Справка за научните приноси

на н.с. I ст. д-р Антоанета Борисова Трендафилова-Савкова

Представените трудове са основна част от проблематиката на лаборатория ”Химия на природните вещества” в ИОХЦФ-БАН и са главно с фундаментално значение за химията на сескитерпеновите лактони и химията на природните вещества. Научните приноси на представените трудове са резултат от:

• 
  фитохимични изследвания на растителни видове от български произход известни като лечебни растения или неизследвани досега таксони с цел намиране на хемотаксономични връзки между тях, както и търсене на нови биологично активни вещества.
  
• 
  получаване на етрични масла от ароматични и лечебни растения, газ-хроматографски и мас-спектрален анализ на етерични масла с оглед идентифициране на основните компоненти, съдържащи се в тях и търсене на хемотаксономични зависимости
  
• 
  използването съвременни техники за екстракция на биологично активни вещества от лечебни растения
  
• 
  синтезиране на вещества наподобяващи природни вещества с потенциална биологична активност.
  

Тези изследвания са свързани с изолиране и структурно определяне на сескитерпенови лактони и съпътстващи ги терпеноиди и флавноиди в растения от сем. Astеrarceae, едно от най-големите ботанически семейства. С помощта на съвременни хроматографски техники са изолирани над 150 индивидуални съединения, от които 48 са новооткрити природни съединения, чиято структура и относителна стереохимия е установена чрез спектрални методи (ЯМР, МС, ИЧ и УВ).

Представителите на род Artemisia са обект на многобройни изследвания в световен мащаб, но слабо проучени в България. От A. pedemontana са изолирани 5 гуайанолида и един 1,10-секо-гуайанолид, като два от тях са нови за вида, а един –нов за род Artemisia (публ. № 8).

От надземните части на високопланинската A. chamamelifolia са изолирани 6 сескитерпенови киселини със силфиперфоланов скелет, две от които са нови природни съединения. Тяхната структура е еднозначно определена чрез превръщането им съответните метилови естери. Получените резултати ясно показват тясна връзка между българската популация и две испански популации, тъй като всички продуцират един и същ скелетен тип съединения. Това заключение е важно от хемотаксономична гледна точка, тъй като силфиперфоланови съединения не са намирани в други видове от род Artemisia (публ. № 13).

1.2. Изследване на Anthemis austriaca.

В надземните части на A. austriaca са намерени 3 нови 3-оксо-гуайанолида, два нови димерни сескитерпенови лактона и 3 нови сескитерпенови киселини от гуайанов тип, заедно с още седем познати терпеноида. Изолираните съединения - производни на ксерантолид и печуелова киселина не са намирани досега в други видове Anthemis и могат да служат като хемотаксономични маркери. Димерните лактони се регистрират за първи път в представител на род Anthemis (публ. № 14).

От българския ендемит C. moesiaca са изолирани и идентифицирани 21 съединения - 11 сескитерпенови лактона, 9 флавоноида и 1 лигнан. Установено е, че основни компоненти на растението са гермакранолидите – кницин и 4’-ацетилкницин. Последните са характерни за видовете от секция Acrolophus, а не за секция Lepteranthus, към която принадлежи вида. От друга страна, намерените полихидрокси- и полиметоксипроизводни на 6-метоксифлавони и 6-метоксифлавоноли са в съответствие с тези намирани досега в секция Lepteranthus. Лигнанът трахелогенин е намерен за първи път в род Centaurea (публ. № 19).

Белият равнец е едно от най-разпростарнените растения у нас и е известно от дълбока древност с лечебните си свойства. Той е съвкупност от 8 вида, образуващи така наречената група A. millefolium. Изследвано е съдържанието на сескитерпенови лактони в 3 вида бял равнец от български произход – A. collina, A. asplenifolia и A. distans. Изолирани и идентифицирани са повече от 115 индивидуални съединения, от които 38 са нови природни вещества от гуайанов, гермакранов, глауколиден и бизаболанов тип. С помощта на спектрални методи е установена структурата на 3 нови димерни сескитерпенови лактона, откривани за първи път в представители на род Achillea, както и на бизаболанови сескитерпеноди, намерени за първи път във видове от група A. millefolium.

Сравнителното изследване на шест проби от различни находища на A. collina показа значителна вътревидова изменчивост и съществуването на хемотипове. Анализираните проби се различават същественно в съдържанието на сескитерпенови лактони: в една от пробите те отсъстват, други две – продуцират гермакранолиди и ейдесманолиди, докато в останалите три проби се съдържат главно гуайанолиди. Последните също могат да се разделят на проби с липса на проазуленови гуайнолиди или съдържащи много малки количества от тях и такива, богати на проазуленови лактони. Получените резултати отличават бълграската A. collina от тези растящи в Централна Европа, продуциращи единствено проазуленови лактони. Предположено е, че тези различия могат да се дължат на регионалната диференциация и/или на хибридизация между A. collina с други видове Achillea, като A. clypeolata и A. setacea (публ. № 16, 17 и 18).

В наскоро открития в България вид A. asplenifolia е установено наличие на гуайанолиди, гермакранолиди и глауколиди. Проазуленовите сескитерпенови лактони с ангелокси заместител при С-8 са преобладаващи в изследваната проба. Гермакранолидите не са обичайни за представителите на група A. millefolium, а глауколидите се намират за първи път в род Achillea (публ. № 15 и 17).

Резултатите от изследването на A. distans показват, че този вид не съдържа проазуленови сескитерпенови лактони. Изолираните лактони са с гермакранов и гуайанов въглероден скелет. Най-значителна е групата на 1,4-α-ендоперокси-гуайанолидите, сред които доминират тези с С-11 екзометиленова група. Струва си да се отбележи, че този тип съединения са намирани само в още един вид от група A. millefolium, а именно в A. millefolium. Наред с различията в скелетния тип, ацилните заместители в структурата на сескитерпеновите лактони също биха могли да бъдат от хемотаксономичен интерес. Важна отличителна характеристика за изследвания вид е наличието на ацетокси, изовалерилокси, 2-метилбутаноилокси заместители, но не и на ангелокси (публ. № 17 и 21).

Известно е, че белия равнец е билка с ясно изразена противовъзпалителна активност, дължаща се на съдържащите се в нея проазуленови сескитерпенови лактони. Екстракти, фракции и индивидуални съединения от гореспоменатите видове са подоложени на тест за противовъзпалителна активност. Установено е, че седем от изследваните проби притежават близка или по-висока активност от тази на индометацин. Установено е също, че ейдесманолиди и гермакранолиди също са активни и допринасят за високата активност на тоталните екстракти и суровите лактонни фракции на изследваните видове (публ. № 18 и 22).

1.4.2. Флавоноиди във видове Achillea.

Изследван е и флавонидният състав в цветове на A. collina, A. asplenifolia и A. distans. Полиметоксифлавоноидите се явяват като характерни за цветовете на A. collina и A. asplenifolia, за разлика от цветовете на A. distans, в които преобладават С-6 незаместените флавониди. От изолираните и идентифицирани общо 12 флавонида, кверцетагенин 6,7,3’,4’-тетраметил етер, акацетин, диосметин и хризоериол се намират за първи път в представители на група A. millefolium (публ. № 20).

Възможностите за развитие в групата на студените чайове у нас са много големи, тъй като страната ни е богата на етерично-маслени растения, билки и горки плодове, които са познати на хората и се използват в народната медицина от векове. Това е един неизчерпаем източник за разработване на напитки с добавени здравни ползи и натурален произход. Извлеци от редица билки като маточина, мурсалски чай, мента, босилек, жълт кантарион, бъз, липа, бял равнец, шипка, лайка и др. могат успешно да се използват при създаването на нови асортименти.

Изследван е и етерично-масления състав на Salvia officinalis, култивирана в монголската пустиня Гоби (публ. № 26). Установено е съдържанието на 23 компонента. Маслото се характеризира с високо съдържание на монотерпеноиди (59.3%). α- Туйон, камфор, α-хумулен, видифлорол, маноол и 1,8-цинеол са намерени в количества над 6%. Получените резултати са сравнени с тези от анализ на етерични масла от Salvia officinalis с различен географски произход. Наблюдавано е сходство в химичния състав на основните компоненти и незначителна разлика в количествения състав с някои от тях.

За първи път е изследван етерично-масления състав на Achillea clusiana (публ. № 27). Видът, описан във Флора на Европа с няколко синонимни имена и с все още неясна ботаническа класификация, се среща във високите планински части на Балканския полуостров и Източни Алпи. 54 компонента в количества над 0.1% са регистрирани, съставляващи 92.5% от изследваното масло. Установено е високо съдържание на кислород-съдържащи моно- и сескитерпеноиди (общо 78.9%). α- и β-Туйони, 1,8-цинеол и камфор са основните монотерпеноиди, а фарнезол, неролидол и негови производни (кабруева оксиди А-Д, изохумбертиолите А-Д, бежарол и 7-хидрокси-6,7-дихидро-5,6Е-дехидронеролидол) са доминиращи в групата на сескитерпеноидите. Камфановият тип съединения (като камфор, борнеол, борнл ацетат и др.) и 1,8-цинеол са най-често срещаните монотерпеноиди в етерични масла на видове Achillea, докато туайановия тип съединения са доста по-рядко наблюдавани. Гореспоменатите неролидоловите поризводни също не са типични както за етерични масла от видове Achillea, така и за масла от други видове в сем. Asteraceae. Тези съединения биха могли да се разглеждат като продукти от оксидативна ензимна редукция и/или окисление на неролидол през 5-хидроксинеролидол. Получените данни са сравнени с тези за видовете принадлежащи към секция Anthemoideae, към която принадлежи изследвания вид. Наблюдавните прилики и разлики в химичния състав са недостатъчни за сериозни хемотаксономични заключения.
3. Сравняване на различни техники за екстракция на биологично активни вещества от лечебни растения

Известно е, че екстракцията на природни продукти е важна не само като ключов етап в извличането им от растителни суровини, но също и за качествен контрол на продуктите. Нарастващият интерес към растителните вторични метаболити се съпътства и от необходимостта от разширяване и модифициране на начините за екстракцията им от природни източници. Във връзка с това и като част от проект финансиран от НФНИ, са сравнeни различни техники за екстракция (мацерация, ултразвукова и микровълнова) на биологично активни съединения от две 2 лечебни растения бял равнец (Achillea millefolium Proa) и цариче (Alchemilla mollis). Изследвано е влиянието на разтворителя и условията (време, температура и др.) върху ултразвуковата и микровълновата екстракции с цел оптимизиране на екстракционния процес. Установено е, че количеството на тоталния екстракт и тоталното фенолно съдържание в A. millefolium Proa нарастват с повишаване полярността на разтворителя, докато количеството на флавонидите е максимално при екстракция с метанол, а това на сескитерпеновите лактони е почти еднакво във всички използвани разтворители. Ултразвукова екстракция за 60 мин и микровълнова екстаркция за 60 сек води до по-високо или почти еднакво съдържание на тотален екстракт, тотални феноли и флавоноди в сравнение с традиционната екстракция при стайна температура за 24 ч. Най-високо съдържание на сескитерпенови лактони е постигнато в хлороформ при 20 минутна ултразвукова екстракция и 20 секундно микровълново ирадиране (публ. № 23).

При сравняване на различните екстракционни техники за извличане на биологично активни вещества от листа на Alchemilla mollis е намерено, че тоталният екстракт и количеството на тотални феноли и флавоноиди получени в условията на 30 минутна ултразвукава екстракция и на 20 сек. микровълново ирадиране са по-високи или равни на тези получени при мацерация за 24 ч. Тяхното количество зависи от полярността на разтворителя и нараства в реда МеОН, 70%EtOH, H₂O и 70% ацетон (публ. № 24).

Получените резултати са обещаващи, защото използваните съвременни водят до намаляване на разходите за извличане на целевите продукти от растителни обекти: съкращаване на времето за екстракция, редуциране на количеството на използвания разтворител, понижаване на разходите на електроенергия и др.

Изследвано е взаимодействието на 3-заместени кумарини (2-оксо-2H-1-бензопирани) с фенацилбромид в условията на реакцията на Видман. С оглед подобряване на добивите на циклопропановите съединения и оптимизиране на реакционните условия са използвани различни бази и разтворители, както и двуфазни системи в присъствие и отсъствие на преходен агент, служещ като катализатор. Установено е, че най-добри резултати се получават в присъствие на катализатор (Aliquat 336 или TPBP) в двуфазни системи. Установено е също, че стереоселективоността на реакцията зависи от стерични фактори и от природата на ацилните заместители. Синтезирани са 18 нови вещества, чиято структура е определена еднозначно с помоща на спектрални методи. (публ. № 1).

4.2. Синтез на С- и О- арилгликозиди като потенциални антиоксиданти.

Известно е, че природни и синтетични фенолни съединения като ВНА притежават антиспазмогенна и антиоксидантна активност. Предположено е, че подходящо функционализиране на тези съединения може да доведе получаване на ефективни агенти срущу исхемичен удар. Гликозидирането им би довело до повишаване на тяхната водоразтворимост и до улесняване на тяхното проминаване в клетъчното и междуклетъчното пространство и съответно да повишаване на тяхната активност. Във връзка с това, серия от С- и О- арилгликозиди са синтезирани и структурно охарактеризирани. При реакция на гликозидиране на tert-BHQ в киселинни условия с подходящо модифицирани донори са получени серия от О- арилгликозиди с добри добиви. Наблюдаваната висока β-селективност може да бъде обяснена с влиянието на съседния С-2 заместител чрез образуване на междинен ацилоксониев или оксазолониев йон. При реакция на броммагнезиеви соли на феноли и ацетил-D-глюкал в ултразвукова вана са получени серия от С- и О- арилгликозиди с добиви от 10 до 77%. Реакцията е високо стереоселективна и води до получаването главно на С-1-α-аномера. Структурата на синтезираните над 20 нови съединения е определена със спектрални методи (ЯМР и МС). Двете серии С- и О- гликозиди могат да бъдат разграничени от броя на сигналите и константите на спиново взаимодействие в ароматното ядро, присъствието/отсъствието на ОН сигнал в ¹Н ЯМР спектрите и др. Съществените различия в мас-спектралната фрагментация позволи разграничаването на С- и О- производните, както и на позиционните изомери. Структурата на някои съединия е доказана и с помоща на X-ray. Изследвана е антиоксидантната активност на синтезираните съединения. Установено е, че те притежават добра до висока антипеорксидантна активност в сравнение с тази на ВНА. Единствено съединенията, в които липсва фенолна ОН група са неактивни (публ. № 11 и 12).