Глава 2: Б Е Л Т Ъ Ц И 2.3. Връзка между белтъчната структура и биологичната функция

Структурата и промени в структурата на белтъци са решаващи за функциите на белтъците. Това се илюстрира с примери за кислород-пренасящите белтъци миоглобин и хемоглобин, за колаген (главният структуробразуващ белтък) и за имуноглобулините (защитни антитела).

Глобуларните кислород-свързващи белтъци миоглобин и хемоглобин имат много близка вторична и третична структура. Тя осигурява подходящо обкръжение за еднаквия за двата белтъка хем (Fe-порфиринов комплекс), който свързва кислорода. Fe²⁺ йон в хема е координационно свързан към четирите N атоми от порфириновия пръстен и към N атом от Хис F8 (проксимален Хис). В окислено състояние шестата лиганда е О₂, вмъкнат между Fe²⁺ йон и Хис Е7 ( дистален Хис).

Кривите за асоциация/дисоциация на кислород отразяват различията в свързването и отдаването на кислород от мономера Mb (с третична структура) и тетрамера Hb (с четвъртична структура) при различно парциално налягане на кислорода (рО₂). Кривата за Мb е правоъгълна хипербола. Mb в мускулите лесно свързва отделения от Нb О₂, съхранява го и го предава на митохондриите. Свързването не зависи от рН, СО₂ и 2,3-бисфосфоглицерат.

Кривата за Нb е сигмоида и това е свързано с четвъртичната му структура. Свързването на О₂ към първата субединица води до конформационни промени в останалите субединици, което улеснява свързването му. Този ефект се означава като положителна кооперативност. В белите дробове рО₂ е около 90-100 mm Hg и там Hb е максимално наситен с О₂. В тъканите рО₂ е от около 40 mm Hg, а в капилярите - около 20 mm Hg. Тетрамерната структура позволява много по-голямо отдаване на О₂ при по-ниски рО₂ отколкото е възможно при единичната верига на Mb.

Повишеното съдържание на СО₂ и протони в тъканните капиляри улеснява отделянето на О₂ от оксиHb. Обратно, повишеното съдържание на О₂ в белодробните капиляри улеснява отделянето на СО₂ и протони от Hb. Тези взаимозависимости се означават като ефект на Бор.

НbА свързва отрицателно-заредения 2,3-бисфосфоглицерат в празнината между четирите субединици и това снижава афинитета на Hb към О₂. В свързването участват три положително заредени групи от всяка -субединица, една от които е Хис21. Феталният HbF вместо  вериги съдържа  вериги. В  веригите Хис21 е заменен със Сер. Поради това НbF има по-нисък афинитет за 2,3-фосфоглицерат и последният не инхибира свързването на О₂ към НbF. Това позволява HbF да свързва лесно О₂, освободен от майчиния HbA.

Колагенът е най-застъпеният белтък в нашето тяло, съставна част на екстрацелуларния матрикс. Известни са досега 30 различно кодирани полипептидни вериги, които при своето комбиниране дават 19 типа колаген, различната структура на които осигурява различните им функции.

Здравината на колаген тип I се обуславя от уникалния аминокиселинен състав и характерната първична структура с повтаряща се последователност от (Гли-X-Про/Хип). Всеки трети остатък е глицин. Има и хидрокси-пролин и хидрокси-лизин, получени чрез посттранслационни модификации. Тази първична структура предопределя спирала с ляв ход с параметри, отлични от тези на -спиралата. Три полипептидни вериги с ляв ход образуват устойчива на развиване тройна суперспирала с десен ход, наречена тропоколаген, който е основната структурна единица на колаген. Трите вериги са в близък контакт и се свързват чрез водородни връзки. Само глицин, най-малката аминокиселина, приляга по размери в сърцевината на суперспиралата. Това обяснява защо глицин е на всяка трета позиция.

Вътреклетъчните посттранслационни модификации на проколаген са условие за образуване на тройната спирала. Извън клетките от проколаген се отцепват N- и С- крайните пропептиди. Получените тропоколагенови молекули се свързват една с друга и образуват колагенови фибрили. В тях всяка тропоколагенова молекула се отмества с около 23 % от своята дължина по отношение на съседните. Колагеновите фибрили се пакетират в колагенови влакна. В техните рамки продължава зреенето на колаген, водещо до по-нататъшно усилване здравината на колаген чрез образуване на стабилни ковалентни напречни връзки, усилващи якостта на влакната.

Имуноглобулините, наричани антитела, са защитни белтъци, които разпознават и свързват чужди за организма макромолекули, след което ги бележат и предават на фагоцитите за разрушаване. Всеки имуноглобулин се състои от две леки (L) и две тежки вериги (H), свързани помежду си чрез дисулфидни връзки. Известни са пет класа имуноглобулини: IgG, IgМ, IgА, IgE, IgD.

Всеки човек може да произвежда антитела срещу 10⁶ [1] до 10⁹ [16] антигени. Генерирането на такъв огромен брой антитела осигурява ефикасна защита срещу чужди макромолекули.

Структурата на глобуларните белтъци миоглобин (Mb) и тетрамера хемоглобин (Hb) е идеално пригодена за изпълнение на функциите им. Hb пренася О₂ от белите дробове до тъканите, а обратно СО₂ и протони. Mb съхранява О₂ в мускулите и го пренася до митохондриите. За целта Mb трябва да може да свързва О₂ добре при ниското рО₂ в тъканите, при което Hb освобождава кислород.

И двата белтъка свързват О₂. Почти идентичната вторична и третична структура на мономера Mb и на субединиците на тетрамера Нb осигурява подходящо обкръжение за желязо-порфириновия пръстен (хем), който е пряко ангажиран в свързването на О₂. Без хем веригата се денатурира и не може да свързва кислород. Полипептидната верига е така нагъната в пространството, че повечето от хидрофобните остатъци са във вътрешността на молекулата, а полярните са по нейната повърхност. Fe²⁺ йон в хема е координационно свързан към четирите N атоми от порфириновия пръстен и към N атом от Хис F8 (дистален Хис). В окислено състояние шестата лиганда е О₂, вмъкнат между Fe²⁺ йон и Хис Е7 (проксимален Хис). Плоскостта на хема е разположена във хидрофобна гънка близо до повърхността, където Fe²⁺ йон е защитен от окисление. Mb и Hb без хем или с окислен Fe³⁺ йон в хема (метмиоглобин и метхемоглобин) не могат да свързват кислород.

Тези криви отразяват различията в свързването и отдаването на кислород от мономера Mb (с третична структура) и тетрамера Hb (с четвъртична структура) при различно парциално налягане на кислорода (рО₂). Р₅₀ е това рО₂, при което белтъкът е наситен наполовина с О₂. За миоглобин Р₅₀ = 2.8, а за хемоглобин Р₅₀ = 26.

Кривата за Мb е правоъгълна хипербола (фиг. 2-16). При ниското рО₂ в мускулите (20-40 mm Hg) около 90 % от Mb e наситен с О₂ и не го отдава. Едва когато рО₂ спадне към 5 mm Hg, миоглобинът започва да отдава О₂ на митохондриите.

Фиг. 2-16. Криви на асоциация/дисоциация на кислород от миоглобин и хемоглобин в зависимост от парциалното му

За разлика от него, хемоглобин освобождава по-лесно О₂ в тъканите. Кривата за Нb е сигмоида и това е свързано с четвъртичната му структура. В дезокси-състояние конформацията на тетрамера Hb се означава като T форма (от англ. tight). Свързването на О₂ към първата субединица води до конформационни промени в останалите субединици, което улеснява свързването му от тях. Този ефект се означава като положителен кооперативен ефект на свързване. Конформацията на окси-Hb се означава като R форма (от англ. relaxed). В белите дробове рО₂ е около 90-100 mm Hg и там Hb е максимално наситен с О₂. В тъканите рО₂ е около 40 mm Hg, а в капилярите - около 20 mm Hg. Свързването на веригите в тетрамер позволява много по-голямо отдаване на О₂ при тези по-ниски рО₂ отколкото е възможно при единичната верига на Mb.

Концентрациите на СО₂, протони и 2,3-бисфосфоглицерат не повлияват свързването на О₂ към Mb в тъканите, но за Hb влиянието на тези три ефектора се описва с т. н. ефект на Бор. Повишеното съдържание на СО₂ и протони в тъканите, както и наличието на 2,3-бисфосфоглицерат изместват кривата за Hb надясно, което улеснява отделянето на О₂ от оксиНb в тъканите. Обратно, повишеното съдържание на О₂ в белите дробове улеснява отделянето на СО₂ и протони от Hb.

HbA (₂₂) свързва отрицателно-заредения 2,3-бисфосфоглицерат в централната празнина между четирите субединици (фиг. 2-17). Това снижава афинитета на Hb към О₂ и стабилизира дезокси-формата Т. В свързването на отрицателно-заредения 2,3-бисфосфоглицерат участват по три положително заредени групи от всяка -субединица (амино-група от N-крайния Вал, Лиз ЕF6 и Хис21).

Феталният HbF (₂₂) съдържа две  и две  вериги (вместо 2  вериги). В  веригите на HbF Хис21 е заменен със Сер. Поради тази структурна разлика НbF има по-нисък афинитет за 2,3-фосфоглицерат и последният влияе много по-слабо върху свързването на кислород към НbF (не го инхибира) За HbA P₅₀ = 26 mm Hg, а за HbF P₅₀ = 20 mm Hg. Това позволява HbF да извлича (да свързва лесно) О₂, освободен от майчиния HbA.



Фиг. 2-17. Свързване на 2,3-бисфосфоглицерат (2,3-БФГ) към двете -субединици на деоксиHbА посредством електростатични взаимодействия. Вляво - формула на 2,3-бисфосфоглицерат с пет отрицателни заряди; Вдясно - йонни връзки между петте отрицателно заредени групи на 2,3-БФГ и положително заредените Лиз ЕF6, Вал NA1 и ХисН21 от всяка от двете -субединици.

Глава 2: Б Е Л Т Ъ Ц И
2.3. Връзка между белтъчната структура и биологичната функция


2.3.3. Колагени

2.3.3.1. Различни типове колаген

Колагенът е най-застъпеният белтък не само в екстрацелуларния матрикс, но и въобще в тялото. Той съставлява около 25 % от белтъците в тялото, като концентрацията му варира: 4 % в черния дроб, 10 % в белите дробове, 12-24 % в аортата, 50 % в хрущялите, 64 % в корнеата, 23 % в кортикалните кости, 74 % в кожата [16]. Известни са засега 30 различни полипептидни вериги за колаген, всяка кодирана от различен ген. В зависимост от комбинацията им и от съдържанието на допълнителни въглехидратни съставки, са установени 19 типа колаген [17]

Различната структура на тези типове колаген осигурява различните им функции. В очната корнея колагенът е прозрачен, в костите и зъбите той съдържа калциево-фосфатен полимер хидроксилапатит, кожният колаген е с хлабави и гъвкави влакна. Характерната за колаген тип I тройна спирала се среща в повечето от другите типове колаген, но дължината є може да варира, а освен това някои от колагените съдържат и глобуларни участъци в N- и C-краищата.

Глава 2: Б Е Л Т Ъ Ц И
2.3. Връзка между белтъчната структура и биологичната функция


2.3.3. Колагени

2.3.3.2. Структура на колаген, тип I

Колаген тип I има уникален аминокиселинен състав (вж табл. 2-4). От общо 1050 остатъци в полипептидната верига 33 % са глицин, т. е. всеки трети остатък е глицин. Освен това има и необичайни остатъци: 3-хидрокси-пролин, 4-хидрокси-пролин и 5-хидрокси-лизин, получени чрез посттранслационни модификации (вж т. 2.5.6). По протежение на веригата се повтаря последователността (Гли-X-Про/Хип), където Хип е хидроксипролин, а Х - коя да е аминокиселина [18].

Високият процент на глицин и пролин и наличието на хидроксипролин и хидроксилизин не е случаен. Характерната първична структура предопределя възникването на особен тип спирала с ляв ход, (подобна на спиралата, образувана от синтетичен полипролин (т.н. полипролинова спирала, тип II, чиито параметри са сравнени в табл. 2-3 с тези на други вторични структури). Този тип спирала не съдържа вътрешно верижни водородни връзки. Три полипептидни вериги (две ₁ и една ₂ вeриги) с ляв ход образуват тройна суперспирала с десен ход (фиг. 2-18), наречена тропоколаген, който е основната структурна единица на колаген. Трите вериги са в близък контакт, както личи от напречния пререз. Веригите се свързват една с друга чрез водородни връзки. Само глицин, най-малката аминокиселина, приляга по размери в сърцевината на суперспиралата. Това обяснява защо глицин е на всяка трета позиция.

 Фиг. 2-18. Структура на проколаген, тропоколаген и колагенови фибрили (тип I).

Тройната суперспирала е много устойчива на развиване, тъй като тя е с десен ход, а съставящите я три спирали - с обратен ляв ход (принцип, използван и при изработване на здрави стоманени конструкции).

Тропоколагеновите молекули се обединяват във фибрили, като всяка тропоколагенова молекула се отмества с около 23 % от своята дължина по отношение на съседните. Между отделните молекули остава празни пространства, в които в костите се отлага хидроксилапатитни кристали.

Глава 2: Б Е Л Т Ъ Ц И
2.3. Връзка между белтъчната структура и биологичната функция


2.3.3. Колагени

2.3.3.3. Значение на следсинтетичната обработка (зреене) на колаген за здравината на колагеновите фибрили

Първоначално синтезираните -вериги в ендоплазмения ретикулум са под форма на препроколаген, съдържащи в N-края сигнален "пре"-пептид, насочващ полипептидната верига във весикулите на ендоплазмения ретикулум. След отделянето на сигналния пептид се получава проколаген, който съдържа пропептиди (в N-края 150 остатъка и 250 остатъка в С-края).

Вътреклетъчните посттранслационни модификации на проколаген започват с хидроксилиране на пролин и лизин. Определени хидроксилизинови остатъци се гликозилират с галактозни или глюкозни остатъци (създават се О-гликодидни връзки). Определени аспарагинови остатъци се гликозилират (създават се N-гликозидни връзки). Образуват се дисулфидни връзки (вътрешно верижни в N-пропептидите, а в С-пропептидите вътрешно-верижни и междуверижни).

Описаните модификации са условие за образуване на тройната спирала. След това проколагенът се транспортира до апарата на Голджи, където завършва О-гликозилирането и проколагенът се секретира извън клетките.

Извън клетките от проколаген се отцепват N- и С- крайните пропептиди. Получават се тропоколагенови молекули, които се свързват една с друга, и образуват колагенови фибрили. В тях всяка тропоколагенова молекула се отмества с около 23 % от своята дължина по отношение на съседните. Колагеновите фибрили се пакетират в колагенови влакна. В техните рамки продължава зреенето на колаген, водещо до по-нататъшно усилване здравината на колаген. Лизил оксидаза катализира окислително дезаминиране на -амино-групи на лизин и хидроксилизин до алдехиди. Тези реактивни алдехиди реагират помежду си (алдолна кондензация) или с неокислени лизини дават Шифови бази. Чрез тези две реакции се формират стабилни ковалентни напречни връзки, усилващи якостта на влакната.

Глава 2: Б Е Л Т Ъ Ц И
2.3. Връзка между белтъчната структура и биологичната функция


2.3.4. Имуноглобулини

Имуноглобулините, наричани антитела, са защитни белтъци, които разпознават и свързват чужди за организма макромолекули (белтъци, нуклеинови киселини, полизахариди), след което ги бележат и предават на фагоцитите за разрушаване. Антитела се образуват и срещу ниско-молекулни вещества, ако са прикрепени към макромолекула. Групата, която се разпознава от антитялото, се нарича антигенна детерминанта или епитоп.

Имуноглобулините се синтезират от плазмени клетки, произлизащи от В-лимфоцитите. Известни са пет класа имуноглобулини (табл. 2-5).

На фиг. 2-19 е представена схематично структурата на имуноглобулин от най-разпространения клас IgG. Всеки имуноглобулин се състои от две леки (L от англ. light) и две тежки вериги (H от англ. heavy), свързани помежду си чрез дисулфидни връзки.

Фиг. 2-19. Схема за структурата на имуноглобулин от клас IgG. Молекулата съдържа две тежки вериги (H) и две леки вериги (L). СH и VH - константен (непроменлив) и вариабилен (променлив) участък в тежката верига; СL и VL - константен и вариабилен участък в леката верига; СНО - въглехидратна съставка. Хипервариабилните участъци са в жълт цвят, а антиген-свързващите участъци са означени със стрелки.

Вариабилните места за свързване на антигена са специфични, а константните участъци са еднакви за всички имуноглобулини в даден клас. <з>Останалите четири класа имуноглобулини се отличават от IgG по вида на тежката верига, по броя на мономерите, по застъпеността в серума (вж табл. 2-5) и по функциите, които изпълняват. Секретираният имуноглобулин може да бъде под форма на мономер (М), димер (D), тример (T), или пентамер (P). IgD няма секреторна форма.

IgG са основният и най-масово представен в кръвта клас антитела. Чрез Н-веригите те се прикрепват към рецептори на фагоцити, които поглъщат и разрушават свързания от IgG антиген (микроорганизъм). IgG могат да се свързват и към белтъци от системата на комплемента и да ги активират. Единствено IgG могат да преминават през плацентата от майката в плода.

IgМ са първите антитела, които се синтезират в В-лимфоцитите. При диференциация на В-лимфоцитите могат да се образуват различни антитела срещу един и същи антиген. В резултат на разместване на гени в ДНК L-вериги от IgМ могат да се прегрупират с Н-вериги от друг клас и така да се получат и други имуноглобулини IgA, IgG или IgE, които са с еднаква антигенна специфичност като изходния IgM ( този процес се нарича превключване от клас в клас).

IgA се съдържат в слюнка, сълзи, мляко, чревни секрети като мономери, димери или тримери. IgE участват в алергични реакции с увеличено освобождаване на хистамин. Участват и в защитата срещу чревни паразити.

Функцията на IgD е неясна.

Всеки човек може да произвежда антитела срещу 10⁶ [1] до 10⁹ [19] антигени. Генерирането на такъв огромен брой антитела осигурява ефикасна защита срещу чужди макромолекули. То е възможно поради комбинацията и пренареждането на различни структурни гени, отговорни за синтезата на вариабилните участъци в Н и L веригите ( виж глава 15).

Както бе посочено (т. 2.2.2, фиг. 2-5 и 2-6), инсулин се синтезира като по-високомолекулен предшественик препроинсулин. Сигналният пептид в N-края (с 23 остатъци) е необходим за насочване на полипептидната верига към цистерните на ендоплазмения ретикулум, след което той се отделя, тъй като повече не е необходим. Получаващият се проинсулин съдържа от N-към С-края фрагментите, съответстващи на В-веригата, С-пептида (свързващ пептид) и А-веригата. Ролята на С-пептида е да осигури правилна конформация, за да могат да се образуват правилните дисулфидни връзки (фиг. 2-7 и фиг. 2-6). След това С- пептид, заедно с още два дипептида, бива отделен. Активният инсулин има кратък полуживот в кръвта (3-5 минути). Наличието на дисулфидни връзки позволява лесно и бързо дезактивиране на хормона чрез тяхната редукция под действие на специфичен ензим (глутатион-инсулин трансхидрогеназа).