Молекулярна биология и наследствени болести при домашните животни проф дсн Лилян Сотиров

Превеждането на наследствената информация от езика на аминокиселините на езика на белтъците се извършва от тРНК, които служат като адаптори в процеса на транслацията.

Зрялата молекула иРНК съдържа различен брой нуклеотиди, като всеки три последователно подредени нуклеотида формират един кодон, кодиращ една от двадесетте аминокиселини. Транспортните РНК молекули имат способността да се свързват с конкретна аминокиселина и притежават участък от веригата си съставен също от три нуклеотида, който се означава като антикодон. Взаимодействието между иРНК и тРНК се осъществява по принципът на комплементарността между кодона и антикодона, като при съответствие между тях се изграждат водородни връзки. Тази особеност на транслацията прави възможно подреждането на всяка аминокиселина в определен ред от полипептидната верига, от което пък зависи първичната структура на синтезираната белтъчина. В същото време водородните връзки са сравнително лабилни, което дава възможност за освобождаване на тРНК след отдаването на носената аминокиселина. Така тРНК могат да се използват многократно в процеса на транслацията. Както вече описахме при раздела генетичен код някои аминокиселини се кодират от един кодон, но други се кодират от два или повече кодона. Структурата на тРНК бе подробно разгледана в предходните радели.
Аминоацил-тРНК синтетази

Това са високоспецифични ензими, които могат да разпознават съответната аминокиселина и тРНК носеща съответният антикодон за тази аминокиселина. Тези ензими осъществяват свързването на тРНК със специфичната за тях аминокиселина. За всяка аминокиселина е установена отделна аминоацил тРНК синтетаза, т.е. в клетката се откриват 20 аминоацил-тРНК синтетази. От съществено значение за транслацията е връзката между антикодона и кодона, поради което бихме могли да предположим, че разпознаването между тези ензими и тРНК молекулите също се базира на антикодона. В разделът генетичен код посочихме, че едни аминокиселини се кодират от един кодон, докато някои аминокиселини се кодират от 5 и повече кодона, поради което не можем да твърдим, че разпознаването между тРНК и аминокиселините се базира на антикодона. Основна роля в този процес има акцепторното стъбло на тРНК. Там е открит участък (дискриминатор) от една база, чиято замяна с друга е достатъчна за да пренасочи тРНК към друга синтетеаза. Предполага се, че тези участъци са няколко, като заедно формират вторичен генетичен код (разпръснат по молекулата на тРНК), който е много по-сложен.

Тъй като броят на аминоацил-тРНК синтетазите е 20 и отговарят на броят на аминокиселините, то бихме могли да си зададем въпроса – как тези ензими разпознават и аденилират само една от всички аминокиселини. Процесът на разпознаването допълнително се усложнява от почти еднаквата химична структура на някои аминокиселини (фенилаланин – тирозин; валин - изолевцин). Разликата между аминокиселините фенилаланин и тирозин е наличието на една хидроксилна група в тирозина. Именно тази хидроксилна група позволява на ензима да изгради водородна връзка с аминокиселината, което му позволява да разпознае молекулата с която се свързва. Ензимите отговарящи за всяка аминокиселина могат да се свържат точно с тази за която имат специфична химична връзка в своя т. нар. каталитичен джоб. По този начин броят на сгрешените аминокиселини е под 1%. Аминоацил тРНК синтетазите притежават възможността да коригират допуснатите грешки. Малко след каталитичният джоб те притежават втори джоб (коректорски) джоб. В него може да се помести единствено специфичната за ензима аминокиселина. При попадането на друга тя се хидролизира и се освобождава от ензима. Чрез този механизъм на корекция погрешно свързаните аминокиселини спадат до 0,01%. Както виждаме тези ензими извършват невероятен контрол върху свързването на аминокиселините със съответните тРНК. Благодарение на тяхната точност рибозомите следят единствено за правилното изграждане на водородните връзки между кодон и антикодон.

По същество рибозомите са клетъчните органели, в които се срещат кодоните на иРНК и антикодоните на тРНК, носещи съответните аминокиселини. В тези органели се изграждат специфичните полипептидни вериги кодирани от даден ген и пренесени от иРНК. Рибозомите са жизненоважни органели, поради което при по-бързо растящите клетки тяхната маса е около 25% от общото тегло на клетката. Характерно за рибозомите при прокариотите е тяхната възможност да се свързват с иРНК още в процеса на транскрипция, докато при еукариотите това ставя едва след процесинга и експортирането на иРНК в цитоплазмата. Изграждането на полипептидните вериги при бактериите е доста по-бързо (до 20 АК/sec) в сравнение с еукариотите (до 4 АК/sec). Във всеки момент от синтезата на белтък една рибозома може да бъде ангажирана само с една иРНК и може да синтезира само една полипептидна верига. След синтезирането на съответната белтъчина и отделянето на иРНК от рибозомата, както рибозомата така и иРНК молекулата могат да бъдат ангажирани в нов процес на синтез.

Рибозомите са изградени от две субединици – малка и голяма, като основните им градивни единици са рРНК и белтъчини. Малката субединица е изградена от 21 белтъка означавани като S белтъци (S – small). Голямата субединица съдържа 34 белтъка – L – белтъци (L-large). Според константата си на седиментация двете частици при бактериите се означават като 30S и 50 S. Всяка бактериална рибозома съдържа три инкорпорирани в нея рРНК молекули. Малката субединица съдържа една рРНК (16S рРНК), а голямата две рРНК молекули (23S и 5S). Характерно за рибозомните РНК молекули е, че също както и тРНК, те имат много сложна вторична и третична структура, което води до няколко двойноверижни участъка. Пространствената структура на рРНКите се дължи на взаимодействията им с рибозомните белтъчини, както и на взаимодействията между самите рРНКи.
Функционални участъци в рибозомите

Активният център (пептидил трансферазен) на рибозомите е ситуиран в голямата субединица и е изграден от рРНК. Декодиращият център е разположен в малката субединица и отговаря за превеждането на последователността от кодони в последователност от аминокиселини в полипептидна верига. За да протече пептидил трансферазната реакция е необходимо рибозомата да свърже поне две тРНК, което означава че рибозомата притежава три места за свързването на тРНК:

• 
  А- място – тук се свързва аминоацилираната тРНК, която предстои да бъде използвана в синтезата на белтък.
  
• 
  Р – място – тук синтезиращата се полипептидна верига се прехвърля върху аминоацилираната тРНК на А място.
  
• 
  Е - място – тук тРНК от Р мястото се хидролизира от връзката си с белтъка и се отделя от рибозомата.
  

Синтезираният полипептид напуска рибозомата през сравнително тесен канал разположен в голямата субединица на рибозомата. През този канал може да минат полипептидни вериги, които не са нагънати в пространството, поради което пространствената конформация на белтъчините се извършва едва след тоталното им отделяне от рибозомата.

Преди започване синтезата на белтъчините малката и голямата субединица са разделени една от друга. При прокариотите транслацията започва с оформянето на комплекс между иРНК, рибозомата и тРНК, носеща аминокиселината формилметионин. Поради факта, че при всички прокариоти процеса се инициира от включването именно на тази амининокиселина, тРНК молекулата носител е наречена инициаторна тРНК. Формилирането на аминогрупата на метионина позволява следващата аминокиселина да бъде свързана единствено към карбоксилната група. Тази малка особеност всъщност задава и посоката на синтезираните полипептидни вериги – от N-края към СООН – края. След края на транслацията формилметионина се отстранява от веригата посредством ензима метиониндеформилаза. Така, въпреки че това е първата аминокиселина в процеса на транслацията тя не се съдържа в началото на ППВ.

Информационната РНК молекула се свързва с малката субединица на рибозомата благодарение на комплементарните взаимодействия между нея и 16S рРНК. След присъединяването и на голямата субединица в процеса на елонгацията стартовият кодон се разполага в Р мястото. Независимо от стартовият кодон (УУГ, ГУГ,АУГ) на конкретният ген, към него винаги се съединява инициаторната тРНК, носеща аминокиселината формилметионин. На този етап инициаторният комплекс се допълва и от три иницииращи транслацията фактора - IF1, IF2 и IF3. Енергията за процеса се получава от хидролизата на ГТФ. Всеки от трите фактора на инициацията изпълнява конкретни функции:

• 
  IF1 – свързва се към А мястото, като така провокира инициаторната тРНК да се свърже с Р – мястото.
  
• 
  IF2 – представлява ензим, който предизвиква хидролиза на ГТФ. Спомага свързването на инициаторната тРНК с Р мястото.
  
• 
  IF3 – за протичането на инициацията е необходимо двете субединици да са разделени по между си, затова този фактор се свързва с малката субединица и пречи на асоциацията и с голямата.
  

При еукариотните клетки, описаните механизми са почти идентични. При тях свързването на инициаторната тРНК предшества свързването на иРНК. Инициаторната тРНК носи метионин и се означава като Мет-тРНК. Инициращите вектори не са само три, а около 30 на брой и извършват подобни функции, както при прокариотите. Стартовият кодон при еукариотите обикновено е АУГ.

В процеса на елонгацията на транслацията участие вземат три основни фактора – EF-Tu, EF-G и EF-Ts. Не са установени съществени разлики между про- и еукариотните клетки. Транслацията е сравнително точен процес, но въпреки това се случва погрешното включване на аминокиселина в полипептида (една на 10 000 аминокиселини).

При взаимодействието на карбоксилната (COOH) група на предшестващата и амино (NH) групата на аминокиселината в А центъра, между тях се изгражда пептидна връзка. Процеса се катализира от ензима пептидилтрансфераза. На следващият етап иницииращата тРНК се освобождава от дипептида и напуска Р центъра. Локализираната в А центъра тРНК се прехвърля върху Р центъра и така А центъра остава свободен. Този процес се означава като транслокация и се катализира от ензима транслоказа. Участие при прехвърлянето на тРНК взема и факторът на елонгацията EF-G. В същото време рибозомата се премества с един кодон напред по веригата на иРНК (посока 5‘>3‘). Тъй като А центъра е свободен в него навлиза трета аминоацил тРНК, носеща нова аминокиселина и се свързва комплементарно поредният кодон от иРНК. Отново настъпва образуване на пептидни връзки между предходната и следващата аминокиселина и т.н. Така в зависимост от кодоните в иРНК се синтезира съответната полипептидна верига, специфична за конкретният вид клетка.

През този етап от транслацията настъпват три основни събития:

1. 
   В А центъра постъпва втората тРНК (поредната) носеща съответната активирана аминокиселина и се свързва с кодона на иРНК.
   
2. 
   Изгражда се пептидна връзка между аминокиселините в А центъра и Р центъра. Участие в този процес взема ензима пептидилтрансфераза.
   
3. 
   Транспортната РНК в Р мястото се освобождава от носената аминокиселина и напуска това място. Образуваната пептидил тРНК в А мястото и кореспондиращият и кодон на иРНК се преместват в Р мястото. Това преместване се означава като транслокация.
   

Транслацията се преустановява, когато в А центъра постъпи един от т.нар. стоп кодони – УАГ, УАА или УГА. Тези стоп кодони не се разпознават от нито една тРНК, поради което нито една тРНК не се свързва с тях. Стоп кодоните се разпознават от специфични белтъчини наречени отделящи фактори (releasing factors). Тези фактори спомагат отделянето на ППВ от Р центъра. Съществуват два класа отделящи фактори:

1. 
   Клас – се делят на два вида:
   
   1. 
      RF1 - разпoзнава кодона УАГ
      
   2. 
      RF2 – разпознава кодона УГА
      

2. 
   Клас – факторите от този клас спомагат отделянето на факторите от клас I и освобождаването на веригата. Прокариотите притежават само един фактор от II клас – RF3.
   

Биосинтезата на белтъците е цикличен процес. Характерно за него е, че с една молекула иРНК може едновременно да се свържат няколко рибозоми, образуващи полизомен комплекс. Във всяка свързана рибозома се синтезира по една ППВ, което позволява на клетката да синтезира много бързо нужните и белтъчини, а и да използва максимално малкият брой иРНК молекули с кратка продължителност на съществуване (обикновено до около 10 min.).

Поради своята едноверижност иРНК е многократно по-уязвима в сравнение с двойноверижната ДНК молекула. Разкъсването на веригата на иРНК е често срещано явление, което от своя страна води до синтезата на по-къси белтъчини. Такива иРНК са в резултат на взнезапно прекъсната транскрипция, нуклеазно въздействие от ендонуклеазите в клетката или различни дефекти в ДНК матрицата, които променят рамката на четене. При тези повредени иРНК липсва стоп кодон, поради което краят на веригата не се разпознава от отделящите фактори, а от друга страна няма тРНК която да се присъедини поради изчерпването на иРНК. В такива случаи при бактериите се намесва една хибридна молекула съставена от информационна и транспортна РНК (tmRNA). Тя има свойството да открива и свързва заседнали рибозоми. След като се свърже, тя навлиза в канала отговорен за свързването на иРНК. Участъкът от tm РНК изграден от иРНК започва последователно да свързва съответните за него тРНК. Обикновено се касае за около 10 кодона последният от които е стоп кодон. По този механизъм рибозомата се освобождава от „клопката“ в която е попаднала, но към ППВ се присъединяват аминокиселини, които не са присъщи за нея.

При наличието на преждевременен стоп кодон в иРНК (възникнал при грешка в сплайсинга, мутации и др.) се задейства друг механизъм, който разгражда повредената РНК молекула. По този начин се извършва предварителен скрининг на всички иРНК преди започването на транслацията.

При еукариотите е възникнал специфичен механизъм, който едновременно унищожава иРНКите, при които липсват стоп кодони и дефектните ППВ. След като рибозомата синтезира всички налични кодони тя транслира полиадениловата (поли А) опашка в лизинови аминокиселини. Поради липсата на стоп кодон се достига до момент, в който тя засяда по описаният вече начин. На този етап се намесва специфичен белтък наречен Ski 7. Този белтък дисоциира рибозомата и привлича 3‘>5‘ екзонуклеазата за да разгради дефектната иРНК. В същото време полилизиновата опашка на белтъка се напада от протеолитичните ензими в клетката и се разгражда.

Както вече споменахме теорията, че един ген отговаря за една полипептидна верига вече се смята за грешна поради откриването на механизмите на сплайсинга на пре иРНК и възможността от един ген да бъдат синтезирани дори хиляди различни ППВ. Установено е и посттранслационно зреене на белтъчините, което показва, че в структурните гени се съдържа много повече информация отколкото се е предполагало. Такова посттранслационно зреене на белтъчините е открито при мезофилни бактерии, дрожди и др. Процесът се изразява в изрязването на белтък-предшествениците на вътрешните белтъчни сегменти (интеини) и свързването на флакиращите тези сегменти NH и COOH крайща (екстеини). Процесът се извършва много бързо без участието на допълнителни белтъчини.

Известно е, че всяка клетка в многоклетъчният организъм е тотипотентна, т.е. тя съдържа цялата генетична информация на организма. Въпреки, че съдържат цялата генетична програма клетките в различните тъкани се отличават със специфичен строеж и функция. Диференциацията на клетките се осъществява благодарение на избирателната транскрипция на гените, при която едни гени се експресират в клетките на едни тъкани, а други гени в други тъкани. Установено е, че дори специфичните за даден клетъчен клон гени не се експресират постоянно, а само тогава когато продуктите им са необхдими на клетката. Въз основа на задълбочени проучвания е доказано, че в клетката никога не функционират повече от 10-15% от гените. Останалата част от генома на клетката е функционално неактивен, т.е. гените не са експресирани. Генната експресия при еукариотите и прокариотите се регулира посредством различни клетъчни механизми.

Регулацията на гената експресия при прокариотите е далеч по-опростена в сравнение с еукариотните клетки. Едни от първите автори описали тези механизми при бактерията E. coli са Жакоб и Моно. Авторите създават така нареченият модел на оперона, според който всеки оперон в кръговата ДНК молекула съдържа следните категории участъци:

• 
  Промоторен участък – разполага се преди структорните гени и притежава способността да се свързва със специфични белтъчини.
  
• 
  Ген оператор – разполага се между структорните гени и промоторният участък.
  
• 
  Структурни гени – кодиращи специфични за клетката полипептиди, рРНК и тРНК.
  
• 
  Терминаторен участък – разполага се след структорните гени.
  

Описан е и друг механизъм за контрол на ензимната синтеза, при който ензимите се синтезират постоянно в клетката. При натрупване на излишни количества от продуцираното вещество синтезата на ензимите се преустановява. Пример за такъв тип регулация може да бъде даден с анаболитният триптофан оперон. Този оперон се състои от промотор, ген опреатор, 5 структорни гена с обща дължина около 7000 нуклеотида и терминатор. Тъй като триптофана е от постоянна необходимост в клетката, репресорът не оказва влияние върху ген оператора. При получаване на излишни количества от тази незаменима аминокиселина репресора се свързва с оператора и го активира. В резултат на това взаимодействие транскрипцията на оперона се блокира, т.е. експресията на структурните гени се преустановява. При изчерпването на триптофана в клетката, репресора се освобождава и освобождава ген оператора. По този фин механизъм клетката управлява синтезата на триптофан в зависимост от нуждите си.

Описаните два механизма обхващат само два оперона при един бактериен вид, но функционалните особености са идентични при почти всички прокариоти. Обикновено структорните гени са от 1 до 15, като всеки от тях е отговорен за синтезата на белтък участващ на определен етап от дадена метаболитна верига. Това означава, че гените разположени във всеки оперон са функционално свързани и се транскрибират в пакет. При повечето оперони има само един промоторен участък, но са описани и специфични оперони с два промотора, което позволява по-прецизната регулация на оперона.

Регулацията на генната експресия при еукариотите е един от най-изучаваните процеси на нашият век. Макар да съществуват известни прилики с контрола на експресията при прокариотите, еукариотите имат далеч по-сложни регулаторни механизми. Тук също се наблюдават структурни и регулаторни участъци, но те не са подредени един след друг в оперони, а са разположени на различни разстояния един от друг. Съгласуваното експресиране на гени разположени в различни локуси на хромозомата или дори в различни хромозоми е един от най-интимните механизми в еукариотната клетка. При някои еукариотни клетки е наблюдавана и групова регулация, споделяща сходни правила с описаните при модела на оперона. За сега е известно, че генната експресия при еукариотите може да бъде регулирана на следните нива:

• 
  Регулация на транскрипционно ниво – Характерно за транскрипцията е, че свързването на трите типа РНК полимерази с промоторите (регулаторни участъци в ДНК) се осъществява посредством белтъчини, означавани като транскрипционни фактори. Съществуват и друга група белтъчини отговарящи за терминацията на транскрипцията – фактори на терминацията. Важно е да отбележим, че всяка от трите РНК полимерази разпознава различна нуклеотидна последователност, която взаимодейства със специфичен терминационен фактор.
  
• 
  Регулация на посттранскрипционно ниво – Осъществява се при сплайсинга на хетероядрената РНК. Процесът се извършва в ядрото и по същество представлява изрязване на интроните и снаждане на екзоните на пре- информационната РНК молекула. При повечето еукариотни гени участъците междо екзон и интрон са изпълнени с къси нуклеотидни последователности. Сплайсингът се извършва благодарение на разпознаването на тези участъци от малките ядрени РНК молекули. Те се свързват с определен участък от първичната РНК и образуват комплекс означаван като сплайсозома. В тази структура интроните се изрязват, а екзоните се съединяват в една обща молекула означавана като зряла РНК. Доказано е, че в повечето случаи зрялата иРНК от един и същ ген не е еднаква. Явлението се нарича алтернативен сплайсинг и се дължи на различният брой и начина на подреждане на отделните екзони в молекулата иРНК. Понякога от първичната иРНК се изрязват едни екзони, а при други клетки се същите екзони се оставят в зрялата иРНК. Така в клетката се синтезират полипептидни вериги с различна дължина и различен аминокиселинен състав. За повечето от гените при бозайниците са установени по няколко иРНК молекули, което противоречи на вече остарялата максима „Един ген – една полипептидна верига“.
  
• 
  Регулация на транслационно ниво – Установена е връзка между количеството и вида на тРНК в клетката и аминокиселинният състав в клетката. Така в клетките на определени тъкани по-голямата част от тРНК молекулите са отговорни за преноса само на една аминокиселина, докато при други клетки се срещат няколко вида тРНК. По този начин високоспециализираните клетки имат възможността да синтезират големи количества от специфичният за тях белтък. Бихме могли да предположим, че диференцираните клетки могат да контролират експресията на гените кодиращи различните тРНК, при което в различните етапи на клетчният цикал някои от тях са суперекспресирани, докато други се транскрибират в много ниски количества. Пример за такъв тип регулация можем да дадем с белтъкът фибрин при копринената пеперуда. Този белтък е изграден от аминокиселините аланин, глицин, серин и тирозин. В момента на синтезата на белтъка в клетката се откриват единствено четирите тРНК отговорни за преноса на тези аминокиселини до рибозомите.
  
• 
  Други – към тази категория можем да отбележим прибавянето на метилна група към цитозиновите нуклеотиди в молекулата на ДНК. При застигане на такъв участък транскрипцията на гена се преустановява. Този механизъм се използва от клетката за регулация на някои от гените.
  

Процесът транскрипция протича в следната посока:

1. 
   
   Каталог: tru -> uchebnici -> 27.VMF-LSotirov-TcvKojnarski -> 27.VMF-LSotirov-TcvKojnarski-work
   27.VMF-LSotirov-TcvKojnarski-work -> Наследствени болести при конете хромозомни мутации (аберации)
   uchebnici -> 2. хипофизна жлеза
   uchebnici -> Доц д-р Евгения Христакиева, д м
   27.VMF-LSotirov-TcvKojnarski-work -> Canine Inherited Disorders Database (1998), плод на
   
   
   
   Изтегляне 4.07 Mb.
   
   Сподели с приятели: