Биоенергетика Цели Цели на преподавателя

*ТМФД - тетраметил-р-фенилен диамин - липидно разтворимо вещество, което заедно с аскорбат подава електрони на комплекс ІV.

**Действието на 2,4-ДНФ ( разпрягащ агент) и на олигомицин (инхибитор на окислителното фосфорилиране) е разгледано в т. 5.4.8.

5.4.7 Дихателен контрол

Измерването на кислородната консумация в присъствие и отсъствие на АДФ позволява да се измерва и степента на дихателен контрол (фиг. 5-22). Тук е представен полярографски запис, демонстриращ дихателен контрол, упражняван от АДФ. Добавеният АДФ (акцептор на енергията) стимулира окислението докато се превърне в АТФ. Тогава без друга добавка дишането възстановява началния слаб интензитет. Нова добавка на АДФ отново би стимулирала окислението и това може да се наблюдава докато свърши кислородът в полярографската клетка. Състоянието на митохондриите след добавяне на АДФ се нарича активно, а след изчерпването на АДФ - контролируемо или неактивно състояние. По-късно е било установено, че всъщност не само АДФ, а фактически отношението [АДФ] [Ф] / [АТФ], наричано фосфатен потенциал, упражнява дихателния контрол. Високи стойности на АДФ и Ф стимулират окислението, а високи стойности на АТФ го инхибират.

Добавянето на разпрягащия агент 2,4-ДНФ разединява окислението от фосфорилирането. Окислението се усилва, но отделената енергия не се акумулира в АТФ, а се разсейва като топлина, т.е. дихателната верига върви на празен ход. В митохондрии с добавен разпрягащ агент не се наблюдава дихателен контрол. На долния запис се вижда, че добавянето на олигомицин прекратява фосфорилирането и окислението. Добавянето на разпрягащ агент след олигомицин стимулира окислението. Това показва, че олигомицинът не действа директно върху окислението, а върху етап от фосфорилирането (първичен ефект), а спирането на окислението е вторичен ефект.

Фиг. 5-22. Полярографски запис на кислородна консумация, демонстриращ дихателен контрол в изолирани митохондрии. с. 4 - неактивно (контролируемо) състояние; с. 3 - активно състояние след добавяне на АДФ. Тези цифри 4 и 3 са въведени от B. Chance (USA), който е описал пет възможни състояния за митохондриите в зависимост от наличието или отсъствието на субстрати, кислород, АДФ и активността на ензимите.

Дихателен контрол се демонстрира само в добре спрегнати митохондрии - т.е. в митохондрии, в които процесите на окисление и фосфорилиране са зависими. Затова наличието на дихателен контрол е чувствителен тест за качеството на изолираните митохондрии - интактност на мембраната и спрегнатост на окислението и фосфорилирането.

5.4.8 Разпрягащи агенти и инхибитори на окислителното фосфорилиране

Опитите с разпрягащи агенти и инхибитори на окислителното фосфорилиране са допринесли за разкриване механизма на образуването на АТФ.

Типичен представител на разпрягащите агенти е 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ). Добавени към изолирани митохондрии, тези агенти разединяват (разпрягат) окислението от фосфорилирането. Поради необразуване на АТФ, клетката изпитва недостиг от енергия и компенсаторно пуска в разграждане нови и нови субстрати на окислението. Окислението се усилва неколкократно, но отделената енергия се разсейва като топлина - дихателната верига върви на празен ход. При по-високи дози може да се стигне до смъртен изход.

Типичен представител на инхибиторите на окислителното фосфорилиране е олигомицин. Този антибиотик инхибира АТФ синтазата, свързвайки се с един от нейните участъци. Спирането на фосфорилирането вторично инхибира и окислението. За разлика от олигомицин, инхибиторите на електронния транспорт първично инхибират окислението, а вторично и фосфорилирането.

5.4.9 Механизъм на окислителното фосфорилиране в дихателната верига

Според по-ранната химическа хипотеза по аналогия със субстратните фосфорилирания във всяко енергетично-спрягащо място отделената енергия се поема от неизвестни междинни спрягащи фактори, при което възникват макроергични съединения, водещи до синтеза на АТФ. Въпреки упоритата работа на водещи изследователски екипи, спрягащите фактори не бяха идентифицирани.

Преносът на електрони по дихателната верига към О₂ е движеща сила за изнасяне на протони от матрикса към междумембранното пространство (фиг. 5-23). Това води до възникване на трансмембранен електрохимичен потенциал, който има две компоненти - химична (натрупване на Н⁺отвън и ОН^- вътре в матрикса) и електрична (натрупване на положителни заряди отвън и отрицателни заряди вътре). Експериментално е доказано, че рН в междумембранното пространство е по-ниско, отколкото в матрикса. Този електрохимичен потенциал задвижва синтезата на АТФ под действие на АТФ синтаза. Структурата на този ензимен комплекс е разгледана в т. 5.4.10

Фиг. 5-23. Механизъм на окислителното фосфорилиране според химио-осмотичната теория на Митчел.

Днес е общоприето, че комплексите I, III и IV действат като протонни помпи.

Химиоосмотичната теория обяснява необходимостта от мембрана, създаването на протонен градиент и действието на разпрягащите агенти и олигомицин, както и необходимостта от специални транспортни системи за АТФ, АДФ, Ф, Ca²⁺, пируват и совалкови системи за внасяне на цитозолен водород. Разпрягащите агенти като слаби ароматни киселини свързват протоните, внасят ги вътре и снемат трансмембранния потенциал. Олигомицинът, токсичен антибиотик, е мощен инхибитор на фосфорилирането, защото се свързва с митохондрийната АТФ синтаза и блокира обратния пренос на протони към матрикса.

5.4.10. Структура и действие на АТФ синтаза

АТФ синтазата е вградена във вътрешната митохондрийна мембрана (фиг. 5-24-1). Състои се от два главни компонента F_o и F₁. Компонентът F₁ напомня кръгла топка за брава или шапка на гъба, откъдето е дошло и названието гъбовидни образувания по кристите. Гъбовидните образувания, състоящи се от АТФ синтазни комплекси, са обърнати към матрикса. Гъбките посредством крачета се съединяват с компонента F_о. Индексът "о" не означава нула, а буквата "о", от олигомицин, който се свързва с тази част от молекулата на АТФ синтазата.

Ако кристите се озвучат с ултразвук, получават се субмитохондрийни частици, в които АТФ синтазните комплекси в гъбките са обърнати към външната среда - "обърнати частици", защото в митохондриите те са насочени навътре, към матрикса. Изолирани от мембраната, тези ензимни комплекси катализират разграждането на АТФ. Оттук идва другото име на комплекса: АТФаза. Но в интактни митохондрии, главната й биологическа функция се състои не в разграждане , а в синтеза на АТФ.

По-късно бе установено, че F₁ се състои от 9 субединици от 5 различни типа , , , , . Субединиците  и  оформят главичката, а останалите - част от крачето.

Фиг. 5-24-1. Структура на АТФ синтазен комплекс. Компонентът F1 се състои от 9 субединици от 5 различни типа , , , ,  . Субединиците  и  оформят главичката, а останалите - част от крачето. Компонентът Fo е разположен в мембраната. В него се свързва олигомицин и блокира преноса на водород през ензима, а с това и окислителното фосфорилиране.

Синтезата на АТФ включва следните три фази:

На фиг. 5-24-2 е даден механизъм за синтезата на АТФ, предложен от P. Boyer [7].

АТФ се синтезира в следните етапи:

5.4.11 Приложение на познанията върху дихателната верига за изясняване механизма на действие на опасни отрови

Вдишването на HCN или поглъщането на KCN, инхибитори за трето енергетично-спрягащо място, инхибира бързо и смъртоносно цитохром с оксидазната реакция в митохондрийните дихателни вериги. Цианидът е една от най-мощните и бързо действащи отрови. Той се свързва с Fe³⁺ на хема на цит. аа₃ и блокира преноса на електрони към О₂. Окислението и фосфорилирането спират и смъртта настъпва за секунди до минути поради недостиг на кислород, най-вече в централната нервна система. Ако диагнозата се постави много бързо, на отровения се дават нитрити, които превръщат окси-хемоглобин в метхемоглобин MetHbOH(Fe³⁺), а той отнема цианидния йон от цит. аа₃-(Fe³⁺-CN^-), образувайки MetHbOH(Fe³⁺)-CN.
Вкарването на тиосулфат води до превръщане на цианида в безвредния тиоцианат под действие на ензима роданаза.

Барбитуратите, специфични инхибитори за първо енергетично-спрягащо място, се използват като приспивателни. Вземането на по-висока доза може да е смъртоносно. Особено опасна е комбинацията от барбитурати и алкохол [6]. Алкохолът усилва депресиращия им ефект върху централната нервна система и инхибира тяхното разграждане. Трезвият алкохолик е по-нечувствителен към тях, тъй като ги разгражда по-бързо. Обикновено до фатален край се стига, когато трезвият алкохолик не може да заспи, въпреки че е поел барбитурати. Раздразнен, той взема още от тях, а също и алкохол. Заспива, но повече не се събужда поради синергийния ефект на барбитуратите и алкохола.

5.5 Свободно окисление

5.5.1 Резюме

С термина "свободно или неспрегнато окисление" се означава окислението, при което отделената енергия не се акумулира в макроергични съединения.

Свободното окисление има значение:
1) за топлопродукцията в топлокръвните организми. Митохондрийните дихателни вериги в мускули и мастна тъкан се разпрягат от повишено съдържание на висши мастни киселини, отделени от триацилглицероли под въздействие на адреналин, който активира липаза в мастна тъкан. В кафява мастна тъкан има разпрягащ белтък термогенин, през който изпомпаните в интрамембранното пространство протони се връщат в матрикса, шунтирайки АТФ-синтазата. Чрез термогенин, вместо за синтеза на АТФ, енергията на протонния градиент се превръща в топлина.

2) за метаболизма (десатурация на висши мастни киселини, неспецифично хидроксилиране на различни чужди за клетката вещества с цел обезвреждане и за специфично хидроксилиране като част от синтезата на стероидни хормони и други вещества.

Непълната редукция на О₂ с единичен електрон под действие на различни фактори води до последователно образуване на супероксиден анион, Н₂О₂ и хидроксилен свободен радикал, които са токсични - модифицират белтъци, нуклеинови киселини и мембранни липиди. Това може да допринася за стареенето и някои дегенеративни болести. За обезвреждането на тези активни производни на кислорода, в организма има специални ензими - супероксид дисмутаза, глутатион пероксидаза с кофактор глутатион, каталаза. Редуцираната форма на глутатион се поддържа с НАДФН и други редуктори (антиоксиданти) като витамин С, -каротен и др.

5.5.2 Топлопродукция

Наред със спрегнатото окисление в клетките се извършва и свободно (неспрегнато) окисление. При него отделената енергия не се акумулира в макроергични съединения, а се превръща в топлина, което е важно за поддържане на постоянна телесна температура в топлокръвните организми. Освен за топлопродукция свободното окисление има значение и за метаболизма (виж т. 5.5.3).

При изстудяване на експериментални животни (гълъби), се забелязва, че те поглъщат 2 - 4 пъти повече кислород. Това голямо увеличение на дишането се осъществява чрез включване на основния дихателен апарат на клетките, т.е. митохондрийните дихателни вериги и преминаването им в разпрегнато състояние. Митохондриите на мускулна и кафява мастна тъкан много бързо се разпрягат при изстудяване. При излизане от топла стая на студено, в първите минути неволно потреперваме. Мускулните влакна се съкращават, като използват наличния АТФ. Това трае минути и е достатъчно за пренастройване на дихателните вериги от спрегнато в разпрегнато състояние. Под влияние на студа от студовите рецептори по кожата се изпраща сигнал в централната нервна система, откъдето пък се сигнализира за отделяне на хормона адреналин, който активира липазата в мастна тъкан. Липазата разгражда мастите до висши мастни киселини (ВМК) и глицерол. ВМК действат разпрягащо върху митохондрийните дихателни вериги в мускулите.

В повечето бозайници, вкл. и човека, при новородени има особена кафява мастна тъкан, чиято главна задача е да продуцира топлина за бебето. Тя е разположена отзад на врата на бебетата. Кафявият цвят идва от присъствието на голям брой митохондрии, и следователно голямо количество цитохроми, чиито хемни групи силно поглъщат видима светлина. В кафявата мастна тъкан митохондриите са практически винаги разпрегнати поради високите концентрации на висши мастни киселини. Ако към изолирани митохондрии от кафява мастна тъкан се добави албумин, който свързва мастните киселини, не се проявява разпрягащият им ефект и митохондриите стават спрегнати. Спящите зимен сън животни (кафяви мечки, мечки-гризли) също имат големи количества от тази тъкан.

Митохондриите на кафява мастна тъкан окисляват субстратите, и най-вече мастни киселини, нормално. Електроните по дихателната верига достигат до кислорода, а това е съпроводено с изпомпване на протони от матрикса, както при другите митохондрии. Но митохондриите на кафява мастна тъкан имат уникален белтък термогенин, наричан още разпрягащ белтък. Този вграден във вътрешната мембрана белтък осигурява път за протоните, без да минават през АТФ синтазата (фиг. 5-25). Като резултат от това шунтиране, енергията на окислението не се акумулира в АТФ, а се разсейва като топлина, което допринася за поддържане на телесната температура. А това е много важно за новородените бебета, които нямат козина както при животните.

5.5.3 Електронен пренос в ендоплазмения ретикулум

Свободното окисление има и метаболитно значение. В ендоплазмения ретикулум има скъсени електронопреносителни вериги, които се отличават от досега разгледаните дихателни вериги в митохондриите по следните 3 неща:
1) локализация;
2) различни компоненти - вместо НАД, по-често НАДФН е донатор на Н, вместо известните цитохроми участват други цитохроми - напр. цит. Р450, цит. в₅;
3) функция - в тях не се произвежда АТФ и топлопродукцията не е главната им задача, макар че известни количества топлина се отделят. В част от веригите се извършва десатурация или получаване на ненаситени мастни киселини (фиг. 5-26), а в други - хидроксилиране на субстрати (фиг. 5-27).





Фиг. 5-26. Скъсена електроно-преносителна верига за десатурация на висши мастни киселини, под форма на активни ацил-КоА. Водородните атоми от мастната киселина редуцират единия кислороден атом. Водородните атоми от НАДФН + Н⁺ редуцират другия кислороден атом.

Фиг. 5-27. Скъсена електроно-преносителна верига за хидроксилиране на субстрати. Единият кислороден атом се използва за получаване на -ОН група, а другият не остава свободен, а се редуцира от водорода на НАДФН + Н+, пренесен по веригата.