Ензими Цели Цели на преподавателя
Изтегляне 0.68 Mb.
|
- Навигация на страницата:
- Фиг. 4-13.
- II. Нека ензимната концентрация [E] да е постоянна 1) При много ниски субстратни концентрации ([S] m )
- 2) При високи субстратни концентрации ([S] >> K m )
- 1) Чрез директни спектрометрични или флуорометрични методи
- 2) Индиректни методи
- Ензим Субстрат рН
|
Някои ензими, напр. карбоксилестеразите, са с по-слабо-изразена специфичност - изискват наличието само на определена химична връзка (естерна), без да имат строга избирателност към съставките, които изграждат тази връзка (различни киселини и алкохоли). Биологичното значение на субстратната специфичност е огромно. Без това удивително свойство на ензимите, не е възможен какъвто и да е порядък в обмяната в клетката. Благодарение на ензимната специфичност биохимията е постигнала големи успехи при изследване естеството на връзката ензим-субстрат, а оттам и за изучаване структурата на активния център на ензима. За тези изследвания се използват серия модифицирани субстрати, така че всяка от групите, участваща в реакцията, да бъде модифицирана в един от тези субстрати. Изследва се влиянието на модификацията върху процеса на свързването на субстрата и на способността на ензима да атакува субстрата. Благодарение на субстратната специфичност може да се смесва чист субстрат с груб ензимен препарат, в който количеството на примесите надвишава 1000 пъти количеството на самия ензим, и в тези условия да се определя активността на ензима с достатъчна точност. 4.2 Ензимна кинетика 4.2.1 Резюме Ензимната кинетика изучава промените в скоростта на ензимните реакции под влияние на различни фактори. Експерименталната крива, описваща зависимостта на скоростта от концентрацията на субстрата, е правоъгълна хипербола. Тя отразява една от
Ензимната кинетика е подробно анализирана от Михаелис и Ментен. В основата на анализа си изследователите поставят образуването на междинен ензим-субстратен комплекс. Анализирайки математически зависимостта на скоростта (V) на образуване и разграждане на ензим-субстратния комплекс от концентрацията на субстрата [S], изследователите извеждат теоретично уравнение, отразяващо експериментално установената правоъгълна хипербола. В тяхна чест това уравнение се нарича уравнение на Михаелис-Ментен. Константата на Михаелис (Кm) числено е равна на тази концентрация на субстрата, при която скоростта е равна на половината от максималната. Кm е важна кинетична характеристика за всяка ензимна реакция, защото дава информация за сродството между ензима и субстрата. Колкото Кm е по-ниска, толкова сродството е по-високо. Експерименталното определяне на (Кm) и на Vmax от хиперболичната зависимост на V от [S] е неточно и създава затруднения. По тази причина за определянето им се използват различни трансформации на уравнението на Михаелис-Ментен, най-популярната от които е уравнението на двойните реципрочни стойности или уравнение на Lineweaver-Burk. Това e уравнение на права линия, с две променливи 1 / V и 1 / [S]. От пресечните точки на получената права и осите на координатната сис тема се определят двете кинетични характеристики - (Кm) и на Vmax. Определянето на ензимната активност се осъществява с помощта на директни и индиректни методи. Активността на ензимите се изразява с помощта на единицата катал. Един катал е количеството активност, която превръща 1 мол субстрат за една сек. Зависимостта на скоростта на ензимните реакции от рН е крива с максимум. Този ход се определя от промени в дисоциацията на функционални групи в активния център и извън него, както и на групи в субстратната молекула. Това рН, при което скоростта на ензимната реакция е максимална, се определя като рН оптимум. Зависимостта на V от температурата също е крива с максимум.. Понижаването на активността след достигане на температурния оптимум отразява биологичните свойства на катализатора и е свързано с промяна в структурата на активния център в резултат на топлинна денатурация на белтъчната молекула. Познанията върху ензимната кинетика са необходими за разбиране на някои случаи на хетерогенното заболяване подагра, характеризиращо се с увеличено образуване на пикочна киселина. Последната има много ниска разтворимост и при увеличено образуване, се отлага в стави и др. тъкани, което е изключително болезнено. Аномално високата активност на ензима фосфорибозилпирофосфат синтетаза в едни пациенти се дължи на увеличена Vmax, а в други на снижена Кm (увеличено сродство към субстрата). Промени в рН оптимума на алкохол дехидрогеназата и повишена Кm на ацеталдехид дехидрогеназата при азиатци е причина за повишената им чувствителност към етанол. 4.2.2 Зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата Ензимната кинетика изучава зависимостта на ензимно-катализираните реакции от различни фактори.
Michaelis и Menten са дали математически израз на описаната експериментално установена зависимост. Макар че и други учени са работили по този въпрос, изведеното уравнение и до днес се нарича уравнение на Михаелис-Ментен в тяхна чест. Michaelis и Menten са разгледали случая на едносубстратна еднопосочна реакция, протичаща в два етапа със скоростни константи k+1, k-1 и k+2 : 
Извеждането на уравнението на Michaelis-Menten се основава на допусканията, че: 1) k+2 << k-1 , k+2<< k+1
V = k+2 [ES] (4.2.2) Концентрацията на ЕS остава постоянна (стационарна), тъй като Vобразуване на ES = Vразграждане на ES (4.2.3)
или съгласно закона за действие на масите: k+1([E] - [ES]) [S] = k-1 [ES] + k+2 [ES] (4.2.4)
където ([E] - [ES]) е концентрацията на свободния ензим (разлика мeжду началната концентрация и тази на ензима, ангажиран в ES). Чрез прости аритметични преобразувания се получава стойността на [ES]: 
В хода на преобразуванията отношението от скоростните константи се представя като една нова сборна константа, означавана като константа на Michаelis (Km): 
Значението на Кm ще бъде разгледано в т.4.2.4. Ако получената стойност за [ES] в (4.2.5) се замести в (4.2.2), получава се първата форма на уравнението на Michaelis-Menten (4.2.7): 
При насищане, когато [S] >> [E], цялото количество ензим е включено в ЕS (няма свободен ензим), т.е. [ЕS] = [E]. Тогава скоростта е максимална и се представя, както следва: Vmax = k+2 [E] (4.2.8) Използвайки равенството (4.2.8), от (4.2.7) може да се получи и втора форма на уравнението на Michaelis-Menten (4.2.9):
В него има три променливи: V, [S] и [E] (фиг. 4-13). Ще разгледаме следните случаи:
I. Нека субстратната концентрация [S] да е постоянна Тъй като k+2 и Km също са константи, то V = const. [Е] (4.2.10) т.е. скоростта зависи правопропорционално от ензимната концентрация - графически зависимостта е права линия. Този частен случай на уравнението на Michaelis-Menten описва зависимостта на скоростта на реакцията от концентрацията на ензима. II. Нека ензимната концентрация [E] да е постоянна 1) При много ниски субстратни концентрации ([S] << Km) , в знаменателя може да се пренебрегне [S] и V = const . [S] (4.2.11) т.е. скоростта при ниски субстратни концентрации зависи линейно от концентрацията на субстрата. Този частен случай описва началния линеен участък от хиперболата. 2) При високи субстратни концентрации ([S] >> Km), в знаменателя може да се пренебрегне Km и V = Vmax [S] / [S] = Vmax = const (4.2.12) т.е. скоростта при високи субстратни концентрации клони към максималната стойност и не зависи от концентрацията на субстрата. Този частен случай описва крайния участък от хиперболата в областта на платото. 4.2.4 Дефиниция и значение на Кm и Vmax Ако се положи V да бъде равна на 1/2 от Vmax и се замести в уравнениетона Michaelis-Menten (фиг. 4-14) , то константата на Michaelis е равна на тази субстратна концентрация, при която скоростта на реакцията е равна на половината от максималната скорост. Km има измерение на концентрация и нейните стойности са между 1 и 10-8 мол/л.
Km е важна кинетична характеристика за всеки ензим, защото дава ценна информация за сродството между ензима и субстрата, макар и с известно приближение. Това е така, защото реалната експериментално определяна Km е близка по стойност до теоретичната дисоциационна константа Кs за разграждането на ензим-субстратния комплекс до ензим и субстрат в основното уравнение .
Кm се отличава от Кs само по това, че k+2 присъствува в числителя за Кm. По условие k+2 << k+1 и k-1 . Затова Кm е близка по стойност до Кs. Ниска Кs , т.е. нисък числител (малки концентрации на свободния ензим и субстрат) и висок знаменател (висока концентрация на ES) означава високо сродство между ензима и субстрата. Така че, колкото Кs е по-ниска, толкова сродството между ензима и субстрата е по-високо. Обратно, висока Кs означава ниско сродство. Кs е теоретична константа, която не може да се измери експериментално, защото процесът в действителност не спира до образуване на ES, а продължава до образуване на продукт. Кm е реалната величина, която лесно се определя експeриментално и която с близко приближение дава информация за сродството между ензима и субстрата. Колкото Кm е по-ниска, толкова сродството между ензима и субстрата е по-високо. Обратно, висока Кm означава ниско сродство. Кинетичните характеристики Km и Vmax са специфични за всеки ензим. Те имат и практическо значение. При [S], надвишаваща 100 пъти Km, обикновено V = Vmax. Това условие би трябвало да се спазва при определяне на ензимната активност. Vmax отразява количеството на наличния ензим. Km показва колко субстрат трябва да се използва, за да се измери Vmax. Информация за клинично приложение на кинетичните параметри има в т. 4.2.10.1. 4.2.5 Определяне на Km и Vmax чрез уравнението на Lineweaver-Burk Експерименталното определяне на Кm от хиперболата е възможно. Но поради неточно определяне на Vmax в областта на платото и необходимостта от голям брой точки, обикновено уравнението на Michaelis-Menten се трансформира в уравнение на двойните реципрочни стойности или уравнение на Lineweaver-Burk (4.2.10), както е дадено на фиг. 4-16. Това е уравнение на права линия от вида (у = ах + b), неминаваща през началото на координатната система, с две променливи 1/V и 1/[S]. От пресечните точки на правата с осите се определят лесно и двете кинетични характеристики Km и Vmax.
4.2.6 Единици ензимна активност Не всички ензими са максимално пречистени, не се знае молекулната им маса. Затова количеството на ензима не се изразява в тегловни единици. Еднакво тегло в мг от два различно пречистени препарата съдържат различно количество чист ензим.
4.2.7 Определяне на ензимна активност чрез директни и индиректни методи 1) Чрез директни спектрометрични или флуорометрични методи При ензими, чиято небелтъчна съставка има характерни абсорбционни или флуоресцентни спектри във видимата или ултравиолетовата област, е възможно директно измерване на ензимната активност. Напр. при дехидрогенази с коензими НАД или НАДФ се използва свойството, че в редуцирано състояние пиридиновите коензими имат максимум на поглъщане на светлината при 340 нм. Реакцията може да се следи при 340 нм или по увеличението на оптичната плътност за минута при редукцията или по нейното намаление при окислението на коензима. В дехидрогеназни реакции скоростта на образуване или изчезване на НАДН е директно пропорционална на ензимната концентрация, изразена в относителни единици. Така оптичната плътност при 340 нм се използва за количествен анализ на тези ензими. Освен дехидрогенази, много други ензими могат да бъдат определяни чрез измерване скоростта на появата на цветен продукт или скоростта на изчезване на цветен субстрат. В практиката се използват и флуоресцентни методи - когато небелтъчната съставка е флуоресциращо вещество. Напр. кофакторът пиридоксалфосфат има характерен спектър на флуоресценция и това прави неговото измерване лесно и удобно. Важно предимство на флуорометричните измервания е много по-високата им чувствителност спрямо спектрофотометричните, тъй като е нужно много по-малко количество вещество.
Те се прилагат при ензими, които не съдържат кофактори с характерни спектри на поглъщане или флуоресценция, но катализиращи реакции, спрегнати с дехидрогеназните - виж фиг. 4-17. Показано е определяне на хексокиназна активност, спрегната с глюкозо-6-Ф дехидрогеназна активност. Всички компоненти, освен хексокиназа, се добавят в излишък. Това са глюкозо-6-Ф дехидрогеназа, глюкоза, АТФ, Мg2+ и НАДФ+. Количеството на измерваната в пробата хексокиназа определя скоростта на цялостната реакция и следователно и скоростта на образуване на НАДФН, която се измерва при 340 нм. 
Фиг. 4-17. Индиректен метод за определяне на ензимна активност, в случая хексокиназа, чрез спрягане на реакцията с дехидрогеназна реакция. 4.2.8 Влияние на рН върху скоростта на ензимните реакции Зависимостта на скоростта от рН е крива с максимум (фиг. 4-18). Този ход се определя от няколко ефекта на рН върху ензима и субстрата: 1) При екстремно ниски или високи рН настъпва денатурация на ензима; 2) Променят се зарядите на групи от субстратната молекула; 3) Променят се зарядите на групи от активния център на ензима или на важни конформационни групи извън него.
Това рН, при което скоростта е максимална , се означава като рН оптимум. За повечето ензими рН оптимумът е около неутрални стойности на рН, но има и значителни отклонения - вж табл. 4-4. Наличието на различни йонизиращи групи в различните субстрати е причина за разлики в рН оптимума на един ензим. Табл. 4-4. рН оптимуми на някои ензими*
*С разрешение от Т. Николов [2] 4.2.9 Влияние на температурата върху скоростта на ензимните реакции Зависимостта на скоростта на ензимната реакция от температурата е камбановидна крива с максимум (фиг. 4-19). Температурата, при която скоростта е максимална, се означава като температурен оптимум (Топт). Камбановидната крива е резултантна от две въздействия. Първоначално с увеличение на температурата скоростта нараства поради увеличаване кинетичната енергия на реагиращите молекули. След достигане на температурния оптимум, главно поради топлинна денатурация на ензима, скоростта започва да намалява. Температурният оптимум зависи от продължителността на топлинното въздействие. Ако ензимът действа по-продължително при по-висока температура, топлинната денатурация е по-изразена и температурният максимум се снижава.
Каталог: docs -> biohimia biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания biohimia -> Белтъци Цели Цели на преподавателя biohimia -> Захарен диабет Цели Цели на преподавателя biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания biohimia -> Биоенергетика Цели Цели на преподавателя biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания Изтегляне 0.68 Mb. Сподели с приятели:
|
