Флора Венциславова Цветанова Получаване на 2,3-бутандиол от нишесте чрез рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniae G31 А

b

С цел да се повиши пропускливостта на клетъчната мембрана и по този начин амилазния ензим да може безпрепятствено да излезе от бактериалната клетка, преди култивиране към хранителната среда са добавени различни концентрации глицин. За да се определи оптималната му концентрация върху процеса се експериментира с различни концентрации – 0.1 %, 0.3 %, 0.5 %, 0.6 %, 0.7 %. Влиянието на глицина върху извънклетъчната амилазна активност и получаването на 2,3-БД е отразено в табл.7.

От таблицата става ясно, че най-висока концентрация на диола е достигната при добавяне на 0.5 % глицин – 10.54 g/L (което отговаря на 41.5 U/mL амилаза и 198 U/mg специфична активност), а най–ниска, при добавяне на 0.7 % глицин – 1.61 g/L 2,3-БД.

На фиг. 10а е илюстрирана кинетиката на хидролизата на нишесте и формирането на главния продукт по време на този процес. Всички 40 g/L нишесте са напълно разградени между 19-тия и 24-тия час на ферментационния процес, което съвпада и с пика в концентрацията на 2,3-БД. Ацетоинът е регистриран в забележими количества около 11-тия час от процеса. Общото количество на 2,3-БД и ацетоина леко се повишава около края на процеса, достигайки 12.5 g/L на 48-ия час, като концентрацията на ацетоина непрекъснато се увеличава за сметка на тази на 2,3-БД.

Образуването на киселините и етанола е представено на фиг. 10b. Тяхното количество се изменя в процеса на ферментацията на нишесте: концентрациите на млечната и сукциновата киселина нарастват до 24-тия час на процеса, след което спадат, като млечната киселина изцяло се разгражда. Оцетната киселина се натрупва през първите 10 часа на процеса, след което намалява, достигайки минимална стойност-0.6 g/L (едновременно с рязкото увеличение в концентрацията на 2,3-БД) и равномерно се увеличава до края на процеса. Концентрацията на етанола също равномерно се повишава. Амилазната активност нараства до края на процеса (фиг. 10с), както и общото извънклетъчно белтъчно съдържание, което вероятно се дължи на клетъчен лизис. pH на културата се понижава от 7.0 до 6.3 до 8-ия час от процеса и отново се повишава до 6.5 в края.

a

с

Най–високата крайна концентрация на 2,3-БД (53.8 g/L) е достигната при процеса с начална концентрация на нишесте 200 g/L (табл.8), което е изцяло метаболизирано след 90 часа ферментация.

Кинетиката на усвояване на субстрата и продуциране на диоли при процесите с начална концентрация на нишесте 200 g/L са показани на фиг. 11а. След 120 часа ферментация, максималната концентрация на 2,3-БД е 53.8 g/L, a тази на ацетоина – 7.13 g/L. В краят на процеса са натрупани и други метаболити: оцетна киселина (6.31 g/L) и етанол (2.93 g/L). Техният дял остава нисък, което е индикация, че условията на култивиране благоприятстват формирането на диолите. Млечната и сукциновата киселина се формират в началото на процеса и след това се разграждат (фиг. 11b). Амилазната активност се повишава до 96-тия час на ферментационния процес и след това слабо се понижава (фиг. 11c). рН спада до ниски стойности в сравнение с ферментационните процеси с начална концентрация на нишесте 40 g/L и е със стойности около 5.7 в периода между 48-мия и 110-тия час.

a

c

На фигури 12 и 13 са показани кинетиките на разграждане на нишесте с начална концентрация съответно 100 и 300 g/L и натрупване на 2,3-БД.

100 g/L нишесте са изцяло метаболизирани за 30 часа, а 300 g/L, за 120 часа. Крайната концентрация на общото диолно съдържание (2,3-БД + ацетоин), получена при процесите с 200 и 300 g/L начални концентрации на нишесте е почти еднаква (60.9 – 61 g/L общо съдържание на диоли).

Независимо от използвания субстрат, 2,3-бутандиолът винаги се продуцира в смес от киселини и етанол, чието количество намалява добива му. В този смисъл, от ключово значение е подбирането на условия, при които максимално да се намали продуцирането им. Киселинността на средата и аерацията са най–важните фактори, насочващи метаболизма към продуциране на един или друг продукт в смесено–киселата ферментация. Повечето анаеробни процеси са съпътствани с образуване на органични киселини. По този начин по време на ферментационния процес средата се окислява, а растежа на клетки и конверсията на субстрата постепенно намаляват, тъй като бактериалната култура се инактивира от собствените си продукти.

Съставът на хранителната среда представлява фактор от съществено значение за ферментационния процес. Няма строго определена хранителна среда за производството на 2,3-БД поради това, че различните микроорганизми-продуценти на диола имат различни изисквания.

Като се вземат предвид получените експериментални резултати от глюкозната ферментция, се оказва, че най-важния компонент на хранителната среда, който влияе върху получаването на 2,3-БД е дрождевият екстракт. От проведените процеси става ясно, че този компонент чувствително повишава консумацията на глюкозата и съответно крайната концентрация на получения 2,3-БД. От друга страна, компонентът е скъп и повишава цената на продукта. Опитите да се замени дрождевия екстракт с пептон водят до намаляване на количеството на получения 2,3-БД.

Известно е, че метални йони като Fe²⁺, Mn²⁺ и Мg²⁺, използвани като кофактори повлияват в значителна степен производството на диола в ензимнозависимата реакция (Garg and Jain, 1995; Syu, 2001; Qin et. al., 2006). Получените експериментални резултати доказват, че добавката на Zn²⁺ под формата на ZnSO₄. 7H₂O повишава крайната концентрация на синтезирания 2,3-БД с 6 % (от 31.56 до 33.334 g/L), както и продуктивността – с 11 % (от 0.766 mol/mol до 0.851 mol/mol). Тези стойности са близки до получената максимална теоретична степен на превръщане.

Известни са два метаболитни пътя за разграждане на нишесте при дивия щам Klebsiella pneumoniae. Първият включва извънклетъчното му разграждане с пулуланаза, свързана с повърхността на клетката и последващо разкъсване на α–1,4–гликозидните връзки на линейните малтодекстрини. При вторият път нишестето се конвертира извънклетъчно до циклодекстрини (CDs), чрез което се преодолява външноклетъчната линеаризация от циклодекстриназата (cymH), а линейните малтодекстрини се включват в пътя за разграждане на малтозата. Като се има предвид локализацията в клетката на други нишесте–разграждащи ензими в Klebsiella, малтодекстрин-глюкозидазата се намира в цитоплазмата, малтохексахидролазата – в периплазменото пространство, а пулуланазата е свързана към външната клетъчна мембрана. Нито един от тези ензими не е извънклетъчен, дори никой от тях не може да натрупа значителни количества редуциращи захари или линейни малто-олигозахариди, които да могат да се редуцират до 2,3-БД (Gawande and Patkar, 2001).

Поради това, с цел да се постигне получаване на 2,3-БД чрез директна конверсия на нишесте, е избран подхода на хетероложната експресия. За най–подходящ е определен генът amyL от B. licheniformis. Анализите на неговата нуклеотидна последователност показват 100 % идентичност с гена amyL от B. licheniformis DSM 8785 и гена amyS от B. licheniformis NCIB 8061.

Хетероложната експресия на гени, изолирани от Грам-положителни бактерии създава доста усложнения при клонирането им в Грам-отрицателни гостоприемници. Сред тях са изборът на промотор и ефективния му контрол, подходящи последователности Shine-Delgarno, както и физичните бариери в клетката, подтискащи секрецията на белтък. Резултатите показват, че изборът на amyL от B. licheniformis в този смисъл е особено сполучлив. Поради това, че в Klebsiella pneumoniae G31 – A гена amyL е под контрола на lac–промотор от E. coli, се очаква неговата експресия да зависи от индуктора IPTG. Изненадващо, щамът Klebsiella pneumoniae G31 – A, не съдържащ клониран от E. coli lac-репресор също експресира в значителна степен гена amyL. Причината е, че рекомбинантният конструкт pCRamyBL съдържа lac–промотор от E. coli, но не носи гена lacl, кодиращ съответстващия му lac–репресор. Това води само до частична репресия на lac-промотора от хромозомния репресор на K. pneumoniae. Сравнени, аминокиселинните последователности на lac–репресорите от E. coli и K. pneumoniae, имат сходство между 96 и 98 %, което обяснява слабата репресия на lac–промотора от страна на lac–репресора на K. pneumoniae с конформационни несъответствия.

Често срещан проблем, наблюдаващ се при извънклетъчната белтъчна експресия от Грам-отрицателни бактерии е бариерата на цитоплазмената мембрана. Получените високи стойности на извънклетъчна амилазна активност навеждат на предположението, че сигналния пептид пренася амилазен ензим до периплазмата. Анализиранa, неговата аминокиселинна последователност разкрива наличието на участък с положително заредени аминокиселини, завършващ с азотен край (MKQQKRLYAR), последван от изключително дълъг хидрофобен “h”–участък (LLTLLFALIFLLPHSAAAA), за който е известно, че подобрява контакта между сигналния пептид и цитоплазмената мембрана (Ismail et. al., 2011). Извънклетъчната секреция на амилазата в културалната среда показва, че сигналния пептид на ензима е функционален в Klebsiella. Електрофорезата в полиакриламиден гел (SDS - PAGE) на супернатантата, не съдържаща клетки показва, че ензима притежава същото молекулно тегло като предполагаемото – 58.5 kDa (фиг.14).

Следващото препятствие, което съпътства секрецията на рекомбинантния белтък е външната клетъчна мембрана. Хетероложните белтъци обикновено се натрупват в периплазменото пространство. Правени са опити да се улесни секрецията им. Глицинът е често срещан компонент на хранителната среда, съдействащ за секрецията на рекомбинантните ензими в културалната среда на E. coli (Li et. al., 2009). Същата зависимост е наблюдавана и при експериментите с Klebsiella. Повишената извънклетъчна секреция на рекомбинантните ензими под действието на глицина може да бъде обяснено с повишената проницаемост на клетъчната мембрана. Като цяло, колкото по–високо е количеството на глицина, толкова по–висока е извънклетъчната амилазна активност. При концентрации на глицин по–високи от 0.6 % обаче, общото количество извънклетъчен белтък рязко се повишава поради клетъчния лизис, а специфичната амилазна активност се понижава.

По отношение на продуктивността на диолите, трябва да се отбележи, че резултатите, включени в настоящия дисертационен труд са първите публикувани, доказващи успешен процес на едновременно озахаряване и ферментация на нишесте до 2,3-БД. Рекомбинантният щам Klebsiella pneumoniae G31 – A е първия, способен да извърши едностъпална конверсия на нишесте до 2,3-БД и ацетоин във високи концентрации (табл. 8).

При хидролизата на нишесте с начална концентрация 200 g/L е достигнат 14 пъти по-висок добив (около 61 g/L общо диолно съдържание) от този, получен от нишесте чрез хомоложна експресия на други генетично манипулирани щамове на Klebsiella. За сравнение, рекомбинантния щам Klebsiella pneumoniae KG1 (pUC18K-amy) синтезира 3.8 g/L 2,3-БД и разгражда едва 20 g/L нишесте (Zheng et. al., 2008). Освен това, на високите крайни концентрации на диоли, получени с Klebsiella pneumoniae G31 - А съответства и висока продуктивност - 0.51-0.62 g/L/h. Тази продуктивност, въпреки че е постигната от много концентриран разтвор на нишесте, е значително по–висока, отколкото тази на рекомбинантния щам Klebsiella pneumoniae KG1 (pUC18K-amy) – 0.16 g/L/h (Zheng et. al., 2008). Степента на конверсия на нишесте в 2,3-БД също е много по–висока.

Общият добив на диоли е близък до този, получен при процеса на едновременно озахаряване и ферментация на грудки от земна ябълка - Jerusalem artichoke (Sun et. al., 2009) и целулоза, получена от царевични кочани (Cao et. al., 1997). Трябва обаче да се подчертае, че при тези експерименти озахаряването е проведено с киселини и промишлени ензими (инулиназа, целулази), предварителна обработка, която силно повишава разходите по процеса, докато в настоящия труд както хидролизата на нишесте, така и продуцирания 2,3-БД са получени едновременно в един и същ процес с продуцирането на ензима.

1. 
   Конструиран е рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniae G31 – A, в който е клониран ген за α–амилаза от Bacillus licheniformis под контрола на индуцируем промотор Plac.
   
2. 
   Установено е, че максимални нива на експресия на гена amyL в Klebsiella pneumoniae G31 – A се постигат при добавка на 1 mM IPTG.
   
3. 
   Установено е, че добавяне на кофактора Ca²⁺ в средата повишава амилазната активност, но поради натрупването на олигозахариди води до намаляване на крайната концентрация на 2,3-БД.
   
4. 
   Установено е, че добавянето на глицин към средата улеснява транспорта на екстрацелуларната α–амилаза през клетъчната стена, както и, че максимален добив на 2,3-БД се получава при добавяне на 0,5 % глицин.
   
5. 
   Рекомбинантният щам Klebsiella pneumoniae G31 – A е способен напълно да метаболизира високо концентрирани разтвори на нишесте – 20 % и 30 %.
   
6. 
   След метаболизиране на 200 g/L нишесте са получени 61 g/L диоли (53,8 g/L 2,3-БД и 7,1 g/L ацетоин), продуктивност – 0,51 g/Lh. Добив и продуктивност съответно 14 и 3 пъти по–високи от постигнатите до момента.
   

1. 
   Създадена е първата успешна биотехнология за директно получаване на 2,3-БД от нишесте чрез рекомбинантен щам.
   
2. 
   За първи път е постигната хетероложна експресия на α–амилаза с цел получаване на 2,3-БД.
   

Tsvetanova, F., Petrov, K., Beschkov, V. 2013. Influence of the different media compounds on 2,3-butanediol production in glucose fermentation. Journal of International Scientific Publications: Ecology and Safety, 7: 257-261.

Tsvetanova, F., Petrova, P., Petrov, K. 2014. 2,3-butanediol production from starch by engineered Klebsiella pneumoniae G31 – A. Appl Microbiol and Biotechnol 98: 2441-2451.

-IF 3,337, цитирания: 4.

-Награда за най – добра работа на млад български микробиолог през 2013 г.

УЧАСТИЕ В НАУЧНИ КОНФЕРЕНЦИИ

Tsvetanova, F., Petrov, K., Beschkov, V. 2013. Influence of the different media compounds on 2,3-butanediol production in glucose fermentation.