Институт за контрол на ветеринарномедицински продукти
|
Версия: 02/ 11.06.2009г.
|
Лист
|
Стандартна оперативна процедура 031
ИЗВЪРШВАНЕ НА РЕАКЦИЯ МИКРОСТЕПЕННА АГЛУТИНАЦИЯ
|
Изменение ......./……………
|
-
ЦЕЛ
Тази стандартна оперативна процедура се прилага за качествено и количествено определяне титъра на антителата в серуми от ваксинирани опитни животни или в имунни серуми, както и за изясняване на съаглутинацията, когато един микроорганизъм се аглутинира от няколко имунни серуми.
-
ОБХВАТ
За оценка на ефикасността на ИВМП и определяне напрежението на имунитета в серуми от опитни животни.
-
ЧЕСТОТА НА ПРИЛОЖЕНИЕ
Методът се използва при оценка на ИВМП, когато в неговата документация микростепенната аглутинация е посочена като метод за доказване на неговата ефикасност, и като скрининг тест.
-
АПАРАТУРА И МАТЕРИАЛИ
Апаратура: Автоклав, инкубатор, микроскоп, хладилник, центрофуга
Помощни материали: Микротитьрна плака (U-образните са за предпочитане, но могат да се използват също и V-образни плаки), стерилни епруветки, Епендорф епруветки, Микропипети, многоканални пипети, Ерленмайерови колби;
Консумативи: Физиологичен разтвор - 0,9% NаС1, pH 7,1 5; Антигени (живи или убити бактериални суспензии); Хиперимунни серуми - референтни положителни (+) и отрицателни (-) серуми; Контролни нулеви серуми; Серуми от ваксинирани животни; Стандарти;
-
ОТГОВОРНОСТИ
Ръководителят на лабораторията носи отговорност за извършване на реакцията.
-
ПРОЦЕСНА КАРТА
-
ПРОЦЕДУРА
Действие
|
От кого се извършва
|
Кога се извършва
|
Как се извършва
|
1. Накапване в микротитърна плака
|
лаборант
|
|
Във всяка ямка на микротитърна плака с микропипета се поставят равни обеми физиологичен или друг разтвор, посочен в досието на продукта (например РВS). Стандартното количество на разтвора е 50ml или 100ml, освен ако не е посочено друго количество в досието на продукта.
|
2. Добавяне на серуми
|
лаборант
|
|
Във всяка ямка се прибавя еднакво количество, от тестваните или от контролните серуми, съответстващо на обема на физиологичния разтвор, с изключение на ямките, определени за контроли на антигена
|
3.Получаване на двукратни разреждания
|
лаборант
|
|
Съдържанието във всяка ямка се хомогенизира и от нея се прехвърля по 50 ml (100 ml) в следващата, стояща в дясно от предходната ямка, разположени на един и същ хоризонтален ред.
От последната ямка се изхвърля съответното количество (50 ml или 100 ml), за да бъдат равни обемите във всички ямки. Така се получават двукратни разреждания (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:4096), освен ако не се изискват десетократни или други разреждания.
|
4. Накапване на антиген1
|
лаборант
|
|
Накапва се аналогично количество от разредения антиген (50 ml или 100 ml) във всяка микроямка, без да се включват ямките, определени за контроли на положителните и отрицателните серуми.
Същото се повтаря за толкова редове от микротитърната плака, колкото са необходими за изпълнението на реакцията.
|
5. Покриване с парафилм
|
лаборант
|
|
Плаката се покрива с парафилм и внимателно се разклаща.
|
6. Инкубиране
|
лаборант
|
|
В термостат при 35°С -37°С/18-24 часа, след което престоява на стайна температура 2 часа.
|
7. Отчитане на резултатите
|
Инспекторът, извършващ анализа
|
|
Отчитането се извършва с просто око или с вдлъбнатoто огледало на микроскопа, като се наблюдава откъм дъното на плаката, в присъствието на лека светлина 2
|
1 За антиген се използват: живи култури щамове микроорганизми, използвани в хиперимунизацията или при изготвянето на ваксини. Те се посяват на твърди хранителни среди и се култивират при 33°-35°С/ 18-24 часа. Агаровите култури се отмиват с физиологичен разтвор и се стандартизират до необходимата гъстота -1,2 или 3 милярда бактериални тела в 1ml по Мас Fагlаnd; убити бактериални суспензии (диагностикуми), приготвени (чрез химична и термична обработка, според термостабилността на антигена - О, Н и К антигени) и титрирани
2 При добавяне на равен обем бактериални суспензии към серумните разреждания, се получава удвояване на разреждането, затова крайното отчитане на реакцията е с едно разреждане по-високо.
Най - напред се отчитат контролите. Реакцията е протекла правилно, когато липсва спонтанна аглутинация в контролата на антигена и отрицателния серум, а аглутинацията в контролата на положителния серум е добре изразена. При положителна аглутинация аглутинатът покрива цялото дъно във вид на чадърче и надутаечната течност се избистря. При отрицателна аглутинация бактерийната суспензия се утаява копчевидно и течността остава мътна. Титърът на серума е максималното разреждане, при което все още всички бактерии са слепени на купчинки на дъното на ямките в микротитърната плака.
Ако за микростепенната аглутинация е използвана суспензия от бактерии, на които ресните са разрушени, се отчита О - аглутинация. Н - аглутинация се отчита, когато соматичния антиген на бактериите е бил отстранен, а при използване на К- антигени, се отчита К -аглутинация.
За изразяване силата на аглутинацията в отделните ямки, се използват следните обозначения:
++++ - при положителна аглутинация, аглутинатът покрива цялото дъно във вид на чадърче и надутаечната течност се избистря;
+++ - при почти пълно избистряне на суспензията, тъй като по-голямата част от бактериите са аглутинирани;
++ - при аглутиниране на около 50% от бактериалните тела, при което мътнината е редуцирана на половина, в сравнение с контролата;
+ - когато течността е мътна, поради аглутинация на малка част от бактериите;
- отрицателна реакция, при липса на аглутинация и мътнина, подобна на контролата
Разработил:
ИННОВА ЕООД
|
Утвърдил:
(име, подпис)
|
01/06/2009 г.
|
11/06/2009 г.
|
Каталог: SOP%20finalSOP%20final -> Процедурата за калибриране се прилага периодично за да възпроизведе и контролира основните метрологични характеристики на методаSOP%20final -> Hp/Compaq computer system 6GHz piv processor, 512 mb ram, 80 gb hdd, 3SOP%20final -> Цел целта на тази стандартна оперативна процедура е защита на работещите от рискове, свързани с експозиция на биологични агенти при работа с тях. ОбхватSOP%20final -> Цел определя се минималната подтискаща концентрация /мпк/ на даден антибиотик спрямо микроорганизмите. ОбхватSOP%20final -> Цел тази стандартна оперативна процедура регламентира микробиологичния метод за количествено определяне концентрацията на антибиотици. ОбхватSOP%20final -> Оценка на напрежението на имунитета, чрез свързване на антиген и антитяло и проследяване активността на ивмпSOP%20final -> Оценка на напрежението на имунитета, чрез свързване на антиген и антитяло и проследяване активността на ивмп, като скрининг тестSOP%20final -> Цел тази стандартна оперативна процедура се прилага за поддържането на референтни бактериални щамове за нуждите на лаборатория Микробиология, чрез препосяването им през определени периоди от време в подходящи хранителни среди обхватSOP%20final -> За контрол на качеството на почистването и дезинфекцията на лабораториите, помощните помещения, облекло и ръце на персонал работещ в тях, редовно се извършват микробиологични изследванияSOP%20final -> Цел целта на тази стандартна оперативна процедура е да опише методът на изследване за откриване на специфични антитела срещу говеждия пестивирус (bvdv) в проби от серум или мляко. Обхват
Сподели с приятели: |