Квантова физика електронен микроскоп

В тази формула h е универсална постоянна, наречена константа на Планк. На основата на този модел Макс Планк е извел формула за R_o, която графически напълно съвпаднала с известната експериментална крива (Фиг. 7.2.1). Допълнително, от тази формула той е извел законите на Вин и на Стефан-Болцман и е изчислил с висока точност константите на Вин (b) и на Стефан-Болцман ().

Въпреки този грандиозен успех, дълго време след това се е считало, че постулатите за квантовано излъчване на светлината са само един формален начин за обяснение на експерименталната крива, който не отразява действителния механизъм на топлинното излъчване. Получените по-късно особености на емисионните и абсорбционни спектри на атомите и молекулите, законите на фотоефекта, както и законите на фотохимичните и фотобиологичните процеси са потвърдили, че светлината действително се излъчва на порции и се разпространява и поглъща на порции (фотони). Този извод е залегнал като основа на съвременните представи за квантовата физика на светлината и атомите.

7.3. Поглъщане на светлината от атоми и молекули. Енергийни нива и абсорбционен спектър на атоми и молекули. Закон на Буге-Ламберт-Беер. Приложение на спектрофотометрията в медицината.

Ако сноп монохроматична светлина с интензивност I_o и дължина на вълната  пада върху разреден разтвор в кювета с дебелина d, атомите и молекулите на веществото поглъщат част от преминаващото светлиното лъчение и то отслабва (Фиг. 7.3.1). Нека приемем, че разтворът само поглъща светлината без разсейване, което е често срещан случай. Обикновено погълнатата енергия се превръща в топлина. Ако светлината има висока интензивност могат да настъпят и изменения на поглъщащите частици - дисоциация, йонизация, фотохимични превръщания.

Отслабването на светлината от поглъщащи частици с концентрация c, разтворени в непоглъщащ разтворител, се дава със закона I = I_o.exp (-.c.d), известен като закон на Буге, Ламберт и Беер. Тук  се нарича показател на поглъщане или екстинкционен коефициент. В практиката се измерва отношението I/I_o = T, наречено пропускливост (%) или величината 1 - Т = A, която се означава като поглъщане (%). Много често се измерва и величината E = ln (I_o/I), наречена екстинкция. Аналогичната й величина D = lg(I_o/I) се нарича оптична плътност. От закона на Буге-Ламберг-Беер се вижда, че E = . c. d.


Фиг. 7. 3. 1. Поглъщане на монохроматична светлина от разтвор в кювета.

За определено вещество, екстинкционният коефициент  (съответно А, Т и Е) представляват характерна функция на . Оптичните апарати, наречени спектрофотометри, дават възможност тези величини да се измерят при различни  и така се получава оптичния спектър на поглъщане (абсорбционния спектър) за даденото вещество.

За всеки атом или молекула, най-силната му линия (ивица) на поглъщане се нарича характеристична линия (ивица) на поглъщане. Тя се получава при т.н. характеристична . Измервайки поглъщането при тази , от закона на Бугер-Ламберт-Беер можем да изчислим с най-висока точност концентрацията на поглъщащото вещество. По този начин чрез метода на абсорбционната спектрофотометрия се определя концентрацията на белтъци и нуклеинови киселини по поглъщането им в ултравиолетовата област и на цветни разтвори по поглъщането им във видимата област. Така се определят и концентрациите на жизнено важни елементи и микроелементи в биологични течности, тъкани, храни и минерална вода. За целта, пробата се атомизира (изпарява, изгаря на пламък) и се измерва поглъщането в характеристичните линии на поглъщане на тези елементи. В този случай спектрофотометърът се нарича пламъков фотометър и е класическо средство за измерване концентрацията на K⁺ и Na⁺ в кръвна плазма.

Когато се работи с пречистена субстанция, съдържаща сложни органични молекули, по вида на нейния спектър на поглъщане може да се получи информация за вида и химичния й състав - качествен спектрален анализ. Особенно информативен е спектърът на поглъщане на органичните молекули в близката инфрачервена област. Трептенията на една сложна органична молекула можем да разделим на две групи – скелетни (които засягат в еднаква степен всички атоми на молекулата) и характеристични (в които участват само атомите на характерни химични групи – карбонилна, метилна, метиленова и др.). Честотата на трептене, съответно честотата на поглъщане за всяка една от посочените химични групи почти не зависи от строежа на цялата молекула и може да се използва за анализ на химичния състав на молекулата (табл. 7.3.1). Така, измервайки поглъщането при характеристичните линии на отделните химични групи се установява колко и какви групи съдържат молекулите на разтвореното вещество. Много често вместо характеристична честоти се говори за вълново число, това е отношението 1/, което показва броя на вълните върху единица дължина, обикновено 1 см.

Б

За отделната молекула честотите на въртене зависят от молекулата като цяло – от нейната големина, маса и разположение на центъра на тежестта й, накратко – от нейния инерчен момент. Тъй като отделните изомери на една и съща молекула имат различни инерчни моменти, те ще имат и различни, характерни за тях честоти на въртене, което позволява тяхното лесно откриване.

Активността на даден ензим обикновено се определя като се използва субстрат, продукта от който дава цветен разтвор. Тази активност се изчислява по скоростта на нарастване на характеристичното поглъщане на продукта по време на биохимичната реакция.



Фиг. 7. 3. 5. Поглъщане на ултравиолетовата светлина от нуклеотиди (в ляво) и от нуклеинови киселини (в дясно) при рН 7.0.

Осветяването на някои молекули (нуклеинови киселини, билирубин) със силна светлина предизвиква фотоиндуциран разпад на поглъщащите молекули на по-малки части. В някои случаи тази фотодисоциация преставлява вреден ефект, както е случая с нуклеиновите киселини. В случая с билирубина това е полезен ефект, който се използва при фототерапията на новородени. На фиг. 7.3.4 и 7.3.5 са показани характеристичните ивици на поглъщане на някои биологично важни вещества. Аденинът и другите нуклеобази, както и нуклеиновите киселини поглъщат силно при 260 nm, което се използва за определяне концентрацията на тези вещества във водни разтвори. Осветяването на такива разтвори със силна УВ светлина с  = 260 nm води до разкъсване на химичната връзка. Това обуславя силния цитотоксичен и гермициден ефект на ултравиолетовата светлина от тази област. Силното поглъщане на хемоглобина при 430 nm (фиг. 7.3.4) се обозначава като ивица на Соре и се дължи на хемовата група в молекулата на хемоглобина. Понеже ивицата на Соре се намира в синята част на видимия спектър, разтворите на хемоглобина поглъщат сините лъчи и пропущат червените, което придава червен цвят на кръвта. В същата оптична област поглъща и билирубина, което се използва за разпад и детоксификация на неговите молекули чрез осветяване със силна светлина при фототерапията на новородени.

Всяко електромагнитно излъчване на телата, което е в добавка към тяхното топлинно излъчване се обозначава като луминесценция (от латинското lumen – светлина, luminescent - слабосветещ). Нарича се още «студено светене». Като възбудител на луминесценцията се използва друг вид енергия, различна от топлината. Съобразно с вида на тази външна енергия различаваме: фотолуминесценция (предизвиква се от поглъщане на светлина), рентгенолуминесценция (поглъщане на рентгенови лъчи), електролуминесценция (електричен ток), хемилуминесценция (химична реакция), биохемилуминесценция (биологичен процес) и др. Луминесциращото вещество се нарича луминофор.

При фотолуминесценцията, луминофорът трябва да бъде облъчен с подходяща, най-често ултравиолетова светлина (възбуждаща светлина). Молекулите на луминофора поглъщат резонансно кванти светлина и електронната двойка на химичната им връзка увеличава своята енергия като се издига от основното електронно ниво S_o в по-горни електронни нива S₁, S₂, и т.н. (Фиг. 7.4.1). При това възбуждане двойката електрони запазват своите спинове насочени противоположно един на друг (антипаралелни) и се обозначават като синглетни.

Спинът на отделния електрон е мярка за неговото въртене около собствената му ос и може да заема няколко отделни стойности (0, ± ½, ± 1). Общият спин на електронната двойка е сума от спиновете на двата електрона и може да има стойности 0, ± 1 и т.н. Когато спиновете на двата електрона са противоположно ориентирани общия спин е 0 и състоянието на електронната двойка е синглетно (S). При еднопосочна ориентация на двата спина, общият спин е ± 1 и състоянието е триплетно (T).

Всяко едно от електронните нива на молекулата се разпада на поднива поради различната вибрационна и ротационна енергия, която молекулата може да има в тях. Синглетните нива са винаги краткоживущи, докато триплетните нива имат голямо време на живот. Дезактивацията може да стане по три начина: вътрешна конверсия (безизлъчвателен преход с отделяне на топлина), флуоресценция или понякога фосфооресценция (Фиг. 7.4.1).

При безизлъчвателния преход, енергията на възбудената молекула се отнема чрез сблъсък с друга невъзбудена молекула (гасене на възбуждането) и се превръща в топлина. Обикновено, дезактивацията от всички по-горни нива S₂, S₃, S₄ и т.н. до първото възбудено ниво S₁ става чрез гасене и отделяне на топлина, докато излъчване на светлина възниква само при преход от S₁ до основно ниво S_o (S₁  S_o) - флуоресценция. Но и в този случай, част от преходите S₁  S_o са също безизлъчвателни с отделяне на топлина.

При някои молекули е възможно електронът, намиращ се в нивото S₁ да обърне своя спин преди да се е дезактивирал. В това ново състояние двата електрона от електронната двойка са с паралелни (еднопосочни) спинове. Такова състояние на молекулата се означава като триплетно състояние Т₁ и то е с много голямо време на живот - от 1 ms до 100 s (метастабилно ниво). Ето защо дезактивирането на триплетното състояние продължава дълго време след прекратяването на възбуждането - фосфоресценция. Преходът S₁  Т₁ се нарича интеркомбинационен преход и е възможен само при някои сложни по строеж молекули, ако енергията на двете им състояния S₁ и Т₁ са много близки.

Молекулите намиращи се в триплетно състояние всъщност представляват силно реактивоспособни химични радикали. При подходящи условия те дават началото на много фотохимични реакции. Появата на такива радикали в биологичните среди представлява опасност, защото те инициират вредни химични превръщания на биомакромолекулите. Такива радикали се получават в биологичните обекти при облъчване с йонизираща радиация и УВ-лъчи. В медицината, такива радикали се използват при фотодинамичната терапия на тумори.

От посочения механизъм на фотолуминесценцията могат да се направят няколко заключения:

1) Ако с N_изл и N_пог означим броя на излъчените и погълнатите от луминофора фотони, то отношението N_изл/N_пог се нарича квантов добив на луминесценцията. Квантовия добив е толкова по-малък от единица, колкото гасенето е по-ефективно. Тъй като гасенето е възможно когато молекулите се приближат една до друга, чрез квантовия добив може да се установи средното разстояние между тези молекули, ефективен пренос на енергия между тях и др.

2) Очевидно, енергията на излъчените кванти светлина е равна или по-малка от тази на погълнатите кванти. Съответно, дължината на вълната на излъчената светлина е равна или по-голяма от тази на възбуждащата - закон на Стокс.

3) Разпределението на излъчените кванти по енергия се нарича емисионен спектър на луминофора. Емисионният спектър на луминесценцията (преходите 1', 2', 3' и т.н.- Фиг. 7.4.1) зависи само от вида на луминофора и не зависи от спектъра на възбуждащата светлина. Така, по вида на емисионния спектър може да се направи качествен и количествен анализ (луминесцентен анализ) на луминофора.

Клетки, клетъчни мембрани и органели могат да се изследват, като към тях предварително се добавят флуоресцентни маркери (белези) или сонди. Маркерите се свързват ковалентно, а сондите нековалентно към специфични места на пробата. Това са молекули, които имат силно и характерно луминесцентно излъчване когато са в свободно състояние. След това пробата се облъчва с възбуждаща светлина и се записва емисионния спектър на свързаните сонди (маркери). По разликата между спектрите на маркерите (сондите) в свободно и свързано състояние се съди за молекулните движения и взаимодействия в пробата.

Когато възбуждащата светлина е плоско поляризирана, емитираната светлина на луминофора също има определена степен на поляризация. Последната зависи от молекулните движения (микровискозността) на пробата, колкото микровискозността е по-голяма, толкова степента на поляризация на емитираната светлина ще бъде по-висока.


Фиг. 7. 4. 2. Принципно устройство на спектрофлуориметър (вляво) и запис на емисионния спектър на луминофора (вдясно), получен съгласно преходите на Фиг. 7. 4. 1.
Емисионният спектър на даден луминофор се снема чрез спектрофлуориметри (Фиг. 7.4.2). Луминесценцията на пробата се възбужда чрез монохроматична светлина, отделена от източника на светлина S с помощта на тесен процеп към входящия монохроматор. Дължината на вълната на възбуждащата светлина _възб може да се избира различна, според използвания луминофор. Излъчената от пробата луминесцентна светлина в перпендикулярна посока се пропуща през процепа на изходящия монохроматор и се превръща в електричен сигнал чрез фотоелектричен преобразувател. Записът на този сигнал, като функция на дължината на вълната на пропускане (_изл), представлява емисионния спектър на пробата (ивиците 1', 2', 3' и т.н.- Фиг. 7.4.1).

Фосфоресценцията на вещество, наслоено върху екран се използва при електроно-лъчевата тръба за получаване на видима картина на сигнали (кинескопи, телевизори, монитори). Напоследък електроно-лъчевата тръба се заменя от екран с течен кристал.

При проточния цитофлуориметър, към дадена клетъчна суспензия (например кръв) се добавят антитела, конюгирани с флуоресцентни маркери. Антителата се свързват специфично към отделните видове клетки, които заедно с това се маркират. След това суспензията се разрежда и разбива на малки капки, които се пускат пред фотодетектора за луминесцентна светлина. Така, клетките от различни видове могат да се броят като се възбуди луминесценцията на закрепените за тях маркери.

Биолуминесценцията е вид хемилуминесценция, присъща на различни видове организми - бактерии, насекоми, риби и др.. Някои от тях използват светенето за примамване на жертви или партньори, други за отблъскване на хищници като светулките, дълбоководни скариди и др. Излъчeната светлина е във видимата част на спектъра и се генерира от специализирани органи - фотофори, които превръщат химическата енергия в светлинна използвайки реакции на окисление на богати на водород органични съединения - люциферини. Ензимите, катализиращи окислението се наричат люциферази.

Свръхслабото светене е частен случай на биолуминесценция от тъканите. Това е светене с много ниска интензивност (10 - 100 фотона на 1 см² от повърхността на дадена тъкан), което може да се регистрира само с фотоелектронен умножител. Максимумът на излъчването е в областта 360 - 800 nm. Свръхслабото светене се дължи на свободнорадикалното окисление на липидните структури в биомембраните и клетките.

При облъчване на хранителни продукти с ултравиолетово лъчение те луминисцират, като цветът на излъчената светлина е различен при прясната и развалена храна. В зависимост от степента на разваляне цветът на месото се променя от червено-виолетов до зелено-сив, този на рибите от сив до жълто-зелен, на млякото от зелено-жълт до син и др. Проходимостта на системата от микроциркулация на кръвта може да се определи като в кръвта се инжектира подходящо луминесциращо вещество. В криминалистиката чрез ултравиолетово облъчване могат да се откриват невидими с просто око следи от кръв, като кръвта на човек може да се разграничи от кръвта на други животни. Различно луминесцират истинските от фалшивите банкноти, различни мастила и др. Луминесцентният микроскоп позволява да се диагностицират различни инфекциозни заболявания, гъбични инфекции, аномалии в пигментацията и др.