Състав и реология на адсорбционни слоеве от смеси на протеини и пав върху различни междуфазови граници

по Дисертация на тема “Състав и реология на адсорбционни слоеве от смеси на протеини и ПАВ върху различни междуфазови граници"; представена от Румяна Добрева Станимирова, за получаване на образователната и научна степен “доктор” – 4.2. Химически науки (Теоретична химия).

Рецензираният дисертационен труд “Състав и реология на адсорбционни слоеве от смеси на протеини и ПАВ върху различни междуфазови граници" е представен за получаване на образователната и научна степен “доктор” от Румяна Добрева Станимирова, редовен докторант в Катедрата по Инженерна химия при Факултета по химия и фармация на Софийския Университет “Св. Климент Охридски”.

Рецензираната дисертация съдържа 104 страници оригинален текст, включващ 45 фигури и 8 таблици. Цитирани са 120 литературни източника. Изложението е организирано последователно в пет глави, всяка от тях с множество подзаглавия. Съдържа още допълнителните заглавия: “Основни приноси в дисертацията”; “Публикации по дисертацията” и “Литература”. Дисертацията е построена върху научни резултати, представени в две публикации излезли от печат през 2013 и трета работа – приета за печат през 2014 година. Първата e публикация е глава в книга: Colloid and Interface Chemistry for Nanotechnology от поредицата Progress in Colloid and Interface Science (CRC Press). Останалите две са в специализирани научни списания с висок импакт фактор (Langmuir; Colloids and Surfaces A).

Като изследователски обект, дисертацията е посветена на структурата, свойствата и поведението на смесени адсорбционни слове на междуфазна границата вода/въздух. По-конкретно: на съчетания ефект на смеси от протеини, и/или протеин плюс повърхностно активно вещество (ПАВ), върху образуването, структурата и реологичното поведение на съответните изследвани системи.

Съответно, основната изследователската цел на дисертацията е формулирана като (цитирам): “Да се изследват реологичните свойства на протеинови адсорбционни слоеве на междуфазова граница вода-въздух и в частност на смеси от два протеина или на смеси от протеин с ниско молекулно ПАВ.”

Изследователските задачи на дисертацията са формулирани като: “Да се изясни каква е структурата на смесените адсорбционни слоеве и как тази структура и взаимодействията на молекулите оказват влияние върху повърхностните реологични свойства”.

Избраната тема на дисертационния труд и поставените цел и задачи притежават безспорна приложна, но също и фундаментална актуалност в съвременната технологическа практика – управляването на устойчивостта на дисперсни системи. Потвърждение е интересът в литературата към подобни изследвания през последните години. Ниско молекулни ПАВ и протеини намират приложение в хранителната, химическата и фармацевтична промишленост като естествени стабилизатори на различните дисперсии.

Практическото значение на тези обекти стимулира и изследователския интерес към тях. Респективно, повърхностните свойства, и стабилизиращата способност на смеси от протеини и/или ПАВ, особено напоследък, са обект на множество изследвания от други автори.

По-нататъшната дискусия върху разделите, включващи различните изследвания на рецензирания дисертационен труд, е съобразена със структурата му.

Уводната част (Глава 1) включва описание и характеризиране на предмета на работата, експерименталните подходи за изследване на смесени адсорбционни слоеве, връзката между обемна агрегация, повърхностни свойства и структура на образуваните слоеве. Структурата на дисертацията е детайлизирана, с формулиране на поставените цели (задачи) по отделните части, свързани със съответните изследвания. Интересно е, че в увода е отделено специално внимание на специфичните свойства на един от трите изследвани протеина (HFBII хидрофобин).

Както е нормално да се очаква, уводът съдържа това, което обикновено се именува литературен обзор. Тук са съсредоточени повечето от цитираните в дисертацията литературни източници. Макар в по-малки количества, нови литературни източници се появяват и в следващите глави: на местата, където е конкретното им обсъждане, което е напълно обосновано. Съдейки по техния брой и характер, моето заключение е, че авторът познава задълбочено литературата в областта; обзорът и проучването, които предлага са достатъчно пълни, за да представят една цялостна картина.

Обещавам по-нататък да не нагазвам в езикови и граматически тънкости, но покрай Увода, не мога да се въздържа донякъде от изкушението да маркирам някои отклонения от нормите:

- Както в други рецензии, ще напомня и на настоящия автор, че (за разлика от “емулсия”) терминът “пяна” в българския език не е разрешен в множествено число (стр. 2, 7).

- Все още се смята за грешно, когато е пропуснат пълен член за м.р. (стр. 2, 4, 36, 47).

- Скоростта бива “висока/ниска”, в краен случай “голяма/малка”, но не и “бърза/бавна” (стр. 6, 25).

- Стр. 10: “...концентрация под критичната...”, “...над критичната...” - Става дума за мицелообразуване, не ли? Нека авторът обясни!

- Думата “капиляр” в българския (и не само в българския!) език е от мъжки род (стр.23).

- Странно ми звучат пасажи с новоизковани термини като: “разтичане на слой” (в смисъл на “разстилане”, стр. 25, 74, 77); „...слюда беше докосвана отгоре до [т.е допирана до] разтечен слой” (стр. 25).

N.B.: В Увода част от термините и съкращенията са въведени без обяснение. По-удобно би било те да са обяснени именно тук, при първото появяване в дисертацията, а не в следващи глави.

Намирам, че уводната част, в своята донякъде необичайна, но ефикасна форма, изгражда добра основа за развитието на следващите раздели.

В глава 2 от дисертацията са описани материалите и основните експериментални методи, използвани за охарактеризиране на изследваните системи. Тази е най-кратката част от дисертацията (12 страници), но в нея достатъчно отчетливо и детайлно са охарактеризирани използваните протеини с различен тип и структура, (анионно) ПАВ и допълнителен електролит. Описани са процедурите за приготвяне на работните разтвори, методите и устройствата за определяне на адсорбцията и свойствата на получените адсорбционни слоеве.

Работни вещества

Изследванията са проведени с четири протеина, подбрани с различна структура и свойства за определяне на адсорбцията им из смесени разтвори и поведението им в адсорбционния слой. Това са:

За охарактеризиране на повърхностни свойства на изследваните разтвори е приложено съчетание от разнообразни експериментални методи, целящо взаимното им допълване в изследването.

Както показва материалът, представен в следващите раздели на дисертацията (глави 3 - 5), комбинацията от така приложените изследователски методи е била успешна и резултатна.

В Глава 3 са представени изследванията на взаимодействията между два протеина със съществено различни структура и свойства (глобуларния BSA и неструктурирания β-casein) и реологичното поведение на адсорбционните слоеве получени при конкурентна (последователна и паралелна) адсорбция на междуфазната граница вода/въздух. Адсорбционното и реологичното поведение за тези протеини е известно от литературата поотделно, но не и за техните смеси. Това е мотивирало едно по-задълбочено системно изследване на съвместната им адсорбция.

Знае се, че устойчивостта на пяната зависи не само от скоростта на адсорбция на протеин или ПАВ, но и от здравината на тънките течни филми между две мехурчета в нея. Важен фактор също е и пропускливостта на филмите по отношение на газове, водеща до Оствалдово зреене, която зависи от запълването на адсорбционния слой. Ето защо в дисертацията са комбинирани моделни експерименти на единична повърхност (деформирано мехурче) и на две междуфазови граници (тънки течни филми).

В тези изследвания са впрегнати няколко експериментални метода: DSA метод за повърхностното напрежение е използван с модул за осцилации и определяне реологичното поведение на адсорбционния слой, клетка за сменяне на водната фаза; клетка на Шелудко-Ексерова и модифицирана промивна клетка за дефиниране на поведението и стабилността на филмите. Чрез тях се акумулира информация за динамичното и равновесното повърхностно напрежение, повърхностните модули на разширение, дебелината на филмите при приложено високо и ниско налягане.

При изследванията на единичните пенни филми възникват въпроси, на които ще очаквам отговори от автора:

- Защо c_NaCl = 1 mM? Ако целта е (пълно) подтискане на електростатичното разклинящо налягане, то тя едва ли е достатъчна; ако целта е била частично подтискане на П_el, то как е експлоатиран съответният ефект?

- Защо за промиване е предпочетена друга (малко по-висока) концентрация: c_NaCl = 3 mM?

- Защо налягането в “отворена” клетка трябва да е 5 atm, докато в “затворена” е няколко хиляди пъти по-ниско?

- Как е оценено (цитирам): “Стандартното отклонение на h, което е в рамките на грешката на експеримента + 3 nm.”?

Важен резултат и извод в тази част е, че (цитирам): “…свойствата на адсорбционните слоеве и стабилността на пенните филми зависят от реда на адсорбция на междуфазовата граница.” Ако първоначално е адсорбиран β-casein, поведението се определя от молекулите на BSA. Филмите е неустойчиви при високо капилярно налягане (отворена клетка). Обратно, при начална адсорбцията на BSA повърхностното напрежение е ниско, повърхностната еластичност – висока и пенните филмите са устойчиви.

Съответният анализ е позволил хипотези за възможните структури на адсорбционните слоеве при паралелна и при последователна адсорбция, а резултатите могат да бъдат експлоатирани за моделиране на различни свойства на дисперсии, стабилизирани със смеси от протеини.

Глава 4 от дисертацията третира реологичното поведение и свойствата на смесени слоеве от протеин (HFBII) и ниско молекулно ПАВ (SDS).

Ценните свойства на HFBII са познати от литературата: силно повърхностно активен, добър стабилизатор на дисперсии, дава повърхностни слоеве с висока еластичност, подтиска Оствалдовото зреене и коалесценцията. За сметка на това е доста скъп. Ето защо намирането на смеси с други компоненти, които запазват неговите ценни адсорбционни свойства и при по-ниско съдържание, е важна практическа цел.

Изследвана е кинетиката на адсорбция из смесени разтвори на HFBII и SDS, конкурентната адсорбция на двата компонента при последователна и паралелна адсорбция, ефектът на SDS върху повърхностната реология (разтягане) на смесените адсорбционни слоеве.

Отново са комбинирани различни експериментални методи. Повърхностното напрежение е измервано по метода на деформираното мехурче (DSA метод), с модул за експерименти с осцилации и клетка за сменяне на водната фаза. Тънки течни филми са изследвани с клетки на Шелудко–Ексерова (вкл. “Flush cell”). Направено е сравнение при едни и същи експериментални условия на различните протеин-съдържащи системи (смеси): HFBII/SDS, BLG/SDS, BSA/SDS.

В тази част мога да изтъкна няколко основни резултата, свързани с установеното нетривиално адсорбционно поведение на такива смесени повърхностни слоеве. Предложени са и съответни хипотези за обяснение на получените ефекти.

- Адсорбцията на HFBII из смесен разтвор е дифузионно контролирана, но експериментално определената скорост е с порядък по-висока от предсказаната по уравнението на Ward и Tordai (обяснение: адсорбция на HFBII върху повърхност вече частично запълнена с SDS).

Първоначалната адсорбция на HFBII е необратима, за разлика от другите протеини (BLG и BSA), които напълно се изместват от повърхността при промиване с мицеларен разтвор на SDS.

- При паралелна адсорбция са намерени значителни разлики за концентрации на SDS под и над СМС. Ниски концентрации (с_SDS < СМС) не препятстват адсорбцията на протеин докато над СМС няма адсорбция на HFBII (обяснение: хидрофилизация на протеиновите агрегати от ПАВ в обема).

- В присъствие на SDS еластичността на разширение на HFBII адсорбционен слой силно намалява (взаимодействие с SDS). При смяна на разтвора с чиста вода високите стойности на еластичност се възстановяват (обяснение: отстраняване на SDS от смесения адсорбционен слой).

- В присъствие на мицеларен SDS, HFBII може да съществува в две различни метастабилни състояния (при паралелна и последователна адсорбция на двата компонента).

- Еластичността на разширение на HFBII слоевете във функция от повърхностното напрежение минава през максимум (фазов преход в протеиновия адсорбционен слой: сливане на повърхностните агрегати, подпъхване на молекули или втвърдяване на повърхностния слой).

Въпроси към автора:

- Защо за смесите е избрано/предпочетено анионно и въобще – йонно ПАВ? Такъв избор има ли специални предимства?

- Стр.51; Фиг.4.2 и стр.56; Фиг.4.5: Защо първото водно промиване при адсорбция на HFBII+ SDS има само частичен ефект? Защо повърхностното напрежение продължава да спада след (първото) промиване, а не се запазва или повишава?

- Защо е необходимо да се добавя “нова” еластичност (E_dil, стр. 68), след като отдавна вече са въведени няколко еластичности: Е, К и μ (стр.19)?

Получените резултати в тази глава допринасят за по-дълбокото разбиране на факторите, които контролират свойствата на повърхностните адсорбционни слоеве съдържащи хидрофобин във връзка с различните им приложения.

Пета глава, от дисертацията е посветена на връзката между високата повърхностна еластичност на HFBII на междуфазова граница и мезоскопската структура на слоя. Целта е изследването/установяването на причината за високата еластичност на адсорбционните слоеве HFBII във връзка с мезоскопска им структура.

За постигане на тази цел в дисертацията успешно са комбинирани измервания с AFM и Лангмюрова вана. Молекулите на HFBII са разстлани (“разтечени”!) на междуфазова граница вода–въздух в Лангмюрова вана и подложени на свиване, което повишава двумерното повърхностно налягане на слоя. С помощта на Лангмюрова вана е изследвано реологичното поведение на втвърден слой от HFBII и са подготвяни проби при зададени различни повърхностни налягания за наблюдение с атомно силов микроскоп. Еластичността на слоя е определяна също при много бавни деформации и чрез осцилации на повърхността на ваната.

Приложеният подход е позволил да се свържат данните за двумерното налягане с еластичността на слоя и с наблюдаваната от AFM структура. Чрез комбинацията на тези два метода е обяснена връзката между високата еластичност и структурата на адсорбционен слой HFBII.

Общи изводи и заключения

Представената дисертацията представлява системно експериментално изследване на смесени адсорбционни слоеве върху водна повърхност. Изследването е насочено към изясняването на съществени страни от структурата и реологията на такива адсорбционни слоеве от протеини (и ПАВ). Получена е значителна нова информация, която има фундаментална, а също и приложна стойност.

В основните научни и научно-приложни приноси на рецензираната дисертация има резултати в няколко насоки:

Формулиране и обосноваване на нови хипотези за възможната структура на смесените слоеве:

- За различните свойства на повърхностните слоеве в зависимост от реда на адсорбиране (Глава 3; публикация Д1).

- Хипотези за максимума в еластичността на слоеве от HFBII в зависимост от σ и за структурата на адсорбционният слой във всеки момент от тази зависимост (фазов преход в протеиновият адсорбционен слой, сливане на по-малките повърхностни агрегати в по-големи, преход с подпъхване на едни молекули протеин под други или втвърдяване на повърхностния слой – Глава 4; публикация Д3).

- Двата вида трислойни структури, наблюдавани с AFM, се образуват по два различни механизма: големи домени - вследствие на нагъване и подпъхване на изградения монослой (както е при липидните слоеве); малки зърнести агрегати - при притискането на монослоя по време на осцилации (Глава 5; публикация Д2).

Доказване с нови средства на нови страни на съществуващи проблеми, теории, хипотези; получаване и доказване на нови и потвърдителни факти. Ще посоча само някои от по-интересните:

- Веднъж адсорбиран, HFBII не може да бъде изместен от SDS при последователна адсорбция, независимо от концентрацията – под/над CMC (Глава 4).

- Две метастабилни състояния на HFBII и SDS над CMC: (i) смесени хидрофилни агрегати в обема при паралелна адсорбция; (ii) адсорбиран HFBII (със SDS) на междуфазовата граница при последователна адсорбция (Глава 4, публикация Д3).

- Структурата на HFBII слоевете над фазовия преход (П = 22 mN/m) е силно нехомогенна и включва празнини, монослой и два типа трислойни структури (Глава 5, публикация Д2).

- Чрез структурата на слоя при различни двумерни налягания са обяснение високите стойности на повърхностната еластичност: до 500 mN/m (Глава 5, публикация Д2).

Използваната в дисертацията комбинация от методи за определяне на повърхностни свойства и пенните тестове се допълват взаимно, за да предложат нов поглед към адсорбцията и реологичното поведение в смесени системи.

Заслужава похвала и грижливото оформяне на дисертацията, особено по отношение на фигурите. Трудно ми е да изтъкна най-информативните измежду тях, но все пак ще посоча няколко за пример: Фигури 3.3; 3.5; 4.9; 4.12; 5.2; 5.7.

От включените в дисертацията три публикации две вече са излезли от печат: първата като част от книга (Colloid and Interface Chemistry for Nanotechnology, от поредицата Progress in Colloid and Interface Science на CRC Press), а другата - в престижното международно специализирано списание Langmuir. Още една е приета за печат, отново в престижно специализирано списание - Collids and Surfaces A.

Публикациите по дисертацията са предимно в съавторство с колеги на докторантката от Катедрата по инженерна Химия на ФХФ. Между тях са научният консултант на дисертанта, акад. Петър Кралчевски (Д1, Д2, Д3), научните ѝ ръководители, проф. Красимир Данов (Д3) и доц. Кръстанка Маринова (Д1, Д3) и още седмина изследователи. В две от публикациите (Д2, Д3) Румяна Станимирова е на първо место и в една – на второ (Д1), което приемам за признание от страна на ръководителите и другите съавтори за нейния съществен принос във всички изследвания.

Като се имат предвид достойнствата и приносите на публикациите, и високият авторитет на периодиката, където се публикуват, съм убеден в съответствието на предлагания дисертационен труд с предявяваните към него изисквания както формално, така и по същество.

До този момент научният ефект на първите две публикации, включени в дисертацията е намерил изражение в два цитата в международната научна литература. Това е засега сравнително скромен ефект, но тези две публикации са твърде скорошни, за да дирим по-широко представителство, а за третата (в процес на публикуване) това е практически невъзможно. Моето мнение е, че работите заслужават по-изявен научен интерес, който ще се прояви в близко бъдеще.

Материали от Дисертацията са представени на 7 научни форума (5 национални и 2 международни). Има основание да се говори и за приложна стойност на получените резултати. Авторефератът съответства на изискванията и отразява правилно основните резултати и приноси на дисертационния труд.

Общото ми впечатление от дисертационния труд безсъмнено е благоприятно. Изложението ме убеждава, че Румяна Станимирова е изследовател с отлична университетска подготовка и е достигнала много добро равнище на компетентност в областта на физикохимията на повърхностните явления и дисперсните системи. Смятам също така, че Дисертацията е в достатъчна степен нейно лично дело.

В заключение ще подчертая, че представеният ми за рецензиране дисертационен труд съответства напълно на изискванията за получаване на образователната и научна степен “доктор”.

Въз основа на гореизложеното убедено препоръчвам на кандидатката Румяна Добрева Станимирова, редовен докторант в Катедрата по Инженерна химия при Факултет по Химия и Фармация на Софийския университет “Св. Климент Охридски”, да бъде присъдена образователната и научна степен “доктор”.

София, 25 юни 2014