Флора Венциславова Цветанова Получаване на 2,3-бутандиол от нишесте чрез рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniae G31 А

1. 
   Изучаване влиянието на различни компоненти на хранителната среда при ферментация на глюкоза от K. pneumoniae G31
   

Резултатите показват, че най-подходяща за щама и продуцирането на 2,3-БД е среда М7 и нейните производни среди - М7а, М7b, M7c. Устаноява се, че глюкозата е напълно изконсумирана за 24 часа и се достигат най-високи концентрации на диола - съответно 20.89, 19.70, 19.30 и 20.72 g/L (табл.3). Разликата между среда М7а, М7b и М7c е в концентрацията на дрождевия екстракт и пептона. Среда М7c е със същия състав като този на среда М7, но с добавени ZnSO₄ (0.001 g/L) и CaCl₂ (0.01 g/L). От долупосочените резултати е видно, че колкото по-висока е концентрацията на дрождевия екстракт в хранителната среда, толкова по-голямо е превръщането на глюкозата в 2,3-БД. Количеството на добавения пептон обаче не оказва съществено влияние върху добива на диола. Добавянето на ZnSO₄ и CaCl₂ не влияе в голяма степен върху крайната концентрация на 2,3-БД (20.72 срещу 20.89 g/L), нито върху степента на конверсия на глюкозата в 2,3-БД.

Генът amyL от B. licheniformis 44 MB82/G е амплифициран като PCR–фрагмент, като е използвана двойка праймери amyF и amyR, клониран във вектор pJET2.1 с тъп край, получавайки се конструкта pJETamyBL (фиг.2).

Генът се състои от 1,539 двойки бази (фиг.3), започва с кодон ATG и кодиращ полипептид, състоящ се от 512 аминокиселини с молекулно тегло 58.5 kDa. Той съдържа сигнален пептид с дължина 29 аминокиселини. Протеинът притежава съхранената доменна структура, типична за амилазите. Каталитичната последователност от три аминокиселини „DED” (Asp, Glu, Asp) е на позиции съответно 260, 290 и 357. Аминокиселинните остатъци 42, 99, 134, 225, 227, 258, 260-264, 290, 292, 293, 319, 356 и 357 формират активния център на ензима. Остатъците Asn и Asp (N, D, D) са локализирани на позиции 133, 223 и 229, формирайки възможно Ca – Na - Ca място за свързване.



Фиг.2. Схема на клониране на ген amyL на Bacillus licheniformis във вектор pJET1.2 blunt.



Фиг. 3. PCR амплификация на фрагмент, съдържащ гена amyBL на Bacillus licheniformis.

Данните от нуклеотидната последователност са депозирани в базата данни на NCBI Gen Bank под номер KF261567.1.

Важно условие, което предварително трябва да се вземе предвид при избора на вектор, осигуряващ експресията, е да се знае природната резистентност на дивия щам K. pneumoniае G31 към антибиотици. Установено е, че щамът е резистентен към всички проверени концентрации на ампицилин (50 – 200 µg/mL), тетрациклин (10 – 50 µg/mL) и еритромицин (15 – 45 µg/mL). Проявява чувствителност към високи концентрации на хлорамфеникол (50 µg/mL), но слабо се развива на 25 - 35 µg/mL. Щамът е силно чувствителен към канамицин и по тази причина този антибиотик е използван като селективен маркер.

За клониране на гена amyL е избран вектора pCR2.1 – TOPO, съдържащ гени за резистентност към канамицин и ампицилин, както и сайтове за рестриктази XhoI и XbaI.

Конструктът pJETamyBL е рестрициран с рестриктази XhoI и XbaI, а получените фрагменти са разделени с гел – електрофореза. Фрагментът, съдържащ amyL е пречистен и клониран във вектора pCR2.1 – TOPO (фиг. 4).

Полученият вектор е означен като pCRamyBL (фиг.5). Той е с големина 5502 двойки бази, съдържа гена amyL под контрола на lac–промотор, както и гени за резистентност към канамицин и ампицилин. С pCRamyBL е извършена трансформацията на E.coli DH5α.

От получените трансформанти на E.coli е изолирана плазмидна ДНК, след което е извършена трансформация на K. pneumoniае G31.

Получените рекомбинантни клетки са посяти на твърда среда в петри, съдържаща 0.5 % нишесте и са наблюдавани зони (фиг. 6), в които нишестето е разградено, което потвърждава успешната експресия на гена amyL под контрола на lac–промотор.



Фиг.6. Жълти зони, образувани около колониите на клетките K. pneumoniае , в които клонирания фрагмент amyL се експресира

Щамът K. pneumoniае G31 е трансформиран с вектора pCRamyBL, изолиран от колония на E. coli DH5α с положителна експресия на гена amyL (фиг. 7). Избран е рекомбинантният щам K. pneumoniае G31 – А, който демонстрира най-голяма зона, формирана от разградено нишесте върху агаровата среда.

Амилазната активност и формирането на продуктите при ферментацията на нишесте от родителския щам K. pneumoniае G31 и рекомбинантния щам K. pneumoniае G31 – А са изучени при серия от периодични ферментационни процеси. Като хранителна среда е използвана предварително оптимизираната за получаване на 2,3-БД среда M7d. Тя съдържа йони на специфични микроелементи (Mn²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺), ацетатни йони, фосфати и азотни източници, необходими за повишаване на синтезирането на 2,3-БД от K. pneumoniае, осигурявайки минимално натрупване на странични продукти (Garg and Jain, 1995; Syu, 2001).

Дивият щам K. pneumoniае G31 се развива на среда с нишесте (поради наличие на дрождев екстракт, пептон и други елементи на средата), но не показва амилазна активност. 2,3-БД не се формира. За разлика от него, рекомбинантният щам, дори при липса на каквито и да е компоненти, повишаващи амилазната секреция, хидролизира ~35 g/L нишесте за 48 часа и синтезира 7.3 g/L 2,3-БД. Скоростният профил на разграждането на нишесте с начална концентрация 40 g/L и получените от K. pneumoniае G31 – А метаболити са показани на фиг.8.



Фиг.8. Кинетика на разграждането на нишесте и формирането на продуктите при периодичен ферментационен процес с рекомбинантния щам K. pneumoniае G31 – А; начална концентрация на нишесте – 40 g/L, 200 rpm, неконтролирано pH, 37 ^оС.

4.3. Влияние на IPTG върху синтезирането на 2,3-БД

Поради това, че транскрипцията на гена amyL се осъществява под контрола на lac-промотор, е изследвано влиянието на добавянето на различни концентрации на индуктора IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), неметаболизиращ се аналог на лактозата. Добавени са три различни концентрации на IPTG (0.1, 1 и 1.5 mM) в началото на процеса. В табл. 5 са представени степента на разграждането на нишестето, амилазната активност, общото количество на извънклетъчния белтък и концентрациите на синтезираните метаболити, съответно с добавен индуктор и при липса на такъв. Посочени са резултатите на 24-тия час от ферментационния процес.

От таблицата се вижда, че добавянето на IPTG оказва положителен ефект по отношение на хидролизата на нишестето чрез увеличаване на експресията на гена amyL. С повишаване концентрацията на IPTG, амилазната активност се повишава почти два пъти от 7.95 U/mL (без добавяне на индуктора) до 13.44 U/mL (1.5 mM IPTG). Количеството на продуцираните 2,3-БД и другите течни метаболити на 24-тия час от ферментационния процес показват, че концентрации на индуктора над 1 mM не оказват съществено влияние върху процеса. Поради това, всички следващи експерименти са проведени с добавяне на 1 mM IPTG към хранителната среда.

4.4. Влияние на Са²⁺ върху получаването на 2,3-БД

Известно е, че Са²⁺ играят ролята на силен кофактор за дейността на α–амилазите. Поради това, с цел допълнително увеличаване на амилазната активност и съответно добив на 2,3-БД, към средата, съдържаща 1 mM IPTG са добавени и Са²⁺ под формата на CaCl₂^.2H₂O в концентрации 0.01, 0.1 и 0.2 g/L. В сравнение със стойностите, получени при ферментационните процеси без добавяне на калциеви йони, добавянето на 0.01 g/L CaCl₂^.2H₂O оказва незначително влияние върху амилазната активност (16.68 U/mL), води до слабо намаляване на крайната концентрация на 2,3-БД (4.54 g/L) и леко повишава продуцирането на ацетоин и етанол. Десетократното и двадесетократното увеличаване на Са²⁺ в средата води до съществено повишение в амилазната активност, която достига 65 - 68 U/mL на 24-тия час от ферментационния процес. Неочаквано, колкото по-висока е амилазната активност, толкова по-ниски са концентрациите на всички продукти на ферментационния процес (табл.6). При концентрации на CaCl₂^.2H₂O 0.1 и 0.2 g/L след 24 часа ферментация се получават съответно 2.46 и 0.47 g/L 2,3-БД.

Количественото определяне на междинните съединения от хидролизата на нишесте показва, че по–високите концентрации на CaCl₂^.2H₂O водят до натрупване на олигозахариди със степен на полимеризация Dp2-Dp5. Най-голямо е акумулирането на малтопентаози (Dp 5) при процеса с 0.2 % CaCl₂^.2H₂O. В този случай за 24 часа ферментация се натрупват 11.2 g/L малтопентаоза (фиг. 9а), 5.5 g/L малтотриоза (фиг. 9b) и 1.8 g/L малтоза (фиг. 9c). Получените при тези експерименти стойности значително се различават от резултатите при процесите, проведени без добавка на калциеви йони, при които количеството на олигозахаридите със степен на полимеризация по–ниска от Dp 8 е пренебрежимо малко във всеки един момент.