МЕТОД 7: ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФОСФАТАЗНАТА АКТИВНОСТ

(модификация на Сандерс и Сейгър)

1. ОБХВАТ И ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Този метод описва установяването на фосфатазната активност в:

— сухо високомаслено мляко или високомаслено мляко на прах,

— сухо пълномаслено мляко или пълномаслено мляко на прах,

— сухо частично обезмаслено мляко или частично обезмаслено мляко на прах,

— сухо обезмаслено мляко или обезмаслено мляко на прах.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Фосфатазната активност на сухите млека е показател за количеството на наличната алкална фосфатаза. Тя се изразява като количеството фенол в мкг, освободен от 1 мл възстановено мляко, определено чрез описаната по-долу процедура.

3. ПРИНЦИП

Фосфатазната активност на сухите млека се изразява със способността на фосфатазата да освобождава фенол от динатрийфенилфосфат. Количеството освободен фенол при посочените условия се определя чрез спектрофотометрично измерване на цвета, проявен с реактива на Гиб.

4. РЕАГЕНТИ

4.1. Разтвор А

Буферен бариево-боратен хидроксид: рН 10.6 ± 0.1 при 20 ^°С.

Разтварят се: 25.0 г бариев хидроокис (Ba(OH)₂.8H₂O) във вода и се разреждат до обем 500 мл.

Разтварят се: 11.0 г борна киселина (H₃BO₃) във вода и се разреждат до общ обем 500 мл.

Двата разтвора се смесват и се загряват до 50^°С.

Сместа се разклаща и охлажда до стайна температура.

рН се свежда до 10.6 ± 0.1 с помощта на разтвор на бариевия хидроокис, след което сместа се филтрира.

Разтворът се съхранява в плътно затворен съд.

Преди употреба буферът се разрежда с равно количество вода.

4.2. Разтвор Б

Цветопроявяващ буфер

Разтварят се 6,0 г натриев метаборат (NaBO₂) (или 12,6 г (NaBO₂.4Н₂О) и 20,0 г натриев хлорид (NaCl) във вода и се разреждат с вода до 1000 мл.

4.3. Разтвор В

Разтвор на буферен субстрат.

4.3.1. Разтварят се 0,5 г динатриевфенилфосфат (Na₂C₆H₅PO₄.2H₂O) в 4,5 мл от разтвор Б (точка 4.2). Добавят се две капки от разтвор Д и се оставя за 30 мин. Цветът се екстрахира с 2,5 мл бутанол (точка 4.10). При необходимост цветната екстракция се повтаря. След отделянето бутанолът се изхвърля. Разтворът може да се съхранява в хладилник няколко дни. Преди употреба цветът трябва да се прояви и извлече още веднъж.

4.3.2. С пипета се прехвърля 1 мл от този разтвор в обемна колба от 100 мл и колбата се допълва до обема ѝ с разтвор А. Буферният разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

4.4. Разтвор Г

Утаител

Разтварят се 3,0 г цинков сулфат (ZnSO₄.7H₂O) и 0,6 г меден сулфат (II) (CuSO₄.5H₂O) във вода и се допълват с вода до 100 мл.

Реактив на Гиб

Разтварят се 0,040 г 2,6-дибромхинин 1,4-хлорамид (O.C₆H₂Br₂.NCl) в 10 мл 96 % етанол. Разтворът се съхранява в тъмна стъклена бутилка в хладилник. При обезцветяване реактивът се изхвърля.

4.6. Цветоразредителен буфер

10 мл от разтвор Б (точка 4.2) (цветопроявяващият се буфер) се разреждат с вода до 100 мл.

4.7. Разтвор на меден сулфат

Разтваря се 0,05 г меден сулфат (II) (CuSO₄.5H₂O) с вода и се долива с вода до 100 мл.

4.8. Стандартен разтвор на фенол

Разтваря се 0,200 г ± 0,001 г чист фенол и се долива в обемна колба с вода до 100 мл. Разтворът може да се съхранява в хладилник няколко месеца. Разреждат се 10 мл от този разтвор с вода до 100 мл. Така полученият разреден разтвор съдържа 200 мкг фенол в 1 мл и може да бъде използван за приготвяне на по-разредени разтвори.

4.9. Вряща дестилирана вода

4.10. N-Butanol

5. АПАРАТУРА

5.1. Аналитична везна.

5.2. Водна баня, термостатично контролирана при 37 ^°С ± 1 ^°С.

5.3. Спектрофотометър подходящ за отчитане на дължина на вълната 610 нанометра.

5.4. Филтърна хартия (Schleicher и Schull 597, Whatman 42 или еквивалентна филтърна хартия).

5.5. Вряща водна баня

5.6. Алуминиево фолио.

6. ПРОЦЕДУРА

Предпазни мерки:

1. Да се избягва пряко излагане на слънчева светлина.

2. Всички стъклени прибори, запушалки и преносни материали трябва да бъдат идеално чисти. Препоръчва се да се изплакват и изваряват с вода или да се третират на пара.

3. Да се избягва използването на пластмасови материали (например, запушалки), тъй като те могат да съдържат фенол.

4. Слюнката съдържа фосфатаза. Затова следва внимателно да се избягва замърсяване със следи от слюнка.

6.1. Подготовка на пробата

6.1.1. Претеглят се с точност до 0.1 г 10 г. от пробата и се разтварят в 90 мл вода. Температурата на разтваряне на сухото мляко не трябва да превишава 35 ^°С.

6.2. Определяне

6.2.1. Поставят се в две епруветки по 1 мл възстановено мляко, както е описано в 6.1.1.

Едната от епруветките се загрява във вряща вода за 2 минути. Епруветката и водната баня (точка 5.5) или бехеровата чаша се покриват с алуминиево фолио (точка 5.6), за да се гарантира затоплянето на цялата епруветка. Охлажда се в студена вода до стайна температура. Тази епруветка се използва за празна проба. При всички следващи действия двете епруветки се третират еднакво.

6.2.3. Прибавят се 10 мл от разтвор В (точка 4.3.2), разбърква се и епруветката се поставя на водна баня при 37 ^°С (точка 5.2).

6.2.4. Загрява се на водна баня за 60 мин, като периодично се разклаща.

6.2.5. Епруветките веднага се прехвърлят във вряща водна баня (точка 5.5) за 2 мин. Охлаждат се до стайна температура в студена вода.

6.2.6. Добавя се 1 мл от разтвор Г (точка 4.4), смесва се и се филтрира през суха филтърна хартия. Първите филтрати се изхвърлят до получаване на прозрачна течност.

6.2.7. От всеки филтрат се поставят по 5 мл в епруветките, добавят се 5 мл от разтвор Б (точка 4.2) и 0,1 мл от разтвор Д (точка 4.5). Полученият разтвор се хомогенизира.

6.2.8. Разтворът се оставя до проявяване на цвета при стайна температура за 30 мин, но далеч от пряка слънчева светлина.

6.2.9. Измерва се оптичната плътност на пробата спрямо празната проба при дължина на вълната, посочена в точка 5.3.

6.2.10. Анализът се повтаря, ако оптичната плътност на разтвора превишава стандартната проба с 20 µг фенол, приготвена съгласно точка 7.

Ако тази граница е превишена, се разрежда подходящ обем от възстановеното мляко съгласно точка 6.1.1 с подходящ обем от свареното мляко, както е посочено в точка 6.2.2, с цел дезактивиране на алкалната фосфатаза.

7. ПОДГОТОВКА НА СТАНДАРТНАТА КРИВА

7.1. В четири 100 мл обемни колби се прехвърлят посредством пипета съответно по 1 мл; 3 мл; 5 мл и 10 мл от стандартния разтвор на фенол, разреден съгласно точка 4.8, и се доливат до марката с вода. Тези разредени разтвори съдържат съответно 2 мкг; 6 мкг; 10 мкги 20 мкг фенол/мл.

7.2. Поставя се посредством пипета 1 мл вода или 1 мл от всеки стандартен разтвор (точка 7.1) в епруветките с цел получаване на серия от проби, съдържащи 0 мкг (стойност на празната проба, получена чрез използване на 1 мл вода); 2 мкг; 6 мкг; 10 мкг или 20 мкг фенол.

7.3. Последователно във всяка епруветка посредством пипета се поставят 1 мл от разтвора меден сулфат (II) (точка 4.7), 5 мл разтвор на цветоразредителен буферен разтвор (точка 4.6), 3 мл вода и 0,1 мл от разтвор Д (точка 4.5). Полученият разтвор се разбърква.

7.4. Епруветките се оставят далеч от пряка слънчева светлина при стайна температура за 30 мин.

7.5. Измерва се поглъщаемостта на разтворите във всяка една от епруветките, сравнена със стойността на празната проба при дължина на вълната, посочена в точка 5.3.

7.6. Стандартната крива се изработва чрез нанасяне на стойностите на поглъщане срещу стойностите на фенол в микрограма, както е посочено в точка 7.2.

8. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

8.1. Изчисление

8.1.1. Стойностите се превръщат в микрограма фенол, както е посочено в точка 6.2.9, чрез нанасяне на стандартната крива.

8.1.2. Изчислява се фосфатазната активност в мкг фенол/мл възстановено мляко съгласно следната формула:

Фосфатазна активност = 2,4 x Р,

където Р е количеството фенол (мкг) съгласно точка 8.1.1.

8.1.3. Ако е било необходимо разреждане, както е посочено в точка 6.2.10, полученият резултат в точка 8.1.2 се умножава с фактора на разреждане.

8.2. Повторяемост

Разликата между резултатите от два анализа, проведени едновременно или в бърза последователност на една и съща проба, от един и същ лаборант, при еднакви условия, не трябва да превишава 2 мкг освободен фенол на 1 мл възстановено мляко.

МЕТОД 8: ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФОСФАТАЗНА АКТИВНОСТ

(ПРОЦЕДУРА АШАФЕНБУРГ И МЮЛЕН)

1. ОБХВАТ И ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

С този метод се описва начинът за определяне на фосфатазната активност на:

— сухо високомаслено мляко или високомаслено мляко на прах,

— сухо пълномаслено мляко или пълномаслено мляко на прах,

— сухо частично обезмаслено мляко или частично обезмаслено мляко на прах,

— сухо обезмаслено мляко или обезмаслено мляко на прах.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Фосфатазна активност на сухи млека е показател за количеството на наличната активна алкална фосфатаза. Тя се изразява като количеството р-нитрофенол в микрограма, освободен от 1 мл проба от възстановено мляко, при описаните условия.

3. ПРИНЦИП

Пробата от възстановено мляко се разрежда с буферен субстрат при рН 10.2, и се загрява при температура 37 ^°С в продължение на два часа. При тези условия, алкалната фосфатаза присъстваща в пробата, освобождава р-нитрофенол от прибавения динатриев р-нитрофенил фосфат. Освободеният р-нитрофенол се определя чрез директно сравняване със стандартни цветни стъкла в обикновен калибратор, чрез използване на отразена светлина.

4. РЕАГЕНТИ

4.1. Буферен разтвор на натриев карбонат-бикарбонат.

Разтварят се 3,5 г дехидриран натриев карбонат и 1,5 г натриев бикарбонат във вода и се разреждат с вода в обемна колба до 1000 мл.

4.2. Буферен субстрат

Разтварят се 1,5 г двунатриев р-нитрофенилфосфат в буферния разтвор натриев карбонат-бикарбонат (точка 4.1) и се разреждат в обемна колба с буфер (точка 4.1) до 1000 мл.

Този разтвор е стабилен за срок от един месец, ако се съхранява в хладилник (≤ 4 °С), но трябва да се провежда тест за контрол относно цвета на такива разтвори (точка 6 — предпазна мярка 3).

4.3. Избистрящи разтвори

4.3.1. Разтвор на цинков сулфат.

Разтварят се 30,0 г цинков сулфат (ZnSO₄) и се разреждат в обемна колба с вода до 1000 мл.

4.3.2. Разтвор на калиев фероцианат (II)

Разтварят се 17,2 г калиев фероцианат (II) трихидрат [K₄Fe(CN)₆.3Н₂О] и се разреждат в обемна колба с вода до 100 мл.

5. АПАРАТУРА

5.1. Аналитична везна.

5.2. Водна баня, термостатично контролирана при 37 ^°С ± 1 ^°С).

5.3. Уред за сравняване със стандартен образец, снабден със специален диск с цветни стъкла, калибрирани в мкг р-нитрофенол/мл мляко и с клетки 2 x 25 мм.

6. ПРОЦЕДУРА

Предпазни мерки:

1. След използване епруветките трябва да се изпразнят, да се изплакнат с вода, да се измият с топла вода, съдържаща алкален миещ препарат, след което да се изплакнат с чиста топла чешмяна вода, накрая да се изплакнат с вода и да се подсушат.

Пипетите трябва да се изплакнат със студена чешмяна вода веднага след употреба, последвано от изплакване с вода и подсушаване преди употреба.

2. Запушалките на епруветките трябва да се изплакнат с топла чешмяна вода веднага след употреба, след което се изваряват във вода за 2 мин.

3. Разтворът на буферния субстрат (точка 4.2) може да остане стабилен най-малко един месец, ако се съхранява в хладилник при температура не по-висока от 4 ^°С. Нестабилността му се изразява в появата на жълто оцветяване. Макар че изпитването винаги се отчита спрямо вряща контрола, съдържаща същия разтвор на буферен субстрат, препоръчва се да не се използва разтворът, ако той дава отчитане на цвета повече от 10 мкг при отчитане на 25 мм клетка в уред за сравняване със стандартен образец при използване на дестилирана вода в другата 25 мм клетка.

4. За всяка проба трябва да се използва отделна пипета, като се избягва замърсяването ѝ със слюнка.

5. Пробата не трябва да бъде излагана на директна слънчева светлина.

6.1. Подготовка на пробата

Разтварят се 10 г от продукта в 90 мл вода. Температурата на разтваряне не трябва да е по-висока от 35 ^°С.

6.2. Определяне

6.2.1. С пипета се поставят 15 мл от буферния субстрат (точка 4.2) в чиста и суха епруветка, последвано от 2 мл от възстановената проба (точка 6.1), която ще бъде изпитвана. Епруветката се затваря със запушалка, съдържанието се хомогенизира чрез обръщане и се оставя на водна баня при 37 ^°С (точка 5.2).

6.2.2. В същото време на водна баня се поставя контролна епруветка, съдържаща 15 мл от буферния субстрат и 2 мл от заврялата възстановена проба, подобна на изпитваната.

6.2.3. Двете епруветки се махат от водната баня след 2 часа и към тях се добавя 0,5 мл цинков сулфат като утаител (точка 4.3.1). Епруветката се запушва, разклаща се енергично и се оставя в покой за 3 мин. Добавят се 0,5 мл калиев фероцианат (II) утаител (точка 4.3.2), размесва се добре и се филтрира през фуния с филтърна хартия (точка 5.4). Прозрачният филтрат се събира в чиста епруветка.

6.2.4. Филтратът се прехвърля в 25 мм клетка и се сравнява с филтрата на кипналата контролна проба в уреда за сравняване, като се използва специален диск (точка 5.3).

7. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

7.1. Изчисляване

Директното отчитане, получено в точка 6.2.4, се записва като мкг р-нитрофенол/мл проба или на милилитър от възстановената проба.

7.2. Повторяемост