Ензими Цели Цели на преподавателя

4.4.4 Изоензими

4.4.4.1 Определение

Изоензимите (изозими) са различни форми на един и същи ензим. Те имат еднаква субстратна и кофакторна специфичност, но различни К_m за субстрата или кофактора, или и за двата заедно.

В рамките на един организъм има изоензими от различни органи - напр. лактат дехидрогеназа (ЛДХ), или от различни клетъчни органели - напр. малат дехидрогеназа (МДХ), глутамат-оксалацетат трансаминаза (ГОТ).

Изоензимите са мултимерни комплекси. Те имат четвъртична структура и са образувани от свързването на различен брой независимо кодирани субединици. Поради разлики в първичната структура, субединиците имат различни изоелектрични точки и оттук комбинациите от тях имат различна електрофоретична подвижност. Субединиците се номерират, като № 1 получава най-бързо движещият се към анода изоензим.

Разделянето и идентифицирането на изоензимите има диагностично значение.

4.4.4.2 Изоензими на креатинфосфокиназата (КФК)

Този ензим катализира обратимото фосфорилиране на креатин с АТФ (фиг. 4-36):

Фиг. 4-36. Действие и изоензими на креатинфосфокиназа.

4.4.4.3 Изоензими на лактатдехидрогеназата (ЛДХ)

Този ензим катализира обратимата редукция на пируват до лактат. (фиг. 37). Тъй като ЛДХ е тетрамер от два вида субединици Н (от heart) и М (от muscle), възможни са 5 комбинации от тях или 5 вида изоензими, съдържащи различен брой от Н и М субединици.

Сумарната активност на ЛДХ в серума на здрав човек обикновено е 100-200 IU/L. ЛДХ се намира във всички тъкани. Увеличението на общата активност на ЛДХ в серума не е специфично за увреждането на някой орган. Увреждане на кой да е от тях може да доведе до освобождаване на ензима в кръвта.

Фиг. 4-37. Действие и изоензими на лактат дехидрогеназа.

Пациент с инфаркт на миокарда е сравнен със здрав човек. Увеличени са изоензими 1 и 2.

На фиг. 4-38-I се вижда, че при инфаркт на миокарда са характерни две особености: а) увеличават се изоензими 1 и 2; б) изоензим 1 има по-високи стойности спрямо изоензим 2.
Промяната в изоензими 1 и 2 едновременно с поява на КФК₂ в 100 % от случаите е показател за инфаркт на миокарда.

На фиг. 4-38-II е даден електрофоретичният профил на изоензими на ЛДХ от пациент с хепатит и от здрав човек. За разлика от инфаркт, където са увеличени изозими 1 и 2, при хепатит е увеличен изоензим 5.

4.4.5 Промени във функционалните плазмени ензими - значение за диагностиката

Към функционалните плазмени ензими спадат преензимите за кръвосъсирване, преензимите за разтваряне на съсиреците, липопротеин липаза и др.
Физиологичната им функция се реализира в плазмата, където се секретират главно от черния дроб. Присъствуват в кръвта в равни или по-високи концентрации, отколкото в тъканите.
Диагностично значение има намаляване на активността им, което е признак за нарушение във функцията на органа, където се синтезират.
Напр. лецитин-холестерол ацилтрансфераза (превръща лецитина в лизолецитин, а свободния холестерол в холестеролов естер) - при заболявания на чернодробния паренхим нейната активност намалява, в кръвта нараства концентрацията на свободния неестерифициран холестерол ( в норма свободният е 1/3 от общия).
Плазмената холинестераза разгражда ацетилхолин. Синтезира се в черния дроб. Нейната намалена активност говори за увреждането му. Може да е признак за отравяне с фосфороорганични отрови - инсектициди, или хлороформ.
При сериозни увреждания на черния дроб като цироза не се произвеждат ензимите, необходими за обезвреждане на токсичния амоняк в урейния цикъл. Това може да доведе до амонячно отравяне и до чернодробна кома.

4.4.6 Доказване на генетично обусловени ензимопатии

Фиг. 4-39. Метаболитен блок при генетично обусловени ензимопатии.

Освен разгледания път de novo синтеза на пуринови нуклеотиди има и друг път, наречен синтеза от готови бази. Една от реакциите в този път (синтеза на ГМФ и ИМФ) е представена на фиг. 4-40. Тази реакция е пример за неизползване на субстрат, който повлиява друг обменен път. При намалена активност на ензима гуанозил/хипоксантин фосфорибозил трансфераза не се използва ФРФФ. Той се натрупва и стимулира пътя de novo. Синтезират се повече пурини и от тях повече пикочна киселина.

Фиг. 4-40. Механизъм на възникване на подагра при недостатъчност на гуанозин/хипоксантин-фосфорибозилтрансферазата Ензимният блок води до неизползване и натрупване на ФРФФ, който усилва пътя de novo.

4.4.7 Значение на рестриктази за директно изследване секвенцията на ДНК и установяване дефекти в гените

Рестриктазите са строго специфични ендонуклеази, които разкъсват полинуклеотидните вериги на ДНК в определени места. Те са изключително полезни за целенасочено срязване и картиране на генома, (както и за вмъкване на гени от един организъм в друг - генно инженерство).

Рестриктазите улесняват диагнозата на генетичните болести. Диагностицирането на тези болести чрез директни изследвания на секвенции от ДНК стана възможно благодарение на успехите на рекомбинантната ДНК технология (глава 16).

Чувствителността на тези методи е толкова голяма, че е възможна пренатална диагностика на наследствени заболявания. За целта се изследват клетки от амниотичната течност.

4.4.8 Ензими за терапия при инфаркт на миокарда и други заболявания

Съсирекът, предизвикал инфаркта, може да се разтвори под действие на активен плазмин. Активен плазмин се получава от неактивен плазминоген под действие на стрептокиназа и на алтеплаза (t-PA - съкратено от tissue plasminogen activator или тъканен активатор на плазминоген) - виж фиг. 4-41. Както стрептокиназата, така и алтеплазата се използват при лечение на инфаркт като тромболитични агенти. Техните качества са сравнени в табл. 4-10.

Фиг. 4-41. Значение на ензимите алтеплаза и стрептокиназа за терапия при инфаркт на миокарда.

*Данните са от Webb. J., Thompson C. [12]. Валутата е в канадски долари.

Колкото по-рано започне терапията, толкова по-голяма надежда има за болния. Вкарването на стрептокиназа или алтеплаза трябва да стане бързо, преди да е настъпило необратимо увреждане на сърдечния мускул и обикновено не по-късно след 12-ия час. Обикновено дори 1 час след инфаркта някои клетки са необратимо увредени, а 6 часа по-късно миокардът като цяло се счита увреден, ако не е предприето нищо.

Получената чрез рекомбинантна ДНК-технология алтеплаза е не по-малко активна от стрептокиназата, не причинява алергични реакции, не предизвиква хипотензия, но е много по-скъпа. Затова в много кардиологични центрове се използва стрептокиназа, освен ако няма контраиндикации за алергия, предишна употреба, или хипотензия.

При някои форми на левкемия при възрастни се прилага терапия с ензима аспарагиназа. Този ензим разгражда аспарагин. Туморните клетки се нуждаят от аспарагин и го получават от плазмата на гостоприемника. Вкарването на аспарагиназа венозно намалява нивото на аспарагин в плазмата и това потиска жизнеспособността на тумора.

В бъдеще може би ще е възможно заместване на дефектни ензими.

4.4.9 Роля на имобилизирани ензими в клиничния анализ и за производство на лекарства

Имобилизирани ензими се наричат ензимите, свързани към неразтворима матрица (мембрана). Те са значително по-стабилни спрямо денатуриращи фактори (рН, температура, детергенти) и работят с повишен капацитет продължително време. Използват се успешно в рутинни и скриниращи изследвания.

Например определяне на холестерол при скрининг на населението може да стане за няколко минути с минимално количество плазма 10 L (виж фиг. 4-42) с помощта на имобилизирана холестерол оксидаза, действаща спрегнато с пероксидаза. При окислението на холестерола под действие на този ензим, се отделя Н₂О₂, който окислява безцветно багрило до цветен продукт. Последният се измерва спектрофотометрично. По подобен начин се определят и триглицериди с участието на имобилизирана липаза.

Фиг. 4-42. Пример за приложение на имобилизирана холестерол оксидаза и пероксидаза при определяне съдържанието на холестерол.

4.4.10 Роля на комплекси "ензим-антитяло" в клиничния анализ - пример за определяне белтъците на вируса на СПИН чрез метода ELISA

Съкращението ELISA идва от английското название на метода: Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay.

Свързването на индикаторен ензим (напр. пероксидаза) със специфично антитяло срещу белтъчен антиген, напр. от вируса на СПИН (HIV) позволява провеждане на изключително специфично и чувствително определяне на белтъците на този вирус. Пероксидазата се използва да катализира получаването на цветен продукт, който се спектрофотометрира и който е пропорционален на количеството на антигена в пробата.

При описание принципа на метода ELISA се използват означенията, дадени на фиг. 4-43-1:

Фиг. 4-43-1. Означения, използвани при определяне белтъка от обвивката на вируса на СПИН чрез метода ELISA.

Тестът за вируса на СПИН се извършва в полистиренови плаки с малки вдлъбнати цилиндърчета по начина, описан на фиг. 4-43-2.

Фиг. 4-43-2. Определяне на белтъка от обвивката на вируса на СПИН чрез метода ELISA.

Последователно се извършват следните операции:

4.5 Насоки за самостоятелна работа

1. Рапопорт С. М. (1966) Медицинская биохимия, Изд. "Медицина", Москва, стр. 144 (перевод с немецкого).

2. Николов,Т. (1995) Ензими, в: Ангелов, А., Е. Гачев, К. Данчева, А. Кръшкова, Т. Николов, Л. Сираков, Биохимия за медици и стоматолози, 1995, Университетско издателство "Св. Климент Охридски", София, стр. 81-127.

3. Enzyme nomenclature (1992) Recommendations of IUBMB committee, San Diego, New York, london, Sidney, Tokyo, Toronto, Academic Press или Systematic names and EC nomenclature numbers: http://www. expasy.org/enzyme

4. Sayle, R. http://www.metaphorics.com

5. Birktoft, J. J., Blow, D. M. J. Mol. Biol. 68, 1972, 187. The structure of crystalline alpha-chymotrypsin.

6. Bernstein, F. C., Koetzle, T. F., Williams, G. J. B., Meyer, E. F. Jr., Brice, M. D., Rodgers, J. R., Kennard, O., Shimanouchi, T. & Tasumi, M (1977). J. Biol. Chem. 112, 535, Protein Data Bank. A computer-based archival file for the macromolecular structures

7.Страйер, Л. Биохимия, Пер. с англ. Мир, 1985, т. 2, стр. 275.

8. Becker, M. A., Kostel, P. J. Meyer, L. J. and Seegmiller, J. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1973, 2749. Human phosphoribosylpyrophosphate synthetase: increased enzyme specific activity in a family with gout and excessive purine synthesis

9. Burnell, J. C., Carr, L. G., Dwulet, F. E., Edenberg, H. J., Li, T. -K and Bosron, W. F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 146, 1987, 1227. The human b3 alcohol dehydrogenase subunit differs from b1 by a cys- arg-369 substitution which decreased NAD(H) binding.

10. Crabb, D. W. Edenberg, H. J., Bosron, W. F. and Li, T. -K.J. Clin. Invest. 83, 1989, 314. Genotypes for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol sensitivity.

11. Sperling, O., Persky-Brosh, S., Boen, P. and DeVries, A. Biochem. Med. 7, 1973, 389. A human erythrocyte phosphoribosylpyrophosphate synthetase mutationally altered in regulatory properties.