След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания

По отношение на транскрипцията само една от веригите служи като матрица за биосинтеза на РНК върху даден ген и се означава като матрична. В някои участъци на ДНК едната верига служи като матрична, а в други участъци другата верига служи като матрична, т.е. генетична информация за синтеза на РНК се ползва и от двете вериги. Комплементарната на матрицата верига се нарича кодираща и има идентична секвенция на базите с РНК, получаваща се при транскрипция, но вместо Т, в РНК има У.

1) предпочитаната анти-конфигурация на N-гликозидната връзка в нуклеотидите;

2) преобладаване на амино- и лактамните тавтомерни форми на базите.

Това обяснява защо комплементарни бази в двойната спирала на ДНК са именно аденин-тимин и гуанин-цитозин. Водородните връзки до голяма степен определят стабилността на двойната спирала.

Фиг. 3-13. Водородни връзки между комплементарните бази в двойната спирала на ДНК според Watson и Crick.

Освен комплементарни, веригите в двойната спирала са и антипаралелни: едната верига върви в посока 5'-3', а другата в обратна посока 3'-5'.

В отсъствие на фосфодиестерази, фосфодиестерните връзки в ДНК са стабилни и изолирана ДНК може да се съхранява дълго време.

3.5.3. Денатурация и ренатурация на ДНК

Денатурацията на ДНК е процес, при който при увеличение на температурата, при снижаване солевата концентрация на разтвора, а също и в алкална среда, се разкъсват водородните връзки между базите и двете вериги се разделят. Нарушават се също и -взаимодействията между базите във всяка верига и те остават съединени във веригата само чрез фосфодиестерните връзки. Денатурацията може да се проследи по увеличеното поглъщане на УВ светлина при 260 nm (хиперхромен ефект) или по намалението на вискозитета на разтвора. Кривата, отразяваща процента на денатурация от температурата, се нарича крива на топене (фиг. 3-14). Температурата, при която се достига 50 % денатурация, се означава като температура на прехода (Т_m).

Фиг. 3-14. Крива за денатурация на ДНК в зависимост от температурата.  Тm - температура на прехода.

Денатурацията на изолирана ДНК дава сведения за относителния брой на двойките Г-Ц и А-Т. ДНК е по-устойчива на денатурация, ако съдържа повече двойки Г-Ц. Колкото е по-голям броят на двойки Г-Ц в ДНК, толкова е по-висока температурата на топене на ДНК.

Ренатурация, или обратното свързване на комплементарни, разделени при денатурация вериги, може да се извърши, ако температурата се понижи бавно. Ренатурацията е бавен процес, който зависи от срещата на комплементарни ДНК вериги.

Хибридизация се нарича специфичната реасоциация на комплементарни вериги от различен произход (напр. от различни ДНК-молекули или от ДНК и от РНК, или от различни РНК-молекули). Като експериментална техника позволява да се установяват хомологии между ДНК на различни видове (вж гл.16).

3.5.4. Конформационни форми на ДНК вследствие вариации в конформацията на нуклеотидите

Поради вариации в конформацията на нуклеотидите, двойната спирала на ДНК е гъвкава структура, която може да съществува в няколко различаващи се форми (В, А, Z). Най-стабилна и преобладаваща при физиологични условия е форма В и моделът на Watson и Crick съвпада с тази форма. А-формата, която се образува при ниска влажност в лабораторията, прилича на В-формата, също е дясно-въртяща спирала, но е по-компактна (вместо 10 има 11 бази на един оборот). Z-ДНК е ляво-въртяща спирала. Тя може да присъства в клетката като малки участъци от общата ДНК, които съдържат редуващи се пуринови и пиримидинови нуклеотиди, включени между дълги участъци от В-ДНК. В Z-ДНК скелетът има зигзагообразен ход, а не спирален, както е в В-ДНК. И в трите форми на ДНК веригите са комплементарни и антипаралелни.

В т. 3.12 ще намерите Web-връзки към сайт с молекулни изображения на трите форми на ДНК.

3.5.5. Специфични и повтарящи се последователности в ДНК

Ориентировъчните проценти за специфичните и повтарящи се последователности в човешката ДНК са дадени в табл. 3-1.

Повторите с умерена честота са до 1 млн копия. Към тях спадат известните като SINEs (short intespersed nuclear elements) и LINEs (long intespersed nuclear elements) секвенции в ДНК, всяка около 5 % от общата ДНК.

3.5.6. Вариации в конформацията на ДНК, причинени от специфични повтарящи се мотиви в секвенцията на ДНК

Наличието на специфични мотиви в некодиращата секвенция на ДНК, означавани като dos-ДНК (dos - defined ordered structures, или структури с дефиниран порядък) може да е причина за вариации в конформацията на ДНК като огъване, образуване на фуркетни и кръстовидни форми, тройно- и четворноверижни участъци. Тези мотиви включват симетрични елементи като обратни повтори, огледални повтори, прави повтори (вж табл. 3-2), а също и хомопуринови и хомопиримидинови секвенции, поли-А участъци и участъци, богати на Г.

Освен водородни връзки по Watson-Crick, между базите в ДНК могат да се образуват и така наречените водородни връзки по Hoogsteen (фиг. 3-16), които позволяват образуване на тройноспирални участъци в ДНК. Тези водородни връзки по Hoogsteen възникват между две полипуринови и една полипиримидинова верига, напр. Г-Г-Ц или А-А-Т, а също и между две полипиримидинови вериги и една полипуринова верига, напр. Т-А-Т или Ц-Г-Ц.

Фиг. 3-16. Водородни връзки между базите по Hoogsteen.

Фиг. 3-17. Тройно-верижен участък в ДНК, наричан Н-ДНК.

Фиг. 3-17а. Кватернерни структури в ДНК: Вляво - Част от кватернерна структура (четворноверижен участък) в ДНК; Вдясно - Взаимодействие между четири гуанинови бази в кватернерната структура чрез водородни връзки по Hoogsteen.

3.5.7. Суперспирализиране на ДНК

Суперспирализиране на ДНК възниква при огъване или извиване оста на двойната спирала на ДНК. Среща се в различна степен както при малки кръгови ДНК в прокариоти (фиг. 3-18), така и при линейните ДНК в еукариоти. Суперспирализираната структура е напрегната за разлика от релаксираната.

Суперспирализирането е важно за постигане по-голяма компактност на ДНК (вж т. 3.5.8.) Освен това то настъпва при разтваряне на веригите при репликация (гл. 12) и транскрипция на ДНК (гл. 13). Суперспирализирането не е случаен, а регулиран процес във всяка клетка.

Фиг. 3-18. Суперспирализиране на ДНК в прокариоти. 1 - релаксирано състояние; 2 - суперспирализирано състояние.

3.5.8. Пакетиране на ДНК

Ако ДНК в човешка клетка се изпъне, нейната дължина би била около 2 м. А диаметърът на ядрото, в което ДНК е пакетирана, е 0.006 mm.

ДНК в човешки клетки е свързана с белтъци в съотношение 1:2. Белтъците са три групи: хистонови белтъци, нехистонови хромозомни белтъци и ензимни белтъци, участващи в репликацията (глава 12) и транскрипцията (глава 13).

Хистоните са консервативни белтъци, което подчертава важната им функция в еукариоти. Масата на хистоните е приблизителна равна на тази на ДНК. Има пет вида хистони: Н1, Н2А, H2B, Н3 и Н4. Те улесняват пакетирането на ДНК в по-малък обем, като се свързват с ДНК и изграждат по-компактни структури, наречени нуклеозоми. Организацията на нуклеозомите е представена на фиг. 3-19-2. Пакетирането на нуклеозомите в по-висши структури е описано в т. 3.5.8.2. За удобство фиг. 3-19 е представена в т. 3.5.8.1. и 3.5.8.2.

Фиг. 3-19. Пакетиране на ДНК в структури от по-висш порядък. 1 - ДНК; 2a - нуклеозома (Около октамер от хистони, съдържащ по два от хистони Н2А, Н2В, Н3 и Н4, е навита ДНК (1.75 оборота); 2b - хроматозома - (към нуклеозомата е прикрепен хистон Н1 (в зелен цвят); 3 - нишка от нуклеозоми с диаметър 10 nm (по-компактна от В-ДНК 7 пъти); 4 - нишка с диаметър 30 nm (по-компактна от В-ДНК 40 пъти); 5 - структура с диаметър 300 nm (получава се чрез допълнително нагъване на нишки с диаметър 30 nm (в кафяво) и прикрепването им към скелета на митотична хромозома (в черно); 6 - част от интерфазна хромозома (по-компактна от В-ДНК около 8 000 и повече пъти), диаметър 700 nm. Получава се при допълнително огъване на скелета заедно с прикрепените към него нишки от ДНК).

В нуклеозомата октамер от хистони, съдържащ по два от хистоните Н2А, H2B, Н3 и Н4, формира белтъчна сърцевина, около която е навита ДНК (1.75. оборота от ДНК-спиралата). Хистоните Н2А и Н2В са богати на лизин, а Н3 и Н4 са богати на аргинин. При физиологично рН лизиновите и аргининовите остатъци са заредени положително и биха могли да участват в неспецифични електростатични взаимодействия с отрицателно заредените фосфатни остатъци от ДНК. За да се избегне това и да се направлява правилното образуване на нуклеозомите е важен т.н. белтък нуклеоплазмин [5]. Той е кисел пентамерен ядрен белтък, който не се свързва нито с хистоните, нито с ДНК. Предполага се, че той осигурява в ядрото йонно обкръжение, подходящо за специфично свързване между хистоните и ДНК.

В нуклеозомата 146 двойки бази от ДНК са защитени от нуклеази и са недостъпни за транскрипция. Нуклеозомите са разделени една от друга с къси участъци свързваща ДНК. Присъединяването на хистон Н1 към нуклеозомата води до получаване на т.н. хроматозома (фиг. 3-19-2). Н1 е най-лабилно свързан към ДНК и отделянето му чрез солева екстракция превръща хроматина в разтворим.

3.5.8.2. Пакетиране на нуклеозомите в митотични хромозоми

Предполага се, че взаимодействието на Н1 със съседни нуклеозоми е от значение за по-нататъшно пакетиране на ДНК в структури от по-висок порядък. Нуклеозомите се пакетират в нишки с диаметър 10 nm, наподобяващи под електронен микроскоп наниз от мъниста (фиг. 3-19-3 ). Така организираната ДНК е около 7 пъти по-компактна структура от В-ДНК. По-нататъшното пакетиране на тези 10-nm нишки в розетка от шест нуклеозоми води до получаване на влакна с диаметър 30 nm (фиг. 3-19-4), наречени соленоиди. В тях ДНК е около 40 пъти по-компактна от В-ДНК.

Фиг. 3-19. Пакетиране на ДНК в структури от по-висш порядък. 1 - ДНК; 2a - нуклеозома (Около октамер от хистони, съдържащ по два от хистони Н2А, Н2В, Н3 и Н4, е навита ДНК (1.75 оборота); 2b - хроматозома - (към нуклеозомата е прикрепен хистон Н1 (в зелен цвят); 3 - нишка от нуклеозоми с диаметър 10 nm (по-компактна от В-ДНК 7 пъти); 4 - нишка с диаметър 30 nm (по-компактна от В-ДНК 40 пъти); 5 - структура с диаметър 300 nm (получава се чрез допълнително нагъване на нишки с диаметър 30 nm (в кафяво) и прикрепването им към скелета на митотична хромозома (в черно); 6 - част от интерфазна хромозома (по-компактна от В-ДНК около 8 000 и повече пъти), диаметър 700 nm. Получава се при допълнително огъване на скелета заедно с прикрепените към него нишки от ДНК).

Не е добре изяснено как соленоидите се пакетират до митотични хромозоми, където дължината на молекулата на ДНК се скъсява спрямо В-ДНК около 8 000 -10 000 пъти. Предполага се, че ДНК образува извивки (бримки), всяка съдържаща около 100 000 нуклеотидни двойки. В соматичните клетки на човека по време на митозата, когато клетките са в процес на делене, хроматинът се пакетира в ясно видими отделни структури, наречени хромозоми, които по време на митозата са видими под светлинен микроскоп. Всяка хромозома съдържа два идентични хроматиди, свързани в т.н. центромер (фиг. 3-20-I). Краищата на хромозомите се наричат теломери. Центромерът разделя хромозомата на два сегмента р (къс) и q (дълъг).

Фиг. 3-20. Организация на ДНК в хромозоми по време на митоза. 1 - Хромозома в началния стадий на митоза; Двата хроматида са представени с червен и син цвят. 2 - Набор от хромозоми на нормален мъж (46ХУ).

Соматичните клетки на човека съдържат 46 хромозоми или 23 двойки, от които 22 са еднакви в мъже и жени и се наричат автозомни хромозоми. Последната двойка (полови хромозоми) се означава като ХХ при жените и ХY при мъжете. Автозомните хромозоми се номерират от 1 до 22 по намаляващ размер (1 е на-голямата и 22 е най-малката хромозома) (фиг. 3-20-II).

Местоположението на гените се означава с числа след буквите p или q. Напр. генът, означен като 15q23-q24, е разположен в дългия сегмент на 15 хромозома ( цифрата 2 означава главната ивица, а числата 3 и 4 - подивици на ивица 2).

3.5.8.3. Интерфазен хроматин

По време на интерфазата, когато ДНК трябва да е достъпна за ензимите на репликацията и транскрипцията, тя е пакетирана по-слабо в структура, наречена хроматин. Известно е, че цялата ДНК не е пакетирана в еднаква степен. В повечето клетки се наблюдават поне три форми на пакетация на ДНК:

1) Хетерохроматин. Той представлява най-плътно пакетираната ДНК, така както е в митотичната хромозомна форма. Тук спадат около 90 % от ДНК, която е транскрипционно неактивна, свързана в нуклеозоми и нечувствителна към действието на нуклеази.

2) Еухроматин. В него степента на пакетиране е много по-слабо изразена. Тук спадат останалите 10 % от ДНК, която съдържа около 100 000 гена. Информацията на тези гени може да се презаписва, т.е се използва за биосинтеза на белтъци и РНК.

3) Домени с извивки (бримки). Има доказателства, че ДНК е прикрепена към матрикс с белтъчна природа: скелет в митотичните хромозоми и ядрен матрикс в интерфазното ядро. Извивки от ДНК се протягат навън от този матрикс, като се смята, че в тях има активни гени.

3.5.8.4. Структурни мотиви в нехистоновите хромозомни белтъци

Нехистоновите хромозомни белтъци имат структурна и регулаторна функция, а към тях принадлежи и целият ензимен набор за репликация и транскрипция на ДНК (вж глава 12 и 13). За целта особено важно е специфичното им свързване с ДНК.

В структурата на хромозомните белтъци има характерни мотиви като -спирала-свивка- -спирала, цинков пръст и левцинов цип (фиг. 3-21), които осигуряват специфично свързване на регулаторните белтъци с определен район от ДНК.

Мотивът -спирала-свивка- -спирала е първият и най-добре изучен мотив в хромозомните белтъци. Пример за такъв мотив има в димерния белтък "cro-репресор" (фиг. 3-21-1). Един от спиралните участъци в този мотив разпознава специфично място от 20 bp в голямата бразда на ДНК [2].

1	2
3	4