Биоенергетика Цели Цели на преподавателя

5.5.4 Образуване и обезвреждане на супероксид, водороден пероксид и свободен хидроксилен радикал

Молекулният кислород има електронен недостиг във външния електронен слой. Редукцията му до вода изисква 4 електрона и 4 протона.

О₂ +  2Н₂  ---> 2 Н₂О

Реакцията на кислород постепенно, с единичен електрон води до последователно образуване на супероксиден анион, Н₂О₂ и хидроксилен свободен радикал (фиг. 5-28). Това става спонтанно в присъствие на феро- и ферийони или други метални йони или редокс-системи, или под действие на ензими.

Трети токсичен радикал е хидроксилният свободен радикал. Той е по-токсичен и по-реактивоспособен от другите два. Може да бъде разрушен при реакция с витамин С, бета-каротен и витамин Е. Това е в основата на защитното антиоксидантно действие на тези витамини. Може да бъде разрушен и при реакция с глутатион под действие на глутатион пероксидаза. Редуциран глутатион се осигурява под действие на глутатион редуктаза с коензим НАДФН + Н⁺.

5.6 Цитратен цикъл

5.6.1 Резюме

Цитратният цикъл е серия от реакции, в които осем ензима последователно разграждат ацетиловата група на ацетил-КоА до CO₂ и H₂O. Това е съпроводено с отделяне на водород под форма на 3 мола редуциран НАД и 1 мол редуциран ФАД. При окислението на НАДН и ФАДН₂ в дихателните вериги се освобождава и акумулира енергия под форма на АТФ. Освен това 1 мол АТФ се получава на субстратно ниво.

Цитратният цикъл има централна роля в метаболизма. Той е главен катаболитен път за разграждане на въглехидрати, масти и белтъци и главен източник на АТФ - четири негови метаболита доставят водород за дихателните вериги. Той е тясно свързан и с анаболитните процеси. От негови метаболити започват важни синтезни пътища.

Цитрат синтазата катализира кондензацията на ацетил-КоА и оксалацетат, която е екзергонична и необратима реакция.

Аконитазата катализира изомеризирането на цитрат до изоцитрат.

Изоцитрат дехидрогеназата катализира необратимото окислителното декарбоксилиране на изоцитрат до -кетоглутарат, съпроводено с отделяне на СО₂ и получаване на НАДН.

-Кетоглутарат дехидрогеназният комплекс катализира необратимото окислително декарбоксилиране на -кетоглутарат до сукцинил-КоА. Това е единствената реакция в цикъла, където се получава макроергично съединение на субстратно ниво. Тук се отделя втората молекула СО₂ и се получава НАДН.

Сукцинат тиокиназата (наричана и сукцинил-КоА синтетаза) спряга превръщането на сукцинил-КоА в сукцинат със синтеза на 1 мол АТФ от АДФ и Ф.

Сукцинат дехидрогеназата, част от комплекс ІІ в дихателната верига, дехидрогенира сукцинат до фумарат. Получава се ФАДH₂. Фумарат се хидратира под действие на фумараза до малат.

Малат дехидрогеназата катализира обратимата оксидо-редукция на малат до оксалацетат, който отново може да се включи в цикъла.

Общата равносметка е, че при разграждане на 1 мол ацетил-КоА до СО₂ и Н₂О се получават теоретично 12 мола АТФ (или 10 съгласно корекцията на Hinkle).

Регулаторните ензими в цитратния цикъл са тези, които катализират необратимите екзергонични реакции: цитрат синтаза, изоцитрат дехидрогеназа и -кетоглутарат дехидрогеназният комплекс. Значение за регулацията има и пируват дехидрогеназният комплекс, доставящ ацетил-КоА. Четири витамини от В-комплекс действат като кофактори на регулаторните ензими, а също и на други ензими от цикъла.

Попълващи (анаплеротични) реакции, като напр. лигазното карбоксилиране на пируват до оксалацетат, поддържат необходимата концентрация на оксалацетат и на други междинни метаболити.

При генетично обусловена недостатъчност на пируват дехидрогеназния комплекс (ПДХ) има повишени нива на лактат, пируват и аланин в серума, което води до хронична лактатна ацидоза. При такива пациенти се наблюдават тежки неврологични разстройства, в повечето случаи със смъртен изход. При шок поради намалено снабдяване на тъканите с О₂ също се инхибира ПДХ и се развива лактатна ацидоза. ПДХ може да се активира с дихлорацетат, тъй като той инхибира киназата на ПДХ и не може да се получи неактивната фосфорилирана форма на ПДХ.

5.6.2 Особености и биологично значение за катаболизма и анаболизма

Като синоними се ползват и названията цикъл на Кребс (по името на откривателя му Ханс Кребс) и цикъл на трикарбоксиловите киселини.

Цитратният цикъл е серия от реакции, които водят до разграждане на ацетил-КоА до СО₂ и Н₂О. Това е съпроводено с отделяне на водород, при окислението на който в дихателните вериги се освобождава и акумулира енергия под форма на АТФ. Междинните продукти на цикъла действат като катализатори - те вземат участие в реакциите, но концентрацията им остава постоянна.

За цитратния цикъл са характерни следните особености:

Цитратният цикъл има централна роля в метаболизма .

Споменатите процеси се извършват в различни тъкани, но черният дроб е единственият орган, където всички те се извършват в значителна степен. Затова особено тежки за организма са последствията при увреждане на голям брой чернодробни клетки (хепатит или цироза). За значението на цитратния цикъл говори и фактът, че не са описани генетични дефекти за ензимите от цитратния цикъл в живи индивиди - очевидно такива дефекти са несъвместими с нормалното развитие, с живота.

5.6.3 Химизъм на реакциите в цитратния цикъл

p>Обобщен вид на цитратния цикъл е представен на фиг. 5-29.

Фиг. 5-29. Метаболити и реакции в цитратния цикъл в обобщен вид. Показани са реакциите, където се получават редуцирани форми на НАД и ФАД, предаващи водород за дихателните вериги.

Фиг. 5-30. Реакции на цитратен цикъл: 1 - Кондензация на оксалацетат и ацетил-КоА до цитрат; 2 - Превръщане на цитрат в изоцитрат; 3 - Окислително декарбоксилиране на изоцитрат (като -хидроксикиселина) до -кетоглутарат; 4 - Окислително декарбоксилиране на -кетоглутарат (като -кетокиселина) до сукцинил-КоА; 5 - Енергията, акумулирана в макроергичната връзка на сукцинил-КоА се пренася върху АДФ и се получава сукцинат и АТФ на субстратно ниво; 6 - Дехидрогениране на сукцинат до фумарат; 7 - хидратиране на фумарат до малат; 8 - дехидрогениране на малат до оксалацетат.

Цитратът се превръща в изоцитрат под действие на аконитаза, която съдържа Fe²⁺ под форма на Fe-S кластер. Това става двустъпално - дехидратация до цис-аконитат и рехидратация до изоцитрат. Реакциите са обратими. Цитратът е симетрична молекула, но аконитазата винаги действа върху тази част, която е от оксалацетат. Свързаният цитрат в поне три точки от активния център вече прави молекулата асиметрична. Инхибитор на аконитазата е флуорацетат. При този ензимен блок се натрупва цитрат.

Изоцитратът се дехидрогенира и декарбоксилира до -кетоглутарат под действие на изоцитрат дехидрогеназа. Това е окислително декарбоксилиране на -хидрокси киселина. НО-група на изоцитрат е в -позиция спрямо -СООН група, която се декарбоксилира. СО₂се отделя от оксалацетатната част. Реакцията е необратима (G₁^o' = - 21 kJ/mol). Известни са три изоензима - митохондрийна НАД-зависима изоцитрат дехидрогеназа, която действа в цитратния цикъл и още два НАДФ-зависими изоензими, един в митохондриите и един в цитоплазмата. НАДН отдава Н в дихателна верига, в която се синтезират 3 мола АТФ.

Следва окислително декарбоксилиране на -кетокиселината -кетоглутарат до сукцинил КоА, чийто молекулен механизъм вече е разгледан (т.5.3.6). Това е третата необратима реакция в цикъла (G₁^o' е - 33 kJ/mol). Тук се отделя втората молекула СО₂. Катализира се от -кетоглутаратдехидрогеназен комплекс, аналогичен на пируватдехидрогеназния комплекс. Единствено първият ензим е различен - специфичен е за -кетоглутарат, а не за пируват. Инхибитор на това окислително декарбоксилиране е арсенит, при което се натрупва -кетоглутарат. Продуктът сукцинил КоА съдържа тиоестерна макроергична връзка, получена на субстратно ниво. Това е единственият пример в цитратния цикъл за енергетично спрягане на субстратно ниво. Освен това полученият НАДН предава Н в дихателна верига, където се получават 3 мола АТФ.

Енергията, акумулирана в сукцинил КоА се пренася върху АДФ - получава се АТФ под действие на ензима сукцинат тиокиназа, наричана още сукцинил КоА синтетаза - от обратната реакция.

В митохондрийния матрикс има втора сукцинил КоА синтетаза, специфична за гуаниловите нуклеотиди, но тя не участва в цитратния цикъл. Алтернативна реакция в извънчернодробни тъкани се катализира от сукцинилКоА-ацетоацетат-КоАтрансфераза (тиофораза), в която превръщането на сукцинилКоА до сукцинат е спрегнато с активирането на ацетоацетат в ацетацетилКоА (глава 7).

Следва обратимо дехидрогениране на сукцината до фумарат под действие на сукцинатдехидрогеназа (разглеждана в ензимологията при конкурентно инхибиране с малонат - т. 4.3.4.) и като един от флавопротеините в дихателната верига (т.5.4.3). Водородът от получения ензимно свързан ФАДН₂ се пренася до О₂, при което се получават 2 мола АТФ. Малонатът действа като конкурентен инхибитор - натрупва се сукцинат.
Фумаразата (фумарат хидратаза) катализира обратимо присъединяване на вода към фумарат. Получава се малат.
Малатът се дехидрогенира до оксалацетат. Редуцираният НАДН предава Н в дихателна верига - получават се 3 мола АТФ.

5.6.4. Метаболитна и енергийна равносметка

Както личи от фиг. 5-29 и фиг. 5-30, на три места в цитратния цикъл има дехидрогеназни реакции с кофактор НАД, който се превръща в НАДН + Н⁺. В тези дихателни вериги, започващи с НАДН, се получават теоретично 3 х 3 = 9 мола АТФ (или 3 х 2.5 = 7.5 съгласно корекциите на Hinkle). В дихателната верига, започваща със субстрат сукцинат, се получават теоретично още 2 мола АТФ (или 1.5 съгласно корекцията на Hinkle). На субстратно ниво при окислителното декарбоксилиране на -кетоглутарат до сукцинат се получава още 1 мол АТФ.
Общата равносметка е, че при разграждане на 1 мол ацетил-КоА до СО₂ и Н₂О се получават теоретично 12 мола АТФ (или 10 съгласно корекцията на Hinkle).
Общото намаление в свободната енергия е около 881 kJ при моларни концентрации на реагиращите вещества. При енергетично съдържание на една ~ връзка от около 34.5 kJ, синтезираните 12 мола АТФ ще съдържат около 47 % от отделената енергия, което е много висок коефициент на полезно действие. Огромната част от промяната в свободната енергия е за сметка на дихателните вериги - 800 kJ. Остатъкът от около 80 kJ идва от останалите стъпала.

Изоцитрат дехидрогеназата и малат дехидрогеназата са обикновени матриксни субстратни дехидрогенази за разлика от тройния ензимен -кетоглутарат дехидрогеназен комплекс, където дехидрогенирането се предхожда от декарбоксилиране. Този дехидрогеназен комплекс, както и сукцинат дехидрогеназата са локализирани във вътрешната митохондриална мембрана. Сукцинат дехидрогеназата е част от комплекс ІІ в дихателната верига.

Сумарната реакция за разграждането на ацетил-КоА в цитратния цикъл и свързаните с него дихателни вериги има следния вид:
СН₃СО ~ SKoA + 2О₂ + 2Н₂О = 2СО₂ + 4Н₂О + КоАSН
Цикълът започва с кондензация на ацетил коА и оксалацетат и завършва с регенерация на оксалацетат, като в хода на реакциите оцетната киселина се разгражда до вода и СО₂. Фактически се разгражда част от оксалацетатната молекула, която се възстановява от внесения ацетат. В четирите окислителни стъпала се отделят 8 атома Н, а в двата етапа на декарбоксилиране се отделят два мола СО₂. Молекулата на ацетата съдържа 4 атома Н, а в цикъла се отделят 8. Допълнителните 4 атома идват от двете молекули вода, които се включват в цикъла. Така при един оборот на цикъла всъщност се разгражда 1 молекула ацетат и 2 молекули вода. В четирите дихателни вериги се образуват 4 молекули вода, които ангажират 2 молекули кислород.

5.6.5 Роля на витамините

Витамините имат ключова роля за цитратния цикъл.
Четири витамина от В комплекс имат точно определени роли в цитратния цикъл:
1) В₁ - под форма на ТФФ е коензим на първия ензим от -кетоглутарат дехидрогеназния комплекс;
2) В₂ - под форма на ФАД е коензим на третия ензим от -кетоглутарат дехидрогеназния комплекс и на сукцинат дехидрогеназата;
3) пантотенова киселина е част от КоА, който като свободен кофактор поема получените при окислително декарбоксилиране ацетилов и сукцинилов радикали;
4) витамин РР - под форма на НАД е коензим на изоцитрат дехидрогеназа, малат дехидрогеназа и -кетоглутарат дехидрогеназен комплекс, а също и на пируват дехидрогеназния комплекс, който доставя ацетил-КоА за цикъла.

5.6.6 Регулация на цитратния цикъл

Интензитетът на цитратния цикъл е под строг контрол. За разлика от други метаболитни вериги, в които има един скорост-определящ ензим, в цикъла има три регулаторни ензими. Това са цитрат синтаза, изоцитрат дехидрогеназа и -кетоглутарат дехидрогеназен комплекс. Тези реакции катализират трите силно екзергонични и необратими стъпала в цитратния цикъл. Освен това, значение за регулацията на цитратния цикъл има и пируват дехидрогеназен комплекс (ПДХ), доставящ ацетил-КоА.

Наличието на субстрати, необходимостта от междинните метаболити като биосинтетични прекурсори и изискванията за АТФ са фактори, повлияващи интензитета на цикъла (фиг. 5-31).

Фиг. 5-31. Регулация на пируват дехидрогеназния комплекс (ПДХ) и цитратния цикъл. Зеленият цвят означава активиране, а червеният - инхибиране.