовете , изолирани

от грудките на нахут

Използването на азотфиксиращите бактерии в земеделието за повишаване на добивите и подобряване качеството на растителната продукция изисква системна работа за селекциониране на ефективни щамове, които да станат основа за получаване на бактериални препарати. В тази връзка са направени и изолациите от грудките на нахут, отгледан на излужена смолница, Садово. Изолатите са определени по някои морфологични, културални и физиологични характеристики.

* + + + - много добро развитие; + + - добро развитие; + - слабо развитие;

- - няма развитие 11

Културалните свойства на изолираните бактериални изолати са представени на таблица 2. От приведените данни се вижда, че всички щамове се развиват на ДМА и не се развиват на месопептонен агар ( МПА ) – един от най-характерните признаци на грудковите бактерии. Изключение правят изолатите от хл №27 - №№ 3, 4, 8, 9 и 13 и тези от сорт 17 - №№ 18, 19, 22, 27 и 30, които се развиват на МПА . Това е показател, че те не принадлежат към Bradyrhizobium. Останалите 20 изолата принадлежат към Bradyrhizobium sp.( cicer ). От тях най-добро развитие имат щамовете 7 и 10 , а осем щама ( №№ 5, 6, 12, 14, 17, 20, 23 и 28 ) показват добър растеж.