Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти

4.2.1.5. 3-меркаптопропан-1,2-диол (1-тиоглицерол), 98 % минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.6. Готови плаки за тънкослойна хроматография със силикагел, дебелина на слоя 0,25 mm.

4.2.1.7. Готови плаки за тънкослойна хроматография с алуминиев оксид, Merck F254 или еквивалентни.

4.2.1.8. Солна киселина, концентрирана, d420 = 1,19 g/сm3 (ml).

4.2.1.9. Етилацетат.

4.2.1.10. Хлороформ.

4.2.1.11. Диизопропилов етер.

4.2.1.12. Тетрахлорметан.

4.2.1.13. Ледена оцетна киселина.

4.2.1.14. Калиев йодид, 1 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.15. Платинов тетрахлорид, 0,1 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.16. Подвижни фази

4.2.1.16.1. Етилацетат (4.2.1.9) : хлороформ (4.2.1.10) : диизопропилов етер (4.2.1.11) : оцетна киселина (4.2.1.13) = 20 : 20 : 10 : 10 (V/V/V/V).

4.2.1.16.2. Хлороформ (4.2.1.10) : оцетна киселина (4.2.1.13) = 90 : 20 (V/V).

4.2.1.17. Реактиви за проявяване на петната

4.2.1.17.1. Непосредствено преди употреба се смесват равни обеми от разтвор (4.2.1.14) и разтвор (4.2.1.15).

4.2.1.17.2. Разтвор на бром, 5 % (M/V): 5 g бром се разтварят в 100 сm3 (ml) тетрахлорметан (4.2.1.12).

4.2.1.17.3. Разтвор на флуоресцеин, 0,1 % (M/V): 100 mg флуоресцеин се разтварят в 100 сm3 (ml) етанол.

4.2.1.17.4. Хексаамониев хептамолибдат, 10 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18. Стандартни разтвори

4.2.1.18.1. Меркаптооцетна киселина (4.2.1.1), 0,4 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.2. 2,2/-дитиоди (оцетна киселина) (4.2.1.2), 0,4 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.3. 2-меркаптопропионова киселина (4.2.1.3), 0,4 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.4. 3-меркаптопропионова киселина (4.2.1.4), 0,4 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.5. 3-меркаптопропан-1,2-диол (4.2.1.5), 0,4 % (M/V) разтвор във вода.

4.2.2. Апаратура

Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

4.2.3. Процедура

4.2.3.1. Подготовка на пробите

Пробата се подкислява с няколко капки солна киселина (4.2.1.8) до рH 1 и ако е необходимо, се филтрува.

В някои случаи може да се препоръча разреждане на пробата. Ако се процедира по този начин, подкисляването със солна киселина се извършва преди разреждането.

4.2.3.2. Хроматографиране

Върху плаката се нанася 1 ml от разтвора на пробата (4.2.3.1) и по 1 ml от всеки от сравнителните разтвори (4.2.1.18). Внимателно се изсушава на слаб ток от азот и хроматограмата се развива в подвижната фаза (4.2.1.16.1 или 4.2.1.16.2). Плаката се изсушава възможно най-бързо, за да се избегне окислението на тиолите.

4.2.3.3. Проявяване на петната

Плаката се напръсква с един от трите реактива (4.2.1.17.1, 4.2.1.17.3 или 4.2.1.17.4). Ако плаката се напръска с реактив 4.2.1.17.3, след това се обработва с бромни пари (например във вана, съдържаща малка чаша с реактив 4.2.1.17.2), докато петната станат видими. Оцветяването с реактива за напръскване (4.2.1.17.4) ще бъде задоволително само ако времето за изсушаване на слоя не надхвърля 30 min.

4.2.3.4. Интерпретация

Сравняват се Rf-стойностите и цвета на петната на стандартните разтвори и тези на пробата. Средните Rf-стойности, дадени по-долу, са за груба ориентация и имат само сравнителна стойност. Те зависят от:

- степента на активност на тънкия слой по време на хроматографирането,

- температурата на хроматографската вана.

Примерни Rf-стойности, получени
на слой силикагел
	Подвижни фази
	4.2.1.16.1	4.2.1.16.2
Меркаптооцетна киселина	0,25	0,80
2-меркаптопропионова киселина	0,40	0,95
2,2'-дитиоди (оцетна) киселина	0,00	0,35
3-меркаптопропионова киселина	0,45	0,95
3-меркаптопропан-1,2-диол	0,45	0,35

5. Определяне

Определянето винаги трябва да започва с йодометричния метод.

Забележка. Определянето на меркаптооцетна киселина трябва да бъде проведено на неизползван продукт от прясно отворени опаковки, за да се предотврати окислението.

5.1. Йодометрично определяне

5.1.1. Принцип

Определянето се осъществява чрез окисление на "-SH" групата с йод в кисела среда съгласно уравнението:

Йод, 0,05 М стандартен разтвор.

5.1.3. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

5.1.4. Процедура

Претегля се 0,5 до 1 g от пробата с точност 0,001 g в конична колба от 150 сm3 (ml) със запушалка, съдържаща 50 сm3 (ml) дестилирана вода. Прибавят се 5 сm3 (ml) солна киселина (4.1.1.2) (рН на разтвора - около 0) и се титрува с разтвор на йод (5.1.2) до поява на жълто оцветяване. Ако е необходимо, се използва индикатор (например разтвор на скорбяла или тетрахлорметан).

5.1.5. Изчисления

Съдържанието на меркаптооцетната киселина се изчислява по формулата:

М е масата на пробата за анализ в g;

n е използваният обем от разтвор на йод в сm3 (ml).

5.1.6. Забележки:

Ако резултатът, изчислен като меркаптооцетна киселина, е 0,1 % или повече под разрешената максимална концентрация, тогава не е необходимо да се провеждат по-нататъшни определяния.

Ако резултатът е равен или е над разрешения максимум на концентрацията и идентификацията е показала присъствие на няколко редуциращи агента, тогава е необходимо да се проведе газ хроматографско определяне.

5.2. Газова хроматография

5.2.1. Принцип

Меркаптооцетната киселина се отделя от другите съставки на продукта чрез утаяване с разтвор на кадмиев диацетат. След метилиране с диазометан, приготвен in situ или предварително в разтвор на диетилов етер, метиловото производно на меркаптооцетната киселина се определя чрез газотечна хроматография при използване на метилоктаноат като вътрешен стандарт.

5.2.2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография", а водата бидестилирана.

5.2.2.1. Меркаптооцетна киселина, 98 %.

5.2.2.2. Солна киселина, d420 = 1,19 g/сm3 (ml).

5.2.2.3. Метанол.

5.2.2.4. Кадмиев диацетат дихидрат, 10 % (M/V).

5.2.2.5. Метилоктаноат, 2 % (M/V) разтвор в метанол.

5.2.2.6. Ацетатен буферен разтвор (рН 5):

Натриев ацетат трихидрат, 77 g.

Ледена оцетна киселина, 27,5 g.

Деминерализирана вода за получаване на краен обем от 1 l.

5.2.2.7. Солна киселина, 3 М разтвор в метанол (5.2.2.3), приготвен непосредствено преди употреба.

5.2.2.8. 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин.

5.2.2.9. Натриев хидроксид, 5 М разтвор.

5.2.2.10. Йод, 0,05 М стандартен разтвор.

5.2.2.11. Диетилов етер.

5.2.2.12. Разтвор на диазометан, приготвен от н-метил-н-нитрозотолуен-4-сулфонамид (Fieser, Reagents for Organic Synthesis (Wiley), 1967).

Полученият разтвор съдържа около 1,5 g диазометан в 100 сm3 (ml) диетилов етер. Тъй като диазометанът е токсичен и твърде нестабилен газ, всички експерименти трябва да се провеждат в мощна камина и да се избягва използването на стъклария на шлиф (има специални комплекти за тази цел).

5.2.3. Апаратура

5.2.3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2.3.2. Апарат за получаване на диазометан за метилиране in situ (виж Fales, H.M., Jaouni,T.M. and Babashak, J.F., Analyt.Chem. 1973, 45, 2302).

5.2.3.3. Апаратура за предварително получаване на диазометан (Fieser).

5.2.4. Приготвяне на пробата

В центрофужна епруветка от 50 сm3 (ml) се претегля достатъчно количество от пробата с точност 0,001 g, което да съдържа предполагаемо количество от 0,05 до 0,07 g меркаптооцетна киселина.

Подкислява се с няколко капки солна киселина (5.2.2.2), за да се получи рН около 3.

Прибавят се 5 сm3 (ml) деминерализирана вода и 10 сm3 (ml) ацетатен буферен разтвор (5.2.2.6).

Проверява се дали рН е около 5 с хартиен pH-индикатор. След това се прибавят 5 сm3 (ml) разтвор на кадмиев диацетат (5.2.2.4).

Изчакват се 10 min и след това се центрофугира поне 15 min при 4000 rpm. Отстранява се бистрата течност, която може да съдържа неразтворими мазнини (в случай на кремообразни продукти). Тези мазнини не трябва да се бъркат с тиолите, които се събират като компактна маса на дъното на епруветката. Проверява се да няма утаяване при прибавяне на няколко капки разтвор на кадмиев диацетат (5.2.2.4) към бистрата течност.

Ако при предварителната идентификация не е открито присъствие на редуциращи агенти, различни от тиолите, йодометрично се проверява дали присъстващите в бистрата течност тиоли не надхвърлят 6 до 8 % от първоначалното количество.

В центрофужната епруветка, съдържаща утайката, се поставят 10 сm3 (ml) метанол (5.2.2.3) и утайката се диспергира фино чрез разбъркване със стъклена пръчка. Отново се центрофугира поне 15 min при 4000 rpm. Бистрата течност се отлива и се проверява за отсъствие на тиоли.

Утайката се промива втори път по същия начин.

В същата епруветка се добавят:

- 2 сm3 (ml) разтвор на метилоктаноат (5.2.2.5),

- 5 сm3 (ml) солна киселина в метанол (5.2.2.7).

Тиолите се разтварят напълно (малко неразтворимо вещество от пълнителя може да остане). Това е разтвор "С".

С аликвотна част от този разтвор се проверява йодометрично дали съдържанието на тиоли е поне 90 % от това, получено по т. 5.1.

5.2.5. Метилиране

Метилирането се провежда или чрез процедура in situ (5.2.5.1), или с предварително приготвен разтвор на диазометан (5.2.5.2).

5.2.5.1. Метилиране in situ.

В апарата за метилиране (5.2.3.2), съдържащ 1 сm3 (ml) етер (5.2.2.11), се въвеждат 50 ml разтвор "С" и се метилира по методика (5.2.3.2) с около 300 mg 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин (5.2.2.8). След 15 min (етерният разтвор трябва да е жълт, което показва излишък от диазометан) разтворът на пробата се прехвърля в шишенце от 2 сm3 (ml) с херметична запушалка. Оставя се в хладилник за една нощ. Едновременно се метилират две проби.

5.2.5.2. Метилиране с предварително приготвен разтвор на диазометан.

В колба със запушалка от 5 сm3 (ml) се поставя 1 сm3 (ml) разтвор на диазометан (5.2.2.12) и след това 50 ml разтвор "С". Оставя се за една нощ в хладилник.

5.2.6. Приготвяне на стандарта.

Приготвя се стандартен разтвор от меркаптооцетна киселина (5.2.2.1) с позната концентрация, съдържащ около 0,06 g чиста меркаптооцетна киселина (5.2.2.1) в 2 сm3 (ml).

Това е разтвор "Е".

Утаява се, проверява се и се метилира, както е описано в 5.2.4 и 5.2.5.

5.2.7. Газхроматографски условия

5.2.7.1. Колона

Тип - неръждаема стомана.

Дължина - 2 m.

Диаметър - 3 mm.

5.2.7.2. Пълнеж 20 % дидецилфталат/Chromosorb WAW, 80 до 100 mesh.

5.2.7.3. Детектор

Пламъчно-йонизационен. Подходяща чувствителност за електрометъра на пламъчно-йонизационния детектор е 8 x 10-10 А.

5.2.7.4. Газове

Газ-носител - азот.

Налягане - 2,2 bar.

Дебит на потока - 35 сm3 (ml)/min.

Допълнителен газ - водород.

Налягане - 1,8 bar.

Дебит на потока - 15 сm3 (ml)/min.

Захранване на детектора - както е посочено от производителите на апарата.

5.2.7.5. Температурни условия

Инжектор - 200 °С

Детектор - 200 °С

Колона - 90 °С.

5.2.7.6. Скорост на хартията на самописеца: 5 mm/min.

5.2.7.7. Количество за инжектиране: 3 ml. Правят се пет инжектирания.

5.2.7.8. Хроматографските условия са дадени като указание. Те осигуряват разделяне R, равно или по-добро от 1,5, като:

r1 и r2 са времената на задържане в min;

W1 и W2 - широчините на пиковете при половината от височините им в mm;

d' - скоростта на хартията в mm/min.

Препоръчва се хроматографирането да завърши с повишаване на температурата от 90 до 150 °С при скорост 100 С/min, за да се елиминира възможността за влияние на лабилните вещества при следващите хроматографирания.

5.2.8. Изчисления

5.2.8.1. Коефициент на пропорционалност на меркаптооцетната киселина. Той е изчислен по отношение на метилоктаноат на базата на стандартна смес.

Ако с "t" се означи меркаптооцетната киселина:

нека:

kt е нейният корекционен коефициент;

S't - площта на нейния пик.

Ако с "с" се означи метилоктаноата:

нека:

S'c - площта на неговия пик,

тогава:

	М'		S'c
kt =	------	x	------- .
	М'с		S't

Този коефициент варира според използваната апаратура.

5.2.8.2. Концентрация на меркаптооцетната киселина в пробата.

Ако с "t" се означи меркаптооцетната киселина:

нека:

St - площта на нейния пик.

Ако с "с" се означи метилоктаноата:

нека:

Sc - площта на неговия пик;

М - масата на първоначалната проба за изпитване в mg,

тогава % (M/M) на меркаптооцетната киселина в пробата е:

За съдържание на меркаптооцетна киселина 8 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,8 % (M/M).

1. Област на приложение

Методът е подходящ за всички козметични продукти.

2. Принцип

Хексахлорофенът се екстрахира с етилацетат и се идентифицира чрез тънкослойна хроматография.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Сярна киселина, 4 М.

3.2. Целит AW.

3.3. Етилацетат.

3.4. Подвижна фаза: бензен, съдържащ 1 % (V/V) ледена оцетна киселина.

3.5. Реактив за проявяване на петната I:

Разтвор на родамин В: разтварят се 0,1 g родамин B в смес от 150 сm3 (ml) диетилов етер, 70 сm3 (ml) абсолютен етанол и 16 сm3 (ml) вода.

3.6. Реактив за проявяване на петната II:

Разтвор на 2,6-дибром-4-(хлоримино) циклохекса-2,5-диенон: разтварят се 0,4 g 2,6-дибром-4-(хлоримино)циклохекса-2,5-диенон в 100 сm3 (ml) метанол, приготвен непосредствено преди употреба.

Разтвор на натриев карбонат: разтварят се 10 g натриев карбонат в 100 сm3 (ml) деминерализирана вода.

3.7. Стандартен разтвор:

Хексахлорофен, 0,05 % (M/V) разтвор в етилацетат.

4. Апаратура

4.1. Плаки за тънкослойна хроматография Kieselgel F254, 20 x 20 сm или еквивалентни.

4.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4.3. Термостатирана при 26 °С водна баня, в която се слага хроматографската вана.

5. Приготвяне на пробата за изпитване

5.1. Смесват се добре 1 g от хомогенизираната проба с 1 g целит AW (3.2) и 1 сm3 (ml) сярна киселина (3.1).

5.2. Суши се 2 h при 100 °С.

5.3. Охлажда се и сухият остатък се стрива на фин прах.

5.4. Екстрахира се двукратно с по 10 сm3 (ml) етилацетат (3.3), центрофугира се след всяка екстракция и етилацетатните слоеве се обединяват.

5.5. Изпарява се при 60 °С.

5.6. Остатъкът се разтваря в 2 сm3 (ml) етилацетат (3.3).

6. Процедура

6.1. Върху плаката за тънкослойна хроматография се нанасят 2 ml от разтвора на пробата за изпитване и 2 ml от сравнителния разтвор.

6.2. Хроматографската вана се насища с подвижната фаза (3.4).

6.3. Плаката за тънкослойна хроматография се поставя във ваната и хроматограмата се развива, докато фронтът на разтворителя се придвижи на 15 сm.

6.4. Плаката се изважда и се суши в сушилня с вентилатор при около 105 °С.

6.5. Проявяване на петната

Петната от хексахлорофена се оцветяват, както е посочено в 6.5.1 или в 6.5.2.

6.5.1. Плаката се напръсква равномерно с проявяващ реактив I (3.5). След 30 min плаката се разглежда на УВ-лампа при l = 254 nm.

6.5.2. Плаката се напръсква равномерно с разтвор на 2,6-дибром-4-(хлоримино) циклохекса-2,5-диенон - проявяващ реактив II (3.6). След това плаката се напръсква с разтвор на натриев карбонат (3.6). Плаката се суши 10 min при стайна температура, след което се разглежда на дневна светлина.

7. Интерпретация

7.1. Проявяващ реактив I (3.5):

Хексахлорофенът се наблюдава като синкаво петно на жълто-оранжев флуоресциращ фон и има Rf-стойност около 0,5.

7.2. Проявяващ реактив II (3.6):

Хексахлорофенът се наблюдава като небесно-синьо до тюркоазено петно на бял фон и има Rf-стойност около 0,5.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Този метод е приложим за всички козметични продукти.

2. Дефиниция

Съдържанието на хексахлорофен в пробата, определено по този метод, се изразява като % (M/M) хексахлорофен.

3. Принцип

След превръщане в метилово производно хексахлорофенът се определя чрез газова хроматография с електрон-улавящ детектор.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография".

4.1. Етилацетат.

4.2. н-метил-н-нитрозо-п-толуенсулфонамид (diazald).

4.3. Диетилов етер.

4.4. Метанол.

4.5. 2-(2-етоксиетокси) етанол (карбитол).

4.6. Мравчена киселина.

4.7. Калиев хидроксид, 50 % (M/M) воден разтвор. Приготвя се непосредствено преди употреба.

4.8. Хексан, за спектроскопия.

4.9. Бромхлорофен (стандарт № 1).

4.10. 4,4',6,6'-тетрахлор-2,2'-тиодифенол (стандарт № 2).

4.11. 2,4,4'-трихлор-2-хидрокси-дифенилов етер (стандарт № 3).

4.12. Ацетон.

4.13. Сярна киселина, 4 М.

4.14. Целит AW.

4.15. Мравчена киселина / етилацетат, 10 % (V/V) разтвор.

4.16. Хексахлорофен.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Миниапарат за получаване на диазометан (Analyt. Chem., 1973, 45, 2302-2).

5.3. Газов хроматограф с електрон-улавящ детектор, с Ni63-източник.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на стандартен разтвор

Стандартът се подбира така, че да не взаимодейства с никое вещество, съдържащо се в пълнителя на анализирания продукт. Обикновено най-подходящ е стандарт № 1 (4.9).

6.1.1. В мерителна колба от 100 cm3 (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 50 mg от стандарт № 1, 2 или 3 (4.9, 4.10 или 4.11) и 0,05 g хексахлорофен (4.16) от 100 сm3 (ml). Долива се до марката с етилацетат (4.1) (разтвор А). 10 сm3 (ml) от разтвор А се разрежда до 100 сm3 (ml) с етилацетат (4.1) (разтвор Б).

6.1.2. В мерителна колба от 100 сm3 (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 0,05 g от стандарт № 1, 2 или 3 (4.9, 4.10 или 4.11). Долива се до марката с етилацетат (4.1) (разтвор В).

6.2. Приготвяне на пробата (Поради широката гама на типовете продукти, които могат да задържат хексахлорофен, важно е да се провери чрез тази процедура извличането на хексахлорофена от пробата, преди да се отчитат резултати. Ако извличането е лошо, трябва да се направят модификации, като смяна на разтворителя (бензен вместо етилацетат) и други със съгласието на заинтересованите страни.)

Претегля се 1 g от хомогенизираната проба с точност 0,001 g и се смесва напълно с 1 сm3 (ml) сярна киселина (4.13), 15 сm3 (ml) ацетон (4.12) и 8 g целит AW (4.14). Сместа се суши до въздушно сухо състояние на парна баня за 30 min, след което се суши за 1 h и 30 min в сушилня с вентилатор. Охлажда се, остатъкът се стрива на фин прах и се прехвърля в стъклена колона. Елуира се с етилацетат (4.1) и се събират 100 сm3 (ml). Прибавят се 2 сm3 (ml) от разтвора на вътрешния стандарт (разтвор Б) (6.1.2).

6.3. Метилиране на пробата

Апаратчето и всички реактиви за получаване на диазометан се охлаждат до 0 ° - 4 °С в продължение на 2 h. Във външното отделение на апаратчето се поставят 1,2 сm3 (ml) от разтвора, получен в 6.2, и 0,1 сm3 (ml) метанол (4.4). В централния резервоар се поставят около 0,2 g диазалд (4.2) и се разтваря чрез добавяне на 1 сm3 (ml) карбитол (4.5) и 1 сm3 (ml) диетилов етер (4.3).

Апаратчето се сглобява, потапя се наполовина в ледена баня при 0 °С и в централния резервоар се впръсква със спринцовка 1 сm3 (ml) охладен разтвор на калиев хидроксид (4.7). Трябва да се провери дали полученото жълто оцветяване от образуващия се диазометан е трайно. Ако жълтото оцветяване не е трайно, метилирането се повтаря с нови 0,2 g диазалд (4.2) (Трайността на жълтото оцветяване е указание за излишък на диазометан, който е необходим, за да се осигури пълно метилиране на пробата.).

Апаратчето се изважда от банята след 15 min, след което се оставя затворено 12 h при стайна температура. Апаратчето се отваря, излишъкът от диазометан реагира с прибавените няколко капки разтвор на мравчена киселина в етилацетат (4.15) и органичният разтвор се прехвърля в мерителна колба от 25 сm3 (ml). Долива се до марката с хексан (4.8).

1,5 ml от този разтвор се инжектира в хроматографа.

6.4. Метилиране на стандарта.

Апаратчето и всички реактиви за получаване на диазометан се охлаждат до 0 ° - 4 °С в продължение на 2 h. Във външното отделение на апаратчето се поставят:

0,2 сm3 (ml) разтвор В (6.1.1),

1 сm3 (ml) етилацетат (4.1),