Основи на геометричната оптика. Пречупване и отражение на светлината. Нишкова оптика. Ендоскопи

Микроскопски обективи (фиг. 6.5.3). Обективът създава реален и обърнат образ на наблюдавания обект. С нарастване на увеличението на обектива (3 х, 25 х, 40 х, 100 х), намалява фокусното разстояние на обектива, а също и работното разстояние, което е разстоянието между предмета и предната леща на обектива. Намалява и т.н. дълбочина на наблюдение, т.е, дебелината на наблюдавания слой. При обективите от средна мощност (25х и 40х), работното разстояние се увеличава като се използва допълнителна леща с изпъкнато-вдлъбнатата форма (мениск), поставена между предмета и обектива. Тя трябва да е апланат - лишена от сферична аберация и кома. Най-мощните обективи (100 х) са имерсионни, това ще рече, че между предмета и предната леща на обектива се поставя масло с коефициент на пречупване близък до този на стъклото. С това се увеличава числената апертура на обектива и разделителната способност на микроскопа, което позволява постигане на максимално увеличение за микроскопа от около 1200 х. Имерсионният обектив обикновено се състои от една челна полусферична леща, един апланат и няколко дублекса от събирателно-разсейвателни лещи.

С такава телевизионна камера са снабдени някои операционни микроскопи за микрохирургия, така че операцията да може да се наблюдава на екран. Тази техника позволява да се отстраняват тумори от главния и гръбначния мозък, да се свързват нерви, кръвоносни съдове, сухожилия и мускули и така да се възстановява връзката на откъснати крайници с човешкото тяло.

Някои от структурите и детайлите на биологичните обекти не могат да се видят или не могат да се отличат от останалите структури с обикновен светлинен микроскоп. Това се получава, когато изследваните структури са безцветни или прозрачни, или имат цвят, който е еднакъв с този на околния фон. Обикновено този проблем се разрешава чрез подходящо обагряне на обекта, при което използваното багрило оцветява специфично определени негови структури. В други случаи се използва такъв метод за наблюдение, който прави видими изследваните структури. В първия случай, преди всяко едно наблюдение под микроскоп, обекта (пробата) се подлага на обработка - фиксиране, обагряне, изсушаване и др. Самата обработка може да доведе до загуба или изкривяване на някои компоненти на пробата, което се означава като артефакт. Затова, даже и в този случай, пробата се изучава с различни методи за наблюдение и ако при всеки един от тях се получава едно и също изображение, то вероятно представлява реална структура, а не артефакт. В някои случаи контраста на образа не е достатъчен и трябва да се повиши. Така възниква необходимостта от използване на голям брой методи за наблюдение с микроскоп, основните от които са описани по-долу.

С този вид микроскопи могат да се набюдават само обекти, които имат цвят или са предварително оцветени. Цветът на телата зависи от това, каква част от спектъра на видимата светлина те поглъщат или отразяват. При телата със сив до черен цвят, всички лъчи от снопа бяла светлина се поглъщат в еднаква степен. Някои тела обаче поглъщат само част от лъчите в зависимост от тяхната дължина на вълната. Тези тела имат цвят, съвпадащ с цвета на пропуснатата или отразена светлина. Например, хемоглобинът поглъща светлината от синята част на спектъра, поради което цветът на еритроцитите и на кръвта е червен.

Много биологични обекти съдържат структури които почти не поглъщат светлина или нямат цвят и поради това не могат да се видят в полето на обикновения светлинен микроскоп. В този случай се използват следните методи за наблюдение.

2. Наблюдение на прозрачни обекти в преминала поляризирана светлина (поляризационен микроскоп). Използва се, когато е необходимо да се определи присъствието на вещества, които проявяват оптична активност и двулъчепречупване. В биологичните обекти оптично активни са тези вещества, които имат кристална или линейно периодична структура, например някои биомембрани, колагенните влакна, течните кристали на мастните киселини и пр.

За целта се използва светлинен микроскоп, снабден с допълнителни приспособления за наблюдаване на обекта в плоскополяризирана светлина. Това са поляризатор, разположен между кондензора и пробата (обекта) и анализатор, разположен между обектива и окуляра. Поляризаторът превръща преминаващата през него светлина в плоско поляризирана, а анализаторът пропуща само светлината поляризирана в определена равнина. Анализаторът може да се върти около оста си с което се определя равнината на поляризация на светлината, излизаща от пробата.

Въпреки че не поглъща светлината, обектът или отделни негови структури притежават двулъчепречупване и са оптично активни (завъртват равнината на поляризация на преминаващата през тях светлина). При кръстосани анализатор и поляризатор зрителното поле е тъмно поради несъответствие между равнините на поляризация и пропущане. При завъртане на анализатора на определен ъгъл, той ще пропусне само светлината, имаща определена равнина на поляризация, т.е., преминала през определени структури на обекта, които ще изглеждат светли на фона на тъмното поле на микроскопа. Така, в зрителното поле ще се появят само тези двулъчепречупващи светлината съставки на обекта, чиято равнина на поляризация съвпада с равнината на пропущане на анализатора. Така може да се измери оптичната активност на различните структури в обекта, наличието на вътрешно механично напрежение и др.

С помощта на допълнително приспособление - компенсатор, различията в поляризацията в отделните части на пробата се преобразуват в цветови разлики. Някои поляризационни микроскопи са снабдени с поляризационен забавител, който измества фазата на светлината между избраните поляризационни направления, така че да се измери степента на елиптична поляризация, предизвикана от обекта.

При някои поляризационни микроскопи се използва кръгово поляризирана светлина, което позволява да се видят микрообекти (кристали, минерали, масни капки), притежаващи двулъчепречупване. Такива обекти са невидими с обикновена светлина.

3. Наблюдение на прозрачни обекти в преминала светлина с променена фаза (фазовоконтрастен микроскоп). Фазовоконтрастната микроскопия се прилага широко за наблюдаване на живи, безцветни и неоцветени клетъчни обекти, което е от особен интерес за цитологията. При този вид наблюдение, обектът трябва да съдържа структури, които се различават по своя коефициент на пречупване на светлината n. Наблюдаваният предмет се осветява със сноп кохерентни лъчи, т.е, лъчи които имат еднаква честота и еднаква фаза при което трептенията в отделните лъчи настъпват едновременно. Фазовият ъгъл на трептене на излизащите от обекта лъчи зависи от изминатия оптичен път n.L. Ако два лъча преминават през две структури с различен коефициент на пречупване на светлината, излизащите лъчи ще са изминали различен оптичен път n.L и ще имат различна фаза, т.е, трептенията в тези лъчи ще настъпват в различно време. Променената фаза на трептене в отделните светлинни лъчи се използва за построяване на образ на обекта. Това става с помощта на специално приспособление, превръщащо изменението на фазата в интензивност на лъчите. Съобразно това приспособление, съществуват два вида фазовоконтрастни микроскопи - интерференчен и фазово-контрастен.

При фазово-контрастния микроскоп, в обектива се поставя фазова пластинка, чиято периферия (венец) има показател на пречупване различен от този в средната й част. Ако венецът на фазовата пластинка е по-слабо пречупващ от средната част, обектите с по-висок коефициент на пречупване на светлината се виждат по-тъмни от фона - получава се т.нар положителен фазов контраст. Ако венецът е по-силно пречупващ, тези обекти са светли на тъмен фон - отрицателен фазов контраст. Внасянето на допълнителна абсорбция на светлината във венеца намалява ореола около обектите, което е характерно за т.нар. аноптрален контраст (по финландския хистолог А. Вилска). Отрицателният и аноптралният контраст се предпочитат при наблюдение на дребни обекти, които биха контрастирали недостатъчно при положителен фазов контраст.

При интерференчния микроскоп може да се измери фазовата разлика, внесена от обекта. Това става чрез сравнение със сноп лъчи, преминали в страни от наблюдавания обект. Най-често се използва интерференчният микроскоп на Лебедев (1930 г.). Тъй като фазовите разлики зависят от коефициента на пречупване на светлината, а този коефициент зависи от концентрацията на разтворените в обекта вещества, от фазовата разлика може да се изчисли обема, сухата маса, белтъчното съдържание и изпъкналостта на обекта. Чрез две последователни измервания е възможно да се определи масата на разтворените вещества или броят на рецепторите, свързващи вещества с позната молекулна маса в отделни клетки.

4. Наблюдение с разсеяна светлина (наблюдение в тъмно поле –ултрамикроскоп, тъмнополев микроскоп). Този вид микроскоп се използва за наблюдение на колоидни частици, суспендирани във водна среда, които са твърде малки за да се видят в обикновен светлинен микроскоп. Всеки обикновен микроскоп може да се превърне в тъмнополев ултрамикроскоп чрез замяна на обикновения му кондензор с тъмнополев. Централната част на светлинният сноп, излъчен от светлинния източник, се засенчва в долната фокална равнина на тъмнополевия кондензор, а периферната част на снопа се насочва косо към обекта. Тъй като кондензорът осветява пробата странично, в микроскопа попадат само разсеяните от частиците светлинни лъчи. Отделните частици се виждат като точки светещи с отразена светлина на фона на околното тъмно поле. При този метод на наблюдение може да се регистрира само концентрацията и движението на частиците, докато тяхната структура не може да се види. Той е особено ценен когато се изследва подвижността на бактерии и сперматозоиди чрез заснемане със сравнително дълга експозиции, при което се регистрира траекторията на обекта.

Понякога вместо кондензор от лещи се използва сферично огледало (кардиоиден кондензор).

5. Наблюдение с луминесцентна светлина (флуоресцентен микроскоп). Източникът на светлина е живачна лампа под високо налягане, излъчваща предимно ултравиолетова или синя светлина. Този вид късовълново лъчение е способно да предизвиква фотолуминесценция (флуоресценция). Флуорeсценцията е свойство на някои вещества (луминофори) под въздействие на късовълново фотонно лъчение да излъчват светлина с по-голяма дължина на вълната. Тя се дължи на преминаването на електроните на луминофора на по-външна орбита, като при възвръщането им се освобождава квант светлина.

Кондензорът осветява странично обекта, който играе ролята на луминофор. Попадналата в обекта късовълнова светлина възбужда фотолуминесценция, която може да бъде първична (собствена, дължаща се на собствените молекули на обекта) или вторична (дължаща се на внесени отвън флуоресциращи багрила – флуорохроми, луминесцентни маркери или сонди). Светлината, излъчена от луминесциращите структури на пробата попада в микроскопа и създава увеличен образ. Луминесцентният микроскоп съдържа лещи, направени от кварцово стъкло, защото само такъв вид стъкло пропуща ултравиолетовата светлина.

Този метод на наблюдение дава добър контраст на образа, тъй като и възбуждащата и излъчената светлини се филтрират през тесни монохроматични филтри. Флуоресцентният микроскоп може да се използва за т.н. флуоресцентен анализ, който е високочувствителен метод и особено ценен за имунологията и цитохимията. Чрез него може да бъдат разграничени концентрации от порядъка на 50 молекули флуорохром на квадратен микрометър. Предварително към отделни структури на пробата (например към даден вид бактерии) могат да се свържат специфични антитела, конюгирани с луминесцентни маркери, което кара тези структури да светят в тъмното поле на микроскопа. Така много бързо и със сигурност може да се установи присъствието на определен вид патогенни клетки в пробата.

6. Стереоскопичен микроскоп. Състои се от два еднакви тубуса, монтирани един до друг с оптични оси сключващи малък ъгъл помежду си, така че да е възможно наблюдение на даден обект с двете очи. В този случай се възстановява естествения стереоскопичен ефект, характерен за човешкото зрение. С този микроскоп отделните детайли на обекта могат да се отличат съгласно тяхната височина и разположение в дълбочина. Увеличението на микроскопите е обикновенно между 5 и 50 пъти. Стереоскопичният микроскоп се използва в случаите, когато се налага точна настройка на микроинструменти и детайли в тримерното пространство: при дисекция на тъкани, при микроманипулации с различни клетки, в микрохирургията, при монтаж на микроелектронни схеми, във фината механика, археологията и др.

7. Конфокален сканиращ микроскоп. Обикновенният светлинен микроскоп има този недостатък, че в дадена точка от образа на наблюдавания обект попада не само светлината, идваща от съответната точка на обекта, но и странична светлина отразена от другите точки на обекта. Това създава силен фон и влошава контраста на образа. Освен това трудно се създава обектив, който да може едновременно да вижда всички точки на обекта и да има ниска аберация. При сканиращия конфокален микроскоп тези недостатъци се избягват като в даден момент чрез лазерен лъч се осветява само една точка от обекта, която започва да луминесцира. Излъчената луминесцентна светлина се използва за създаване на увеличен образ на точката, който се проектира върху малък отвор върху екран. Зад отвора минава само светлината, излъчена от осветената точка, като разсеяната светлина се спира от екрана. Преминалата през отвора светлина дава образ на осветената в момента точка от обекта, който се запаметява в компютър. След това лазерният лъч се насочва към друга точка и нейният образ отново прекарва през отвора на екрана и се запаметява. Така целият обект се сканира за части от секундата и от всички запаметени точки се изгражда цялостен образ на обекта. Този вид микроскопи имат сложно устройство и са много скъпи, но създават много качествени тримерни образи на наблюдаваните обекти.

Светлината е напречна електромагнитна вълна съставена от бързо променящо се електрично и магнитно полета. Векторите на електричното поле Е и на магнитното поле Н трептят перпендикулярно на светлинния лъч в същото време перпендикулярно един спрямо друг. Поради това, че светлината е напречна вълна, тя може да се поляризира, т.е може да се разрешат само трептения в определена посока или равнина.

Обикновено, снопът светлинно лъчение съдържа огромен брой елементарни лъчи, във всеки един от които Е трепти в своя равнина. Ако отделните равнини на трептене са различни, имаме обикновена, неполяризирана светлина (Фиг. 6.7.1 - А), ако са близки една до друга имаме частично поляризирана светлина (Б) и ако съвпадат напълно имаме плоско (линейно) поляризирана светлина (В). Равнината, в която векторът на електричното поле Е трепти се означава като равнина (ос) на трептене, а перпендикулярната й равнина – равнина (ос) на поляризация.

Повечето светлинни източници (лампи, пламък, слънце) дават неполяризирана светлина. Светлината, особено плоскополяризираната, има лечебен ефект при кожни болести, рани и др. Плоскополяризирана светлина се получава в следните случаи:

а) отражение и пречупване на обикновена светлина на границата между два прозрачни диелектрика - например вода/въздух (Фиг. 6.7.3). Поради това, много насекоми, живеещи близо до водни повърхности, са адаптирани да виждат само плоскополяризирана светлина. Степента на поляризация на отразената светлина зависи от ъгъла на падане и при определен ъгъл на падане, _Б (ъгъл на Брюстер), тя става 100 % (Фиг. 6.7.3). Равнината на трептене на отразения лъч е успоредна на разделителната повърхност между двете среди, а тази на пречупения лъч е перпендикулярна на разделителната повърхност.



Фиг. 6. 7. 3. Поляризация на светлината при отражение и пречупване от диелектрична среда.

б) пречупване на обикновена светлина от специални, двойно пречупващи кристали (калцит, турмалин, герапатит). През 17 век датския лекар Еразмус Бартолин открил, че кристалът от калцит (калциев карбонат) е двойнолъчепречупващ, т.е., има не един, а два показателя на пречупване на светлината (Фиг. 6.7.4). В момента на пречупване, падащият лъч се разделя на два лъча, обикновен (о), който се подчинява на закона на Снелиус и необикновен (е), който не се подчинява на този закон. И двата лъча са плоскополяризирани, но имат различна скорост на разпространение (двулъчепречупване) и се поглъщат в различна степен от кристала (дихроизъм).

Поляризаторите представляват оптични елементи за получаване на плоско поляризирана светлина чрез двойно лъчепречупване. От получените два плоскополяризирани лъча, единият се отстранява, а се използва другият – най-често необикновеният. В призмата на Никол, изработена от калцит, обикновения лъч се отстранява благодарение на по-силното му пречупване. В т.н. поляроиди (пластмасова пластина съдържаща еднакво ориентирани кристалчета от турмалин или герапатит), този лъч се отстранява поради силното му поглъщане от самия кристал.

Всеки поляризатор има равнина на поляризация и равнина на пропущане. Равнината на пропущане съвпада с равнината, в която трепти вектора на електричното поле на излизащия от поляризатора лъч светлина. Нарича се така, защото ако на входа на поляризатора пада плоско поляризирана светлина, тя ще се пропусне на изхода само ако нейната равнина на трептене съвпада с равнината на пропущане. Равнината на поляризация е перпендикулярна на равнината на пропущане.

Нека имаме два поляризатора П и П', чийто равнини на поляризация сключват ъгъл  помежду си (Фиг. 6.7.5). Върху първият поляризатор пада лъч обикновена светлина, който на изхода му се превръща в лъч плоскополяризирана светлина с интензивност I_o. Вторият поляризатор ще пропусне само част от падащия върху него лъч плоскополяризирана светлина, поради несъвпадение на неговата равнина на пропущане с равнината на трептене на лъча. От тук, интензивността на изходящия лъч светлина I ще се даде със закона на Малюс: I = I_o. cos² . В случая, поляризаторът П' играе ролята на анализатор, чрез който може да се установи равнината на поляризация на дадена плоскополяризирана светлина.

При преминаване на плоскополяризирана светлина през разтвор на вещества, чийто молекули съдържат въглероден атом с четири несиметрични връзки (захари, аминокиселини, белтъци, лекарства) се получават явленията двулъчепречупване и дихроизъм. Нека имаме кювета с дължина L съдържаща разтвор на такова вещество с концентрация C и на нейния вход пада плоскополяризирана светлина (Фиг. 6.7.6). На входа на кюветата, плоскополяризираната светлина може да се представи като сума от две кръговополяризирани съставки (ляво и дясно въртящи се) които имат еднаква амплитуда. Разтворените молекули, понеже са несиметрични, поглъщат нееднакво ляво- и дясновъртящата съставка на светлината (кръгов дихроизъм) и ги пропускат с различна скорост (двулъчепречупване). На изхода на кюветата, двете съставки вече ще имат различни амплитуди (понеже са различно отслабени) и различни фази (понеже се движат с различна скорост). Изходящият светлинен лъч се получава от сумирането на тези две съставки. Понеже имат различни амплитуди, при сумирането си двете съставки дават елиптично поляризирана светлина. Различните фази на съставките (двулъчепречупването) пък поражда завъртане на равнината на поляризация на излизащата светлина на ъгъл  = []. L. C.