Програма „развитие на човешките ресурси bg051PO001 06 -0059



Дата01.11.2017
Размер56.98 Kb.



ЕВРОПЕЙСКИ СОЦИАЛЕН ФОНД 2007 – 2013

МИНИСТЕРСТВО НА ОБРАЗОВАНИЕТО И НАУКАТА

ОПЕРАТИВНА ПРОГРАМА „РАЗВИТИЕ НА ЧОВЕШКИТЕ РЕСУРСИ”
BG051PO001-3.3.06 -0059

ФУНДАМЕНТАЛНО И ПРИЛОЖНО ОБУЧЕНИЕ

НА ДОКТОРАНТИ, ПОСТДОКТОРАНТИ,

СПЕЦИАЛИЗАНТИ И МЛАДИ УЧЕНИ

В ИНТЕРДИСЦИПЛИНАРНИ БИОЛОГИЧНИ НАПРАВЛЕНИЯ

И ИНОВАЦИОННИ БИОТЕХНОЛОГИИ.
Проектът се осъществява с финансовата подкрепа на Оперативна програма „Развитие на човешките ресурси” 2007-2013, съфинансирана от Европейския съюз чрез “Европейския социален фонд“
Снежана Кестенджиева, ИБИР

Темата по която работя е ПЪПНАТА ВРЪВ КАТО АЛТЕРНАТИВЕН ИЗТОЧНИК НА МЕЗЕНХИМНИ СТВОЛОВИ КЛЕТКИ.


Стволовите клетки предизвикват все по-голям интерес в биологичната наука и в медицината, както от фундаментално научно естество, така и с перспективите им за приложение в клиничната практика .Стволовите клетки са в основата на регенеративната медицина, чиято цел е да се възстановят напълно или частично увредени клетки или тъкани и, съответно, да бъдат повлияни благоприятно определени злокачествени, дегенеративни, автоимунни и други заболявания.

Мезенхимните стволови клетки са постембрионални, мултипотентни, нехемопоетични, фибробластноподобни клетки, участващи във възобновяването на разнообразни тъкани(адипоцити,остеоцити, хондроцити, тендоцити) с мезенхимен произход.

Първият източник на мезенхимни стволови клетки е костния мозък, но процедурата за добиване на човешки костен мозък е силно инвазивна и болезнена хирургическа интервенция, криеща допълнителни рискове за здравето на донорите, а количеството на получения тъканен материал е строго лимитирано, което, от своя страна, предопределя твърде нисък клетъчен добив и възпрепятства провеждането на пълноценни научни и клинични изследвания. Това налага търсене на алтернативни източници на мезенхимни стволови клетки (МСК) за терапевтични цели.

В тази връзка, пъпната връв, със своята достъпност е от особен интерес. Количеството на изолираните клетки е голямо, а феталният произход предполага по-голям пролифератифен и диференционен потенциал. Стволовите клетки от пъпна връв са идентични с костномозъчните по отношение на всички основни характеристики – морфология, фенотип и функционален потенциал.

Целта на научната ми дейност беше Изолиране на мезенхимни стволови клетки от субендотелния слой на умбиликалната вена и характеризирането им.

Морфология на изолираните клетки от вената на пъпна врев

Пъпните върви (10 броя) бяха взети след нормални раждания с информирано съгласие на майката спорецпротокол одобрен от Етичната комисия. Изолираните клетки се култивират в DMEM-LG, като за експерименти бяха използвани клетки от 3-4 пасаж. На снимката в дясно е представена морфологията на изолираните от мен клетки. Клетки са с вретеновидна, фибробластоподобна форма и растат като образуват колонии.

Характеризиране на изолираните клетки от пъпна връв

Култивираните клетки от пъпна връв бяха анализирани за експресия на на редица повърхностни и вътреклетъчни протеини, с помощта на имунофлуоресцентни техники и поточна флоуцитометрия. Резултатите показаха, че клетките са отрицателни за повърхностните хемопоетични и лимфоцитни маркери CD34(маркер за еднотелно/хематопоетични клетки); CD45; CD3; CD19; CD14; CD16; CD56 и за HLA-DR , което потвърждава високата степен на чистота ма клетъчната култура. Докато експресират протеините CD29, CD73, CD90 и CD105, които са възприети в научната литература като определящи фенотипния профил на мезенхимните стволови клетки Установи се също така, че клетките се позитивират за Vimentin, но не и за vWF. Vimentin е интермедиерен филамент при клетки с мезенхимен произход, а vWF е маркер за ендотелни клетки.

Тези данни изключват възможността за изолираните от нас клетки да принатдлежат към хемопоетичния ред и ендотела на пъпната връв, като същевременно потвърждават фенотипния им облик на мезенхимни стволови клетки.

Като автофлуоресцентна контрола бяха използвани клетки, немаркирани с антитела.

Следващата стъпка за допълнително характеризиране беше да изследваме потенциалът им за диференциация в два различни клетъчни вида.

За индуциране на остеогенна и адипогенна диференциация, бяха използвани 3-4 ти пасаж клетки и култивирани в среда с присъствието на специфични индуциращи фактори за 21 дни. Контролните групи клетки бяха култивирани само в DMEM-LG с 10% FCS, също за 21 дни.
Остеогенната диференциация беше индуцирана за 3 седмици в DMEM-LG с 10% FCS, 0,1μМ дексаметазон, 10 μМ β-глицерофосфат и 50 μМ аскорбинова киселина. Наличието на диференцияция беше доказано чрез специфично хистологично оцветяване за доказване на Са2+ -отлагания в екстрацелуларния матрикс по von Kossa. Остеогенно диференцираните клетки бяха промити еднократно с дестилирана вода, след което бяха третирани с 1%-ен разтвор на сребърен нитрат при облъчване с ултравиолетова светлина в продължение на 60 мин. При остеогенно диференцираните клетки има интензивно черно оцветяване на калциевите натрупвания в екстрацелуларния матрикс, докато при контролните клетки няма оцветяване.
За адипоцитната диференциация клетки от 3-4 ти пасаж бяха култивирани в DMEM-LG с добавени 10% FCS, 1μМ дексаметазон, 10μg/ml говежди инсулин, 0,5 mM IBMX и 200 μМ индометацин за 21 дни. Наличието на успешно диференциране бе установено чрез хистохимично оцветяване с багрило Oil Red O за детекция на неутрални липидни вакуоли.

При адипогенно диференцираните клетки се наблюдават червено оцветени вътреклетъчни вакуоли, докато при недиференцираните клетки от контролната група не бяха установени липидни капки.


Изложените дотук резултати дават достатъчно основание изолираните от нас клетки да бъдат еднозначно определени като мезенхимни стволови клетки.
Следващата стъпка беше изледване възможността за ендотелна диференциация на мезенхимните стволови клетки, изолирани от пъпна връв.

За индуциране на ендотелна диференциация клетките се култивират в DMEM-LG с 3% фетален серум, 50ng/ml и хипофизен екстракт и10ng/ml (β-FGF) фибробластен растежен фактор върху покрити с матригел плаки. През първите 3-4часа клетките започнаха да формират малки и нарядко свързани помежду си групички, през следващите 12 часа клетките се разрастнаха и се наблюдаваха тънки връзки помежду им, оформяйки полигонални съдоподобни структури. След 24 часа полигонални съдоподобни структури се увеличиха и заеха цялата свободна повърност. Върху матригел клетките формират полигонални съдоподобни структури, които се увеличават във времето. Морфологичните промени бчха установени чрез светлинен микроскоп и заснети in vitro.

За да докажем еднотелната диференциация , същите тези клетки бяха отделени от матригел-а и изследвани за експресиа на еднотелните маркери vWF,CD31 и KDR, чрез имунофлуоресценция.

Анализираните клетки бяха позитивни и за трите маркери, факт, който доказва още веднъж успешната еднотелна диференциация.


Това което бих искала да изследвам с помоща на този проект е да анализирам възможността за диференциация на мезенхимните стволови клетки в трите ембрионални пласта.


През последните години беше изяснено, че мултипотентността на МСК не се ограничава само до мезодермалните тъкани, а включва и възможността за диференциация в клетъчни

типове, произлизащи и от други зародишни пластове като ендодерма (хепатоцити) и

невроектодерма (неврони; астроцити; олигодендроцити), което е ярък пример за проява



на клетъчна пластичност от страна на представители на постнаталните (постембрионалните) стволови клетки.
Материалите, които ще са ми необходими за иследване диференциацията на мезенхимните стволови клетки в клетки с ендодермален произход са:

  • Консумативи за клетъчно култивиране

  • Кит за пролиферация

  • Фактори за диференциация

  • Консумативи за изориране на RNA и RT-PCR

  • Антитела за имунофлуоресценция


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница