За съдържание на пропионова киселина 2 % (M/M) разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,12 %. ХХХVII. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХИДРОХИНОН, ХИДРОХИНОН МОНОМЕТИЛОВ ЕТЕР, ХИДРОХИНОН МОНОЕТИЛОВ ЕТЕР И ХИДРОХИНОН МОНОБЕНЗИЛОВ ЕТЕР В КОЗМЕТИЧНИ ПРОДУКТИ А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ 1. Област на приложение
Методът се отнася за откриване и идентификация на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер (монобензон) в козметични продукти за осветляване на кожата. 2. Принцип
Хидрохинонът и неговите етери се идентифицират чрез тънкослойна хроматография (ТСХ). 3. Реактиви
Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.
Стандартните разтвори трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба и са стабилни един ден.
3.11.1. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон (3.7) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).
3.11.2. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон монометилов етер (3.8) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).
3.11.3. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон моноетилов етер (3.9) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).
3.11.4. В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон монобензилов етер (3.10) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1).
3.12. Сребърен нитрат.
3.13. 12-Молибденфосфорна киселина.
3.14. Калиев ферицианид хексахидрат.
3.15. Ферихлорид хексахидрат.
3.16. Реактиви за проявяване на петната.
3.16.1. Към 5 % (M/V) воден разтвор на сребърен нитрат (3.12) се прибавя амоняк (3.5), докато образувалата се утайка се разтвори.
Внимание: Разтворът става експлозивно нестабилен при престояване и след употреба трябва да се изхвърли.
3.16.2. 10 % (M/V) разтвор на 12-молибденфосфорна киселина (3.13) в етанол (3.1).
3.16.3. Приготвя се 1 % (M/V) воден разтвор на калиев ферицианид (3.14) и 2 % (M/V) воден разтвор на ферихлорид (3.15). Преди употреба се смесват равни части от двата разтвора. 4. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване.
4.1. Стандартно оборудване за ТСХ.
4.2. Готови плаки за ТСХ: силикагел GHR/UV254; 20 x 20 cm (Machery, Nagel или еквивалентни); дебелина на слоя: 0,25 mm.
4.3. Ултразвукова вана.
4.4. Центрофуга.
4.5. Ултравиолетова лампа, 254 nm. 5. Процедура
5.1. Приготвяне на пробата.
В градуирана епруветка от 10 cm3 (ml) се претеглят 3,0 g от пробата с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm3 (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10, и се долива до обем 10 cm3 (ml) с етанол (3.1). Епруветката се затваря със запушалка и се хомогенизира в ултразвукова вана за 10 min. Филтрува се през филтърна хартия или се центрофугира при 3000 rpm.
5.2. Тънкослойна хроматография.
5.2.1. Хроматографската вана се насища с подвижна фаза (3.4).
5.2.2. Върху плаката се нанасят по 2 l от стандартните разтвори (3.11) и 2 l от разтвора на пробата (5.1). Хроматограмата се развива на тъмно при стайна температура, докато фронтът на разтворителя достигне разстояние 15 cm от стартовата линия.
5.2.3. Плаката се изважда и се изсушава при стайна температура.
5.3. Проявяване на петната.
5.3.1. Плаката се разглежда под УВ светлина при 254 nm и се отбелязва разположението на петната.
5.3.2. Плаката се напръсква с един от следните реактиви:
- реактив сребърен нитрат (3.16.1);
- реактив 12-молибденфосфорна киселина (3.16.2); нагрява се до 120 °С;
- разтвор на калиев ферицианид и разтвор на ферихлорид (3.16.3). 6. Отчитане на резултатите
Изчислява се Rf стойността на всяко петно.
Сравняват се петната, получени от разтвора на пробата, с петната на стандартните разтвори по отношение на: техните Rf стойности, цвета на петната при УВ облъчване и цвета на петната след оцветяване с реактивите за напръскване.
Прилага се ВЕТХ, описана в следващия раздел (Б), и се сравняват времената на задържане на пика (пиковете) на пробата с тези на стандартните разтвори.
Обобщават се резултатите от ТСХ и ВЕТХ, за да се потвърди присъствието на хидрохинон и/или неговите етери. 7. Забележки
При описаните условия се наблюдават следните Rf стойности:
хидрохинон - 0,32
хидрохинон монометилов етер - 0,53
хидрохинон моноетилов етер - 0,55
хидрохинон монобензилов етер - 0,58. Б. ОПРЕДЕЛЯНЕ 1. Област на приложение
Методът се отнася за определяне на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер в козметични продукти за осветляване на кожата.
2. Принцип
Пробата се екстрахира със смес вода/метанол при слабо нагряване до стопяване на всички липидни материали. Определянето на всички търсени вещества се извършва посредством течна хроматография с обърнати фази и УВ детектор.
3. Реактиви
3.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.
3.2. Метанол.
3.3. Хидрохинон.
3.4. Хидрохинон монометилов етер.
3.5. Хидрохинон моноетилов етер.
3.6. Хидрохинон монобензилов етер (монобензон).
3.7. Тетрахидрофуран, "ВЕТХ" чистота.
3.8. Смес вода : метанол = 1:1 (V/V). Смесват се един обем вода с един обем метанол (3.2).
3.9. Подвижна фаза - смес: тетрахидрофуран : вода = 45:55 (V/V). Смесват се 45 обема тетрахидрофуран (3.7) и 55 обема вода.
3.10. Стандартен разтвор.
В мерителна колба от 50 cm3 (ml) се претеглят с точност 0,001 g 0,06 g хидрохинон (3.3), 0,08 g хидрохинон монометилов етер (3.4), 0,10 g хидрохинон моноетилов етер (3.5) и 0,12 g хидрохинон монобензилов етер (3.6). Разтварят се и се долива до марката с метанол (3.2).
Стандартният разтвор се приготвя чрез разреждане на 10,00 cm3 (ml) от този разтвор до 50,00 cm3 (ml) със смес вода : метанол (3.8). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.
4. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване.
4.1. Водна баня, поддържаща температура 60 °С.
4.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ детектор с променяща се дължина на вълната и дозатор с 10 l капиляра.
4.3. Аналитична колона.
Хроматографска колона от неръждаема стомана, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 4,6 mm, пълнеж Zorbax фенил (химически свързан фенетилсилан върху Zorbax SIL, допълнително дезактивиран (end-capped) с триметилхлорсилан), размер на частиците 6 mm или еквивалентна. Да не се използва предколона, различна от "phenyl guard" или еквивалентна.
4.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, бяла лента № 5892, или еквивалентна.
В мерителна колба от 50 cm3 (ml) се претегля 1 g от пробата (M) с точност 0,001 g. Пробата се диспергира в 25 cm3 (ml) смес вода/метанол (3.8). Колбата се запушва и се разклаща енергично до получаване на хомогенна суспензия. Разклаща се поне 1 min. Колбата се поставя във водна баня (4.1) при 60 °С за улесняване на екстракцията. Колбата се охлажда и се долива до марката със смес вода/метанол (3.8). Екстрактът се филтрува с филтърна хартия (4.4). ВЕТХ определянето трябва да се извърши в рамките на 24 h от приготвянето на екстракта.
5.2. Високоефективна течна хроматография.
5.2.1. Скоростта на подвижната фаза (3.9) се нагласява на 1,0 cm3 (ml)/min, а детекторът се настройва на 295 nm.
5.2.2. Дозират се 10 l от разтвора на пробата, получен както е описано в 5.1, и се записва хроматограмата. Измерва се площта на пиковете. Извършва се калибриране, както е описано в 5.2.3. Сравняват се хроматограмите, получени за пробата и за стандартния разтвор. Използват се площите на пиковете и коефициентите на детектора (RF), получени съгласно 5.2.3, за изчисляване на концентрациите на анализираните вещества в разтвора на пробата.
5.2.3. Стандартна крива.
Инжектират се 10 l от стандартния разтвор (3.10) и се записва хроматограмата. Инжектира се няколко пъти, докато се получи постоянна площ на пика.
Определя се коефициентът на детектора RFi:
Pi
RFi =
---- ,
Сi
където:
Pi e площта на пика на хидрохинона, хидрохинон монометиловия етер, хидрохинон моноетиловия етер или хидрохинон монобензиловия етер;
Сi - концентрацията на стандартния разтвор (3.10) на хидрохинона, хидрохинон монометиловия етер, хидрохинон моноетиловия етер или хидрохинон монобензиловия етер в g/50 cm3 (ml).
Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:
- Разделянето на пиковете в най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90. (за дефиниция на коефициента на разделяне виж фиг. 1).
Ако не е постигнато необходимото разделяне, трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза до получаване на добро разделяне.
- Коефициентът на асиметрия (AS) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5. (За дефиниция на коефициента на асиметрия виж фиг. 2). Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.
- Базовата линия трябва да е стабилна.
6. Изчисления
За изчисляване на концентрацията (концентрациите) на анализираното вещество (вещества) в пробата се използват площите на пиковете на анализираните вещества. Концентрацията на анализираното вещество в пробата се изчислява като % (M/M) (xi) по формулата:
bi x 100
xi %(M/M) =
--------- ,
RFi x М
където:
M е масата на пробата в g;
bi - площта на пика на анализираното вещество в пробата.
7. Повторяемост (1)
7.1. За съдържание на хидрохинон 2,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,13 %.
Фиг. 1. Коефициент на разделяне на пиковете
Фиг. 2. Коефициент на асиметрия на пика
7.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,1 %.
7.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.
7.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.
8. Възпроизводимост (Виж ISO 5725.)
8.1. За съдържание на хидрохинон 2,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,37 %.
8.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,21 %.
8.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,19 %.
8.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер 1,0 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11 %.
9. Забележки
9.1. Когато е установено съдържание на хидрохинон значително по-голямо от 2 % и се изисква по-точна оценка на съдържанието му, екстрактът от пробата (5.1) трябва да се разреди до концентрация, която би се получила от проба, съдържаща 2 % хидрохинон, и определянето се повтаря.
(При някои апарати абсорбцията може да бъде извън интервала на линейност на детектора при високи концентрации на хидрохинон.)
9.2. Пречещи фактори.
Описаният по-горе метод дава възможност за определяне на хидрохинон и негови етери при единично изократично хроматографиране. Използването на "фенил" колона осигурява достатъчно време за държане на хидрохинона, което не може да се гарантира, когато се използва С18 колона с описаната подвижна фаза.
Освен това този метод е податлив на влиянието на пречещи вещества, като редица парабени. В такива случаи определянето трябва да бъде повторено с използване на различни системи подвижна/неподвижна фаза. Подходящи методи могат да бъдат намерени в публикациите 1 и 2, а именно:
Колона: Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 сm, или еквивалентна:
Температура - 36 °С
Скорост - 1,5 cm3 (ml)/min
Подвижна фаза:
за хидрохинон - метанол : вода = 5 : 95 (V/V);
за хидрохинон монометилов етер - метанол : вода = 30 : 70 (V/V).
за хидрохинон монобензилов етер - метанол : вода = 80 : 20 (V/V) (M. Herpol-Boremans et M.-O.Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et de ses ethers methylique et benzylique dans les produits cosmetiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986).).
Колона: Spherisorb S5-ODS, или еквивалентна:
Подвижна фаза - вода : метанол = 90 : 10 (V/V)
Скорост - 1,5 cm3 (ml)/min.
Тези условия са подходящи за хидрохинон (J.Firth and I.Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.). ХХХVIII. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА 2-ФЕНОКСИЕТАНОЛ, 1-ФЕНОКСИПРОПАН-2-ОЛ, МЕТИЛ, ЕТИЛ, ПРОПИЛ, БУТИЛ И БЕНЗИЛ 4-ХИДРОКСИБЕНЗОАТ В КОЗМЕТИЧНИТЕ ПРОДУКТИ. А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ 1. Област на приложение
Методът се отнася до тънкослойнохроматографска процедура, която в комбинация с методиката за определяне, описана в част Б, позволява идентификацията на 2-феноксиетанол, 1-феноксипропан-2-ол, метил, етил, пропил, бутил и бензил 4-хидроксибензоат в козметичните продукти.
2. Принцип
Консервантите се извличат от подкислена козметична проба с ацетон. След филтруване ацетоновият разтвор се смесва с вода и мастните киселини се утаяват в алкална среда като техни калциеви соли. Алкалната смес (ацетон/вода) се обработва с диетилов етер за отстраняване на липофилните вещества. След подкисляване консервантите се екстрахират с диетилов етер. Аликвотна част от диетилетерния екстракт се накапва върху плака, покрита с тънък слой силикагел. След проявяване плаката се наблюдава под УВ светлина и петната се оцветяват с реактива на Millon.
3. Реактиви
3.1. Общи положения.
Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а), а водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.
3.10. Реактив за оцветяване на Millon. Реактивът на Millon (живачен II нитрат) е в наличност в търговската мрежа (Fluka 69820).
3.11. 2-феноксиетанол.
3.12. 1-феноксипропан-2-ол.
3.13. Метил 4-хидроксибензоат (метилпарабен).
3.14. Етил 4-хидроксибензоат (етилпарабен).
3.15. n-Пропил 4-хидроксибензоат (пропилпарабен).
3.16. n-Бутил 4-хидроксибензоат (бутилпарабен).
3.17. Бензил 4-хидроксибензоат (бензилпарабен).
3.18. Стандартни разтвори.
За всяко от стандартните вещества (3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 и 3.17) се приготвя 0,1 % (М/V) разтвор в метанол.
3.19. Разтворител за проявяване на хроматограмата (подвижна фаза). Смесват се 88 обема n-пентан (3.4) и 12 обема ледена оцетна киселина (3.6).
4. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване и:
4.1. Водна баня с възможност за поддържане на температура 60 °С.
4.2. Съд за проявяване на хроматограмата (хроматографска вана).
4.3. Източник на УВ светлина, 254 nm.
4.4. Плаки за тънкослойна хроматография, 20 x 20 cm, покрити с 0,25 mm силикагел 60F254 с концентрирана зона (Merck № 11798, Darmstadt или еквивалентни).
4.5. Пещ с възможност за поддържане на температура 105 °С.
4.6. Сешоар за коса със сух въздух.
4.7. Ролка за нанасяне на реактива на Millon с дължина около 10 cm, външен диаметър около 3,5 cm и дебелина на вълнения пласт 2 до 3 mm (виж забележката под т. 5.2).
4.8. Колби стъклени със запушалки и обем 50 cm3 (ml).
4.9. Електрическа плоча с терморегулатор и настройка на температурата около 80 °С. За получаване на равномерно разпределение на температурата плочата се покрива с алуминиева пластина с размери 20 x 20 cm и дебелина около 6 mm.