Биоенергетика Цели Цели на преподавателя

Субстратът НАДН се получава в три вида процеси: 1) множество субстратни дехидрогенирания в матрикса на митохондриите, 2) окислително декарбоксилиране на -кетокиселини; 3) чрез малатната совалкова система, внасяща цитоплазмен Н в митохондриите (вж глава 6).

Сукцинатът е субстрат на комплекс ІІ.

В дихателната верига има и други флавопротеини, близки по структура и функции на комплекс ІІ. Тук спадат ацил КоА дехидрогеназа, електрон-пренасящ белтък, глицеролфосфат дехидрогеназа и др. Всички те имат висока специфичност по отношение на субстратите-донатори на водород - всеки ензим има свой субстрат. Те са анаеробни дехидрогенази и при физиологични условия предават редуциращите еквиваленти само на КоQ, а не на кислорода. Те са сложно устроени, с четвъртична структура. Като редокс-центрове съдържат ФАД и Fe-S белтъци. Благодарение на тези флавопротеини субстрати с по-висок редокс-потенциал могат да доставят водород за дихателната верига.

5.4.3 Молекулно устройство и действие на дихателната верига

Някои от компонентите на дихателната верига са разтворими и подвижни, а други са мембранно свързани. Компонентите са организирани в 4 комплекса, действащи съвместно с АТФ синтаза (фиг. 5-17-2).

Тези комплекси са разположени асиметрично - някои компоненти пронизват мембраната и се издават и към матрикса, и към междумембранното пространство. Едни са по-близо до матрикса, а други до междумембранното пространство.

Фиг. 5-17-2. Асиметрично разположение на компонентите на дихателната верига във вътрешната митохондрийна мембрана. С римски цифри от І до ІV са означени описаните в текста комплекси в дихателната верига.

Като простетична група участва редокс-системата ФМН (виж т. 5.2.6.2). Част от субединиците са Fe-S белтъци. Те съдържат различни Fe-S кластери като простетични групи (най-вече [2Fe-2S] и [4Fe-4S]), участващи в електронния транспорт. В тях желязото е нехемово и е свързано координативно със S атоми. Сярата в тези кластери е два вида - неорганична и органична - от цистеинови остатъци на белтъците.

Комплекс І пренася два електрона от НАДН към КоQ в следната последователност:

НАДН --> ФМН --> Fe-S кластери --> КоQ

Комплекс І е една от трите протонни помпи в дихателната верига. При пренос на 2 електрона от НАДН към KoQ изпомпва 4 протона в интрамембранното пространство (фиг. 5-18-1). Конформацията на окислената и редуцираната форми са различни. В окислено състояние протоните се свързват към аминокиселинни остатъци от матриксовата страна на мембраната. Редукцията води до конформационни промени, при които протонираните групи са вече към интрамембранното пространство и освобождават там протоните.

Този комплекс бе известен и просто като сукцинат дехидрогеназа, но вече се знае, че се състои от сукцинат дехидрогеназа с простетична група ФАД и още три малки хидрофобни субединици, Fe-S кластери, и цитохром b₅₆₀. Комплекс ІІ пренася електрони от сукцинат през ФАД към КоQ, но отделената енергия не е достатъчна за синтеза на АТФ.

Комплекси І и ІІ не действат последователно, а успоредно. И двата комплекса прехвърлят водород от своите субстрати върху KoQ и го редуцират.

КоQ или убихинон, който е подвижен компонент в дихателната верига, служи като колектор на електрони. Продукт на комплекси І и ІІ, той е субстрат за действието на комплекс ІІІ. В окислената и редуцираната си форма КоQ функционира като свободна, нискомолекулна, несвързана с белтък редокс-система. Вече знаем неговата структура (фиг. 5-7 в т. 5.2.6.3). Бензохиноновото ядро и изопреновата верига му придават липофилни (хидрофобни) свойства, които го правят много удобен за изпълнение на биологичната роля - пренос на редуциращи еквиваленти от неподвижно вградените в мембраната ФП към също така неподвижно вградените цитохроми. Наличието и на трета семихинонова форма позволява той да осъществява преход от дву- към едноелектронен пренос. Тази форма има важно значение и за протичане на т.н. Q-цикъл, който е част от дейността на комплекс ІІІ.

Комплекс ІІІ (Коензим Q - цитохром c оксидоредуктаза)

Известен е като b-c₁-комплекс или цитохром c редуктаза. Комплекс ІІІ в бозайници е димер, като всеки мономер се състои от 11 субединици, в които влизат цитохром b₅₆₂, цитохром b₅₆₆, цитохром c₁ и един Fe-S белтък. Комплекс ІІІ пренася 2 електрона от КоQH₂ към 2 молекули цитохром с и посредством Q-цикъла (фиг. 5-18-2) изпомпва 4 протони в интрамембранното пространство съгласно следното уравнение [1]:

КоQH₂ + 2 cytochrome c₁(Fe³⁺) + 2H⁺ (от матрикса) ----->
-----> KoQ + 2 cytochrome c₁(Fe²⁺) + 4H⁺ (отвън)

QH^. е прикрепен от двете страни на мембраната към специален Q-свързващ белтък. QH₂ и Q са подвижни.

Цитохромите в комплекса се подреждат по нарастващ редокс-потенциал, както следва: b₅₆₆, b₅₆₂, c₁. Като простетична група всеки цитохром съдържа хем (желязо-порфиринов пръстен). В редуцирана форма валентността на желязото е +2, в окислена +3.



Фиг. 5-18-2.Схема за възможното действие на комплекс ІІІ като протонна помпа посредством Q-цикъла. QH^. е прикрепен от двете страни на мембраната към специален Q-свързващ белтък. QH₂ и Q са подвижни. Цитохроми b₅₆₂ и цитохром b₅₆₆ са представени в зелен цвят.

Цитохром с (фиг. 5-18-3) е нискомолекулен периферен мембранен белтък (13 kD). Съдържа една полипептидна верига с 19 лизинови и 3 аргинилови остатъка, поради което е алкален белтък с рI 10.6. Чрез положително заредените лизилови и аргинилови групи се свързва със своите биологични партньори комплекс ІІІ (цитохром с редуктаза и комплекс ІV (цитохром с оксидаза), а също и с фосфолипидите от мембраната чрез електростатични взаимодействия. Тези сравнително по-слаби връзки позволяват той да се изолира лесно от мембраната, за разлика от другите цитохроми. Приема се, че е белтъчен преносител на електрони, без ензимни функции. С ниската си молекулна маса, форма и структура той е идеално пригоден да поема електрони от цитохром с редуктазата и да ги предава на цитохром с оксидазата. Той е от най-детайлно изучените белтъци. Знае се първичната структура на цитохром с от над 120 вида - от най-низши организми до човек. Оказва се, че няколко лизинови остатъци са строго консервативни в течение на еволюцията, следователно са жизнено важни (Лиз13, Лиз 72, Лиз 86, Лиз87, а също и Лиз8, Лиз25, Лиз 27, Лиз 73, Лиз79. Именно те образуват пръстен около хема и участват във взаимодействието с кисели групи от комплекс ІІІ и комплекс ІV. Модифицирането им (блокирането им) с различни вещества намалява в различна степен електрон-пренасящата способност на цитохром с и така се съди за важността на всеки лизинов остатък.

Фиг. 5-18-3.Структура на цитохром с. Фигурата е приготвена с програмата Raswin [7], ползвайки данните за атомните координати на цитохром с cот Protein Data Bank [10]. -Спиралните участъци в полипептидната верига са представени с модел тип "панделка" в синьо, хемът с модел "топки и пръчки" в червено, а консервативните лизинови остатъци, заобикалящи хема и имащи значения за взаимодействие с кисели групи от комплекс ІІІ (b-c1) и комплекс ІV (цитохром c оксидаза) са представени с модел тип "пръчки" в жълто и са означени техните номера. Особено важни за елeктронния пренос са Лиз 13, Лиз 86, Лиз 87 и Лиз 72.

Комплекс ІV в бозайници е димер. Всеки мономер се състои от 13 субединици, като трите най-големи и най-хидрофобни субединици (І, ІІ и ІІІ) са митохондрийно кодирани. Комплекс ІV има 4 редокс-центра: меден атом, известен като Cu_B, цитохром a и цитохром a₃ (свързани към субединица І) и двойка медни атоми, известни като Cu_A-център (свързан към субединица ІІ).
Комплекс ІV редуцира О₂ до 2 H₂О като използва 4 електрона от цитохром с и 4 протона от матрикса. За всеки 2 електрона, които редуцират кислород, се изпомпват в интрамембанното пространство 2 протона.

В обобщение:

Някои от компонентите на дихателната верига пренасят по 1 електрон (Fe-S-белтъци, цитохроми, Cu-йони). Други пренасят по 2 електрона (КоQ, ФМН, ФАД).

Електроните се придвижват от редокс-центрове с по-нисък (по-отрицателен) редокс-потенциал към редокс-центрове с по-висок (по-положителен) редокс-потенциал.

Компонентите на дихателната верига са в динамично състояние. Те периодично минават от окислено в редуцирано състояние, и обратно, както личи от фиг. 5-19.

Комплекс І, комплекс ІІІ и комплекс ІV действат като протонни помпи.

Фиг. 5-19. Динамично преминаване на компонентите на дихателната верига от редуцирана в окислена форма и обратно. Показана е опростено само началната част на веригата - последователна оксидоредукция между НАДН, ФМН от комплекс І и КоQ.

5.4.4 Термодинамика на електронния транспорт в местата за протонна транслокация

При окисление на НАДН от O₂ в дихателната верига общата промяна в стандартната свободна енергия G^o' е - 218 kJ/mol съгласно ур. 5.2.4 (табл. 5-5). Тъй като за синтеза на 1 мол АТФ се изискват 30.5 kJ/mol, то теоретично отделената при окислението на НАДН енергия е достатъчна за синтеза на няколко мола АТФ. Тази енергия се отделя не наведнъж, а на порции, като в някои от етапите енергията не достига за синтеза на АТФ и се разсейва като топлина.

Ако разликата в редокспотенциала между съседни редокс-центрове е около или по-голяма от 0.19-0.20 V, то отделената енергия съгласно ур. 5.2.4 ще бъде повече от 30.5 KJ/mol, т.е. достатъчно за синтеза на 1 мол АТФ. В табл. 5-5 са дадени изчислените според ур. 5.2.4 стойности на G^o' за реакциите, катализирани от комплексите на дихателната верига.

Табл. 5-5. Стойности на отделената енергия в реакциите, катализирани от комплексите на дихателната верига.

Комплекс	Реакция	Eo' (V)	Go' (kJ/mol)
І	НАДН + Н+ + КоQ --> НАД+ + КоQH2	0.360	- 69.5
ІI	ФАДН2 + КоQ --> ФАД + КоQH2	0.085	- 16.4
ІII	КоQH2 + цит. c (Fe3) --> КоQ + цит. c (Fe2)	0.190	- 36.7
ІV	цит. c (Fe2) + 1/2 O2 --> цит. c (Fe3) + H2O	0.580	- 112
Общо четирите комплекса	НАДН + Н+ + 1/2 O2 --> НАД+ + H2O	1.130	- 218

Вижда се, че в комплекси І, ІІІ и ІV отделената енергия е достатъчно за синтеза на АТФ. Затова дълго време се смяташе, че именно в тези три места (първо, второ и трето) става спрягане на окислението с фосфорилиране на АДФ до АТФ. Наричаха се и все още в някои учебници се наричат енергетично спрягащи или фосфорилиращи места. След възприемане на химиосмотичната теория (т. 5.4.9) те се означават като места за протонна транслокация.

Трябва да се подчертае, че комплекс І (първо място), комплекс ІІІ (второ място) и комплекс ІV (трето място) не синтезират директно АТФ, както първоначално бе смятано. Както бе показано в т. 5.4.3 те действат като протонни помпи - пренасят електрони към кислорода и изпомпват протони от матрикса в интрамембранното пространство, при което възниква трансмембранен протонен градиент. Неговата енергия се използва за синтеза на АТФ от АТФ синтазата.

5.4.5 Коефициент на окислителното фосфорилиране

Коефициентът на окислителното фосфорилиране ( Р/О) е отношение, което показва колко мола АТФ се синтезират от АДФ и Ф при транспорт на два електрона към един атом кислород до получаване на вода в дихателната верига.

Измерването на този коефициент в изолирани митохондрии при различни експериментални условия е било полезно както за установяване подреждането на компонентите на дихателната верига, така и за осветляване механизма на окислителното фосфорилиране.
Той има различна стойност в зависимост от субстрата, доставящ водород за дихателната верига (вж табл. 5-6).

Табл. 5-6. Стойности на коефициента на окислително фосфорилиране Р/О при окисление на различни субстрати.

*ТМФД - тетраметил-р-фенилен диамин - липидно разтворимо вещество, което заедно с аскорбат подава електрони на комплекс ІV.

** по P. Hinkle [6].

Преносът на 2 електрона през комплекси І, ІІІ и ІV е свързано с изнасяне на 10 протони от матрикса в интрамембранното пространство. Отделената при това енергия е достатъчна за синтеза на три мола АТФ (Р/О = 3). Субстратите с по-висок редокс-потенциал подават водород в по-късен етап и някои от местата за протонна транслокация не работят. Напр. електроните от ФАДН₂ не минават през комплекс І и поради това се изнасят само 6 протони, което е достатъчно за синтеза на 2 мола АТФ (Р/О = 2). Преносът на 2 електрона само през комплекс ІV е свързано с изнасяне на 2 протона и това е достатъчно за синтеза на 1 мол АТФ (Р/О = 1).

Експерименталните стойности за Р/О не са били цели числа, но дълго време бяха закръглени на цели числа, т.е. ползваха се теоретичните стойности, дадени в табл. 5-6. Трябва да се има предвид, че част от протонния градиент се използва и за други ендергонични процеси, а също, че макар и в слаба степен може да има неспецифично снижаване на протонния градиент. През 1991 г. P. Hinkle преразгледа стойностите за P/O и показа, че вместо 3, 2 и 1, те трябва да се корегират на 2.5, 1.5 и 1. Тези ревизирани стойности са в съгласие с химиоосмотичната теория за механизма на окислителното фосфорилиране, разгледана в т. 5.4.9.

5.4.6 Инхибитори на електронния транспорт

За определяне точното подреждане на компонентите на дихателната верига допринесоха и опитите с инхибитори на електронния транспорт. Тези опити осветлиха и механизма на действие на някои отрови.

Инхибиторите на електронния транспорт са вещества, които спират преноса на електрони в енергетично спрягащите места на дихателната верига (вж фиг. 5-20) и вторично спират и фосфорилирането.

Специфични за първо място са напр. ротенон, барбитурати и др.; за второ място - напр. антимицин А; за трето място - СО, КСN и др. Инхибиторите разделят дихателната верига на окислен и редуциран сегмент. В мястото на блока два съседни дихателни преносители са в противоположно редокс-състояние: преди блока преносителят е в максимално редуцирано състояние, а след блока - в максимално окислено състояние.

Фиг. 5-21. Електронен транспорт в изолирани митохондрии при добавяне на различни субстрати и инхибитори, проследен чрез измерване на кислородната консумация.