Биоенергетика Цели Цели на преподавателя

При необходимост специален ензим трансхидрогеназа може да пренасочва големи потоци водород от катаболитно в анаболитно направление и обратно, тъй като катализира обратимата оксидо-редукция между двете никотинамидни редокс-системи:

трансхидрогеназа

НАДФН + НАД⁺ <=========> НАДФ⁺ + НАДН

.

5.2.6.2 Флавинови редокс-системи

Кислородът, крайният акцептор на електрони в аеробните организми, може да приема само единични (несдвоени) електрони. А от метаболитите електроните се отделят по двойки. Чрез семихиноновата форма се осъществява преход между дву- и едноелектронен пренос.

Редокспотенциалът им е по-висок от този на никотинамидните редокс-системи, но по-нисък от този на цитохромите (табл. 5-4). ФМН и ФАД са коензими на анаеробни дехидрогенази от дихателната верига (флавопротеини) и на други оксидази (аеробни дехидрогенази), които предават водорода директно на О₂.



Фиг. 5-6. Оксидо-редукция между флавинова редокс-система и субстрат под действие на дехидрогеназа.

5.2.6.3 Редокс-системи с хинонова структура

 На фиг. 5-7 е представена структурата на трите форми на КоQ (редуцирана, семихинонова и окислена). Наричан е и убихинон (от английски ubi- повсеместен). KоQ.H₂ и KoQ са подвижни, несвързани с белтък компоненти на дихателната верига, а семихиноновата форма е прикрепена към Q-белтък, намиращ се от двете страни на вътрешната митохондрйна мембрана. Бензохиноновото ядро и полиизопреновата странична верига му придават хидрофобни свойства и позволяват придвижването му във вътрешната митохондрийна мембрана. Като подвижен компонент в излишък, убихинон участва в преноса на електрони между неподвижно вградени компоненти на дихателната верига, а именно между флавопротеините и цитохромите (виж фиг. 5-17 в т. 5.4.2). Участва и в изпомпването на протони от матрикса към междумембранното пространство посредством т.н. Q-цикъл, описан в т. 5.4.9.

Фиг. 5-7. Редуцирана, семихинонова и окислена форми на КоQ (убихинон). n - брой на изопреновите остатъци. При човек n = 10.

5.2.6.4 Метал-съдържащи редокс-системи

 Железни или медни йони, обикновено здраво свързани с белтъчен компонент, могат да пренасят електрони:

В част от тези белтъци, освен желязо има и сяра в еквимоларни количества с желязото - наричат се Fe-S белтъци и са част от сложно устроените ензими в дихателната верига.

Други Fe-съдържащи редокс-системи са хемове. На фиг. 5-8 е дадена редуцираната форма на хема на цитохром b, който е идентичен с хема в хемоглобин и миоглобин.

Хем-съдържащи белтъци са цитохромите в дихателната верига и в електрон-пренасящи вериги в ендоплазмения ретикулум. В различните цитохроми хемовете се различават по страничните заместители и връзки с белтъчната съставка. Но общото за всички хемове в цитохромите е, че валентността на Fe-йон се мени от +2 до +3 и обратно и така се осъществява пренос на електрони. Това е съществена разлика от непроменящата се валентност на Fe²⁺-йон в хема на хемоглобин и миоглобин, които пренасят кислород, а не електрони.

Фиг. 5-8. Структура на хема на цитохром b (редуцирана форма).

5.2.6.5 Тиолови редокс-системи

 Тук спадат липоева киселина (липоат) (фиг. 5-9А) и глутатион (.фиг. 5-9Б).

Глутатионът е трипептид: -глутамил-цистеил-глицин. В окислената форма две молекули глутатион са свързани чрез дисулфиден мост. Като кофактор на глутатион пероксидаза участва в обезвреждането на водороден пероксид и свободния хидроксилен радикал (виж т. 5.5.4).

5.2.6.6 Аскорбинова киселина (аскорбат)

 Тази редокс-система е в същност витамин С. На фиг. 5-10 са дадени окислената и редуцираната форми. Не се синтезира в човек и трябва да се приема редовно с храната. Витамин С е добър редуктор (Е^о ' = + 0.08) и може да редуцира О₂, нитрати и цитохроми а и с. Като водно-разтворим антиоксидант инхибира образуването на нитрозамини в храносмилателния тракт. Усвояването на желязо е по-добро в присъствие на витамин С. Участва във важни окислителни реакции, някои от които в катаболитни пътища (разграждане на тирозин), а други в синтезни пътища: синтеза на норадреналин, образуване на жлъчка, стероидогенеза, зреене на колаген.

Фиг. 5-10. Окислена и редуцирана форма на аскорбинова киселина.

5.2.7 Биологичното окисление на субстратно ниво генерира НАДН и НАДФН

Обобщавайки познанията за биологичното окисление, ясно е, че субстратното окисление е едностъпално анаеробно дехидрогениране на стотици различни субстрати под действие на специфични ензими дехидрогенази, кооперирани най-често с редокс-системите НАД⁺+ и НАДФ⁺. В резултат значителни количества водород под форма на НАДН могат да постъпят в дихателната верига или под форма на НАДФН да се използват за редукционни биосинтези.

Субстратното окисление е начален етап, предшестващ окислението в дихателната верига.

Енергията, отделена при субстратното окисление, поради малката разлика в редокспотенциалите, обикновено се разсейва като топлина, тъй като не достига за образуване на 1 мол АТФ . Има само три случая, когато едновременно с окислението се извършва и акумулиране на отделената енергия в макроергично съединение и те са разгледани в следващата точка 5.3.

5.3 Окислително фосфорилиране на субстратно ниво

5.3.1 Резюме

Сред стотиците случаи на субстратно окисление има само няколко, при които отделената енергия е достатъчна за образуване на макроергично съединение. Два от тях (окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат и енолазната реакция) са част от гликолизата. Протичат в цитоплазмата под действие на единични ензими. Окислителното декарбоксилиране на -кетокиселини е по-сложен процес, катализира се от дехидрогеназни комплекси и протича в митохондриите.

Окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат се катализира от глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, която свързва субстрата към цистеинова сулфхидрилна група в активния център и с коензим НАД⁺ осъществява окислението на алдехидната група на субстрата. Това е екзергонична реакция, при която отделената енергия не се разсейва, а се акумулира в тиоестерна макроергична връзка в рамките на ензим-субстратния комплекс. Освен оксидоредуктазна активност, ензимът има и трансферазна активност, чрез която прехвърля ацилния радикал върху фосфат. Получава се макроергичният продукт 1,3-бисфосфоглицерат, предшественик на АТФ. Макроергичната му фосфатна група се използва за фосфорилиране на АДФ до АТФ.

Енолазната реакция е единствената позната реакция в биосферата, при която неорганичен фосфат се издига от нормоергично на макроергично ниво. При нея без участието на външна редокс-система, енолазата катализира дехидратиране на 2-фосфо-глицерат до друг предшественик на АТФ - фосфоенолпируват (ФЕП), който е с най-висока стойност на G^o' за хидролиза. Дехидратирането може да се разглежда като вътрешномолекулна оксидо-редукция, съпроводена с отделяне на енергия, която се консервира в енол-фосфатната макроергична връзка. Последващият пренос на макроергичната фосфатна група от ФЕП върху АДФ е необратима реакция, тъй като тавтомеризирането на първоначално получаващия се енол-пируват до кето-пируват е силно екзергонична реакция.

Макар и със скромен количествен принос гликолитичните фосфорилирания са важни в условия на кислородна недостатъчност.

Окислителното декарбоксилиране на -кетокиселините пируват до ацетил-КоА и на -кетоглутарат до сукцинил-КоА са важни реакции. Първата осъществява връзката между гликолизата и цитратния цикъл, а втората е част от цитратния цикъл.

Пируватдехидрогеназният комплекс (ПДХ) се състои от три ензима и 5 кофактора: пируват дехидрогеназа (Е₁) с кофактор тиамин пирофосфат (ТПФ), дихидролипоил трансацетилаза (Е₂) с простетична група липоамид и външен КоА, дихидролипоил дехидрогеназа (Е₃) с ФАД и външен НАД ⁺.   -кетоглутарат дехидрогеназният комплекс се отличава от ПДХ само по първия ензим.

Организирането на ензимите в сложно устроени комплекси има следните предимства:

2) Намалява се възможността междинните метаболити да реагират с други молекули в странични реакции;

5.3.2 Разлика в редокс-потенциалите на реагиращите редокс-системи, необходима за синтеза на АТФ

Окислително фосфорилиране на субстратно ниво е синтезата на АТФ или други макроергични съединения за сметка на енергия, отделена при субстратно окисление.

При оксидо-редукционните процеси отделената свободна енергия може да се изчисли от израза (5.2.4):                      - G = n F E^o'

В живите клетки физиологичните концентрации на АТФ, АДФ и Ф не са 1 mol/L, а обикновено 5, 4 и 2.1 mmol/L, съответно. Тогава и G^o' за хидролиза на АТФ е 42.7 KJ/mol (вж т. 5.1.7). В такъв случай E^o' на реагиращите редокс-системи трябва да бъде по-висок - около 0,2 до 0,25 v.

Сред стотиците случаи на субстратно окисление има само три случая, когато отделената енергия не се разсейва като топлина, а се акумулира в продукта на окислението, който е макроергично съединение.
Тези случаи на субстратно фосфорилиране или по-общо казано, на енергетично спрягане на субстратно ниво, са:
1) окислително фосфорилиране на глицералдехид -3-Ф;

2) окислително декарбоксилиране на -кето киселини;

5.3.3 Окислително фосфорилиране на глицералдехид 3-фосфат

Този процес (фиг. 5-11) е част от гликолизата. Той илюстрира основен принцип в биоенергетиката: окислението на субстрата е съпроводено с отделяне на енергия; отделената енергия се акумулира в макроергично съединение.

Фиг. 5-11. Молекулен механизъм на окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат.

Субстрат на реакцията е глицералдехид-3-фосфат. Катализира се от глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа. В активния център на ензима има -SH група от цистеинов остатък за свързване на субстрата. Като коензим участва редокс-системата НАД⁺. Алдехидната група на субстрата се окислява, отделя се енергия и тя се акумулира в макроергична тиоестерна връзка в рамките на ЕS комплекс. Редокс-системата се редуцира. Външен окислен НАД⁺ измества редуцирания НАДН.

В следващия етап тиоестерната връзка се превръща в ацилфосфатна. Ензимът, освен оксидоредуктазна, има и трансферазна активност - катализира още една реакция - прехвърляне ацилния радикал върху фосфат. Получава се 1,3-бисфосфоглицерат.

След това макроергичният фосфат от 1,3-бисфосфоглицерат се пренася върху АДФ - образува се АТФ и 3-фосфоглицерат. Тази реакция се катализира от фосфоглицерат киназа.

Сумарната реакция е окисление на глицералдехид-3-фосфат до 1,3-бисфосфоглицерат с редукция на НАД⁺, спрегнато със синтезата на АТФ от АДФ и Ф. Фосфорната киселина се издига от нулево на високо макроергично ниво в АТФ.

5.3.4 Енолазна реакция

Тази реакция (фиг. 5-12) също е част от гликолизата.

Фиг. 5-12. Окислително фосфорилиране при енолазна реакция.

Отделянето на вода, обаче, може да се разглежда като вътрешномолекулна оксидоредукция - водород се отделя от втория въглероден атом (окисление), а хидроксилна група - от третия въглероден атом (редукция).

Това вътрешно-молекулно прегрупиране е съпроводено с отделяне на енергия, която се акумулира в макроергичната енол-фосфатна връзка. Така че всъщност енолазната реакция, привидно изключение от правилото, също илюстрира общия биоенергетичен принцип, че в резултат на оксидо-редукция се отделя енергия и тя се акумулира в макроергична връзка.

В следващата реакция под действие на пируват киназа енергията, акумулирана в ФЕП, се използва за синтеза на АТФ, като ФЕП се превръща през енол-пируват в неговия тавтомер пируват в кето-форма.

5.3.5 Значение на гликолитичните фосфорилирания

Макар и количественият принос на субстратните гликолитични фосфорилирания да е скромен, разгледаните реакции имат значение, тъй като:
1) В условията на кислородна недостатъчност, напр. в усилено работещ мускул, те са единственият източник на АТФ
2) Не се повлияват от вещества, които инхибират или разстройват (разпрягат) окислението в дихателните вериги и спрегнатото с него фосфорилиране;
3) при митохондрийни заболявания снабдяват клетката с АТФ;
4) доставят АТФ, когато енергията, отделена в дихателната верига, се използва не за синтеза на АТФ, а за други ендергонични процеси;
5) биосинтезите в цитоплазмата се осъществяват с помощта на гликолитичен АТФ.

5.3.6 Окислително декарбоксилиране на -кето киселини

5.3.6.1 Обща реакция и значение

Окислителното декарбоксилиране на -кетокиселини (пируват, -кетоглутарат, -кетобутират и разклонени кето-киселини) се представя най-общо със следната реакция:

+ KoA-SH
R - CO - COOH ----------------------> R-CO ~ S-KoA + CO₂

От карбоксилната група на -кетокиселината се отделя CO₂ с едновременно окисление на -кето групата до -СООН група, така че от алфа-кето киселината се получава карбонова киселина (под форма на тиоестер с КоА). Най-значими са два случая на окислително декарбоксилиране:

За разлика от гликолитичните фосфорилирания, окислителното декарбоксилиране протича не в цитоплазмата, а във вътрешната митохондрийна мембрана, така че отделеният от субстрата водород лесно постъпва в дихателната верига. И в двата случая се катализира от сложни тройни ензимни комплекси: пируват дехидрогеназен комплекс и -кетоглутарат дехидрогеназен комплекс, които се отличават само по първия ензим в комплекса. Затова в т. 5.3.6.2. ще се разгледа само комплексът, действащ върху пируват.

Организирането на ензимите в сложно устроени комплекси има следните предимства:
1) Разстоянието, което субстратите трябва да изминат между активните центрове на ензимите е по-малко, отколкото ако ензимите не са в комплекс. Това увеличава реакционната скорост.

2) Намалява се възможността междинните метаболити да реагират с други молекули в странични реакции;

5.3.6.2 Пируват дехидрогеназен комплекс

Пируват дехидрогеназният комплекс се състои от три ензима и пет кофактора (фиг. 5-13):

Фиг. 5-13. Опростена схема за структурата на пируват дехидрогеназен комплекс, катализиращ окислително декарбоксилиране на пируват. Показани са кофакторите, необходими за действието на всеки апоензим.

1) пируват дехидрогеназа (въпреки, че действа като декарбоксилаза) (Е₁). Действа съвместно с кофактора тиаминпирофосфат (ТФФ) (фиг. 5-14). Тиаминпирофосфат е производно на витамин В₁ (тиамин). Витамин В₁ съдържа пиримидинов и тиазолов пръстени, свързани чрез метиленова група. От значение за свързването на субстрата и декарбоксилирането му е тиазоловият пръстен.




Фиг. 5-14. Структура на тиамин (витамин В₁) (1) и тиамин пирофосфат (2).

2) дихидролипоил трансацетилаза (Е₂). Съдържа като простетична група липоева киселина (ЛК), която е под форма на липоамид, тъй като е ковалентно свързана чрез киселинно-амидна връзка към -амино-група на лизилов остатък в апоензима. Свободен (неензимно свързан) кофактор КоА-SH (фиг. 5-15) е необходим, за да поеме окисления продукт от Е₂. КоА е сложно съединение, производно на витамина пантотенова киселина. Чрез SH-групата на биогенния амин цистеамин КоА образува макроергични тиоестери с карбонови киселини.




Фиг. 5-15. Структура на КоА.

Към аденилов нуклеотид е прикрепена пантотенова киселина, а към нея цистеамин. Пантотеновата киселина съдържа пантоева киселина (,-дихидрокси-, -диметилмаслена киселина) и -аланин. SH-групата на цистеамин образува тиоестерна връзка с получаващата се -СООН група.

Всеки един от тези три ензими се състои от голям брой субединици. Напр. за Е. coli организацията е следната: 24 субединици от Е₁ и 12 субединици от Е₃ са подредени около сърцевина от 24 субединици от Е₂. При еукариоти комплексите са още по-сложни - 60 субединици от Е₁ и 12 субединици от Е₃ са подредени около 60 субединици от Е₂.

5.3.6.3 Молекулен механизъм на окислителното декарбоксилиране на пируват

През първия етап (фиг. 5-16) пируват дехидрогеназата съвместно с ТФФ свързва пируват към тиазоловия пръстен на ТФФ и го декарбоксилира до активен ацеталдехид (1).

Фиг. 5-16. Молекулен механизъм на окислителното декарбоксилиране на пируват под действие на пируват дехидрогеназния комплекс.

1 - свързване на пируват и декарбоксилиране на пируват; 2 -дехидрогениране на хидроксиетил-ТПФ; 3 - Прехвърляне на ацетиловия радикал от липоамид върху КоА; 4 - дехидрогениране на липоевата киселина; 5 - окисление на ФАДН₂.

През втория етап активният ацеталдехид се пренася върху липоева киселина (ЛК) в окислена форма, и свързан с нея, се окислява до активен ацетат (2). При това ЛК се редуцира с разтваряне на дисулфидния мост, а отделената при окислението на активния ацеталдехид до активен ацетат енергия се акумулира в тиоестерна макроергична връзка в рамките на ЕS комплекс между Е₂ и субстрата. Е₂ има и втора активност - да прехвърли получения ацетилен радикал от липоева киселина върху КоА като акцептор (3). Получава се макроергичен продукт ацетил КоА с тиоестерна макроергична връзка, а липоевата киселина остава редуцирана.

В третия етап Е₃-ФАД окислява Е₂-ЛК(SН)₂ (4), а външен НАД⁺ окислява Е₃-ФАД (5). За да се обясни последното, трябва да се има предвид следното: Стандартният редокс-потенциал на свободен ФАД е по-висок от този на НАД⁺ /НАДН + Н⁺, но ензимно свързаният ФАД, поради локални взаимодействия на заредени групи в апоензима близо до ФАД, има по-нисък редокс-потенциал и е възможно да редуцира НАД⁺. Полученият редуциран НАД е субстрат за дихателната верига, която също е локализирана във вътрешната митохондрийна мембрана.

5.3.6.4 Роля на витамините В₁, В₂ , РР и пантотенова киселина в окислителното декарбоксилиране на -кетокиселини

Четири от петте кофактори в окислителното декарбоксилиране са производни на витамини. Тук участват тиамин (В₁) под форма на тиаминпирофосфат, рибофлавин (В₂) под форма на ФАД, никотинамид (РР) под форма на НАД и пантотенова киселина под форма на КоА.

Витамин В₁ освен в окислително декарбоксилиране е кофактор и на транскетолазата в пентозофосфатния път (пренос на С₂ фрагменти). Има го в пълнозърнести житни семена и месо.

Нарушението на окислителното декарбоксилиране при авитаминоза В₁ (при консумиране на лющен ориз, захар, бяло брашно или при алкохолици, които почти не приемат храна) води до заболяването бери-бери - в началото се засяга периферната нервна система, характерни са изтощение, мускулна слабост, кожни нарушения, загуба на тегло. По-късно това прогресира до сърдечно-съдова, нервна и мускулна дегенерация.

5.4 Дихателни вериги

5.4.1 Резюме

Дихателната верига е сложно организирана и специализирана система във вътрешната митоходрийна мембрана със следните функции: да събира редуциращи еквиваленти от различни субстрати, да ги пренася към О₂ (окисление) и да акумулира отделената при окислението енергия като синтезира АТФ (окислително фосфорилиране).

Дихателната верига се състои от разтворими и мембранно свързани компоненти, които са организирани в 4 комплекси, действащи съвместно с АТФ синтаза. Някои от компонентите пренасят по 1 електрон (Fe-S-белтъци, цитохроми, Cu-йони). Други пренасят по 2 електрона (КоQ, ФМН, ФАД).

Електроните се придвижват от редокс-центрове с по-нисък (по-отрицателен) редокс-потенциал към

Комплекс І (850 kD) се състои от 43 субединици с простетична група редокс-системата ФМН. Част от субединиците са Fe-S белтъци. Те съдържат Fe-S кластери като простетични групи, участващи в електронния транспорт. Комплекс І пренася два електрона от НАДН към КоQ и изпомпва 4 протона в интрамембранното пространство.

Комплекс ІІ се състои от сукцинат дехидрогеназа с простетична група ФАД и още три малки хидрофобни субединици, Fe-S кластери, и цитохром b₅₆₀. Комплекс ІІ пренася електрони от сукцинат през ФАД към КоQ, но отделената енергия не е достатъчна за синтеза на АТФ.

Комплекс ІІІ в бозайници е димер, като всеки мономер се състои от 11 субединици, в които влизат цитохром b₅₆₂ (b_Н), цитохром b₅₆₆ (b_L), цитохром c₁ и един Fe-S белтък. Комплекс ІІІ пренася 2 електрона от КоQH₂ към 2 молекули цитохром с и посредством Q-цикъла изпомпва 4 протони в интрамембранното пространство.

Комплекс ІV в бозайници е димер. Всеки мономер се състои от 13 субединици, като трите най-големи и най-хидрофобни субединици (І, ІІ и ІІІ) са митохондрийно кодирани. Комплекс ІV има 4 редокс-центра: меден атом, известен като Cu_B, цитохром a и цитохром a₃ (свързани към субединица І) и двойка медни атоми, известни като Cu_A-център (свързан към субездиница ІІ).
Комплекс ІV редуцира О₂ до 2 H₂О като използва 4 електрона от цитохром с и 4 протона от матрикса. За всеки 2 електрона, които редуцират кислород, се изпомпват в интрамембанното пространство 2 протона.

Съгласно химио-осмотичната теория преносът на електрони по дихателната верига е движеща сила за изпомпване на протони в интрамембранното пространство от комплекси І, ІІІ и ІV, при което се установява трансмембранен електрохимичен градиент. Обратното връщане на протоните в матрикса през F_o-компонент на АТФ-синтазата (F₁-F_o-АТФаза) задвижва нейния F₁-компонент да синтезира АТФ от АДФ и Ф.

Коефициентът на окислително фосфорилиране Р/О, показващ броя на молекулите синтезиран АТФ за 1 атом О редуциран, не е задължително да бъде цяло число. Теоретично изпомпването на 10 протони при преноса на електрони от НАДН към кислород е достатъчно за синтез на 3 мола АТФ. При пренос на електрони от сукцинат през ФАД се изпомпват 6 протони, което е достатъчно за синтеза на 2 мола АТФ. Преносът на 2 електрона през комплекс ІV изпомпва 2 протона, достатъчно за синтеза на 1 мол АТФ. Експериментално определяните стойности на Р/О не са цели числа, а са 2.5, 2 и 1, съответно за пренос на електрони от комплекс І до О₂, комплекс ІІ до О₂ и комплекс ІV до О₂.

Вещества, които снемат мембранния потенциал, действат като разобщители (напр.отровата 2,4-динитрофенол и естествени разпрягащи агенти като Ca²⁺, мастни киселини, билирубин и др.). Олигомицин и други вещества, които се свързват към F_o-компонент на АТФ-синтазата действат като инхибитори на окислителното фосфорилиране, тъй като прекратяват обратния пренос на протони от междумембранното пространство към матрикса.

Познанията върхху дихателни вериги обясняват действието на опасни отрови. Ротенон и барбитурати, антимицин А и смъртоносните КСN и CO, съответно действат като инхибитори на електронния транспорт в комплекс І, ІІІ и ІV. Смъртоносна за алкохолици е комбинацията от барбитурати и етанол, тъй като етанолът усилва депресиращия ефект на барбитурати върху централната система

5.4.2 Локализация и функции - общ поглед

При синтеза на АТФ за сметка на енергия, отделена при окисление в дихателната верига, се говори за окислително фосфорилиране или енергетично спрягане в дихателната верига.

Дихателната верига е локализирана във вътрешната митохондрийна мембрана. Тя е сложно организирана и специализирана система (фиг. 5-17-1) със следните функции:

Тези функции се изпълняват от високомолекулни и сложно устроени оксидо-редуктази (с различни редокс-системи), подредени в белтъчно-липидния слой на вътрешната митохондрийна мембрана по нарастващ редокспотенциал и действащи съвместно със също тъй мембранно разположената и сложно устроена АТФ-синтазна система.