След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания

В мотива цинков пръст (фиг. 3-21-2) има серия от повтарящи се домени (от 2 до 9), в които по протежение на веригата Zn атом взаимодейства с общо 4 цистеинови и хистидинови остатъци [3]. Цинковите пръсти взаимодействат с 5 bp в голямата бразда на ДНК. Важността на този мотив за взаимодействието на стероидните хормони с ДНК личи от примера с единична мутация в който и да е от двата цинкови пръсти на рецептора за калцитриол. Такава мутация води до резистентност в действието на хормона и до клиничния синдром рахит.

При мотива "левцинов цип" (фиг. 3-21-3 и 4), открит в карбоксилния край на хромозомни белтъци, в последователност от около 30 остатъци има -спирална структура, в която всеки седми остатък е левцин. Това позволява взаимодействие на тези левцинови остатъци с такива от друга подобна -спирална структура, така че се получава "левцинов цип" [4, 5].

3.6. Роля и конформация на иРНК

Информационните или матрични РНК (иРНК) пренасят информацията за синтеза на белтъци от ДНК в ядрото към специални органели в цитоплазмата, наречени рибозоми, където се извършва белтъчната биосинтеза.

иРНК служи като матрица при белтъчната биосинтеза. Тя е комплементарна на матричната верига на ДНК и идентична с първичната структура на кодиращата верига в ДНК с тази разлика, че вместо Т, съдържа У и има различни нива на структуриране от ДНК. При свързването на няколко рибозоми с иРНК се получават полизоми.

За всички иРНК са характерни следните особености:

В 5'-края на иРНК има нестандартни нуклеотиди като напр. 7-метилгуанозинтрифосфат и 2'-О-метилрибонуклеотид и други. Този край се означава като шапка (фиг. 3-22). Шапката вероятно е необходима, за да бъде разпозната иРНК от апарата за белтъчна синтеза. Веднага след шапката следва т.н. лидерна секвенция, която не се превежда. След нея започва секвенция, която се превежда. Тя започва с иницииращия кодон АУГ и завършва с терминиращ кодон (УАГ или УАА или УГА). След терминиращия кодон е разположена т.н. поли-А-опашка в 3'-края на иРНК, която представлява полимер от аденилатни остатъци (20-250 на брой). "Шапката" и "опашката" защитават иРНК от действието на специфични екзонуклеази.

В прокариотите иРНК са полицистронни, т.е. носят информация за повече от една полипептидна верига. В еукариоти иРНК са моноцистронни, т.е. съдържат информация само за една полипептидна верига. Тъй като информацията е заложена в линейната структура на иРНК, нейната цялост е от особено значение. Всяка промяна в секвенцията, напр. загуба или промяна в нуклеотидите, може да промени белтъка, който се синтезира при превеждане на генетичната информация.

Фиг. 3-22. Структура на участъка, наричан "шапка", прикрепен към 5'-края на иРНК.

Информационните рибонуклеинови киселини се синтезират в ядрото във вид на прекурсорни молекули, които са много хетерогенни по размер. Те са с по-високи молекулни маси от тези на зрелите иРНК. Съдържат екзони (кодиращи последователности) и интрони (некодиращи последователности). Синтезата и зреенето на иРНК са описани в глава 13.

3.7. Конформация на рРНК. Рибозоми

Рибозомните РНК (рРНК) са важни за белтъчната биосинтеза, защото заедно с белтъци изграждат рибозомите. Свързвайки иРНК и тРНК към рибозомите, те правят възможна транслацията на наследствената информация.

Рибозомните РНК са в преобладаващо количество в клетката в сравнение с останалите РНК. Те са метаболитно стабилни поради свързване с рибозомните белтъци и действат в продължение на много транслационни цикли. Метилирани са във висока степен. В пространствената им структура се редуват двойноспирални и едноверижни участъци. В двойноспиралните участъци, наречени фуркетни форми, взаимодействията между базите от различни участъци на веригата са комплементарни и антипаралелни.

Голямата субединица на рибозоми (60S) от бозайници се изгражда от 5S РНК, 28S РНК и 5.8S РНК и приблизително равно количество белтъци. В малката субединица на рибозоми (40S) от бозайници се съдържа 18S рРНК и белтъци. На фиг. 3-23 са представени голямата и малката субединици на рибозомите.

Фиг. 3-23. Структура на рибозоми

1 - голяма субединица; 2 - малка субединица; 3 - комплекс от малка и голяма субединица.

3.8. Структура на тРНК

В тРНК има повече минорни бази, отколкото в останалите РНК. Това увеличава специфичността на тРНК и улеснява разделянето им.

При огъване на тРНК се оформят четири двойноспирални сегменти (поради комплементарност на базите) и три едноверижни бримки. Това е т.н. модел за вторична структура на тРНК, наречен "детелинов лист" (фиг. 3-24).

Във всяка тРНК има четири важни участъци:

1) акцепторен участък (тройка нуклеотиди ЦЦА в 3'-края), където се свързва определена аминокиселина;

2) псевдоуридилова бримка (Т- -Ц) - за свързване с 5.8S рРНК от рибозомите.

3) антикодонна бримка, съдържаща специфичен триплет от нуклеотиди, наречен антикодон, тъй като е комплементарен и антипаралелен на определен кодон в иРНК;

4) дихидроуридилова бримка (D). Тя се свързва с 28S рРНК от 60S рибозомната субединица.

Първите два участъка са еднакви при всички тРНК. Последните два са специфични за всяка тРНК.

Освен споменатите три бримки, има и една допълнителна бримка, условно наричана мини-бримка или вариабилна бримка с дължина от 3-5 до 13-21 бази. Чрез тази бримка в тРНК се осигурява едно и също разстояние между аминокиселинния и антикодонния участъци в тРНК.

Фиг. 3-24. Вторична структура на тРНК за фенил-аланин - модел "детелинов лист". 1 - акцепторен участък (ЦЦА), свързващ аминокиселината; 2 - псевдоуридилова бримка за свързване с 5.8 S рРНК от 60S рибозомната субединица; 3 - вариабилна бримка; 4 - участък, съдържащ антикодон, комплементарен на съответен кодон в иРНК; 5 - дихидроуридинова бримка за свързване с 28S рРНК от 60S рибозомната субединица.

3.9. Малки ядрени РНК

В еукариотното ядро има много копия на високо консервативни нискомолекулни РНК, наречени малки ядрени РНК (мяРНК или на английски snRNA). По състав са стабилни. Повечето от тях са под форма на рибонуклеопротеини, наречени snurps (small nuclear ribonucleoproteins) и означавани съкратено U1, U2 и т.н. В 5'-края на U1 има последователност, частично комплементарна на мястото между екзони и интрони в първичните иРНК-транскрипти (гл. 13). U1 и останалите "snurps" са необходими за процеса на зреене на иРНК, т.е. действат като рибозими - вж т. 3.10.

3.10. Рибозими

Освен белтъчните катализатори, на които е посветена гл. 4, известно е, че и някои РНК имат каталитична функция. Те катализират транс-естерификация и хидролиза на фосфо-диестерни връзки в РНК молекули.

Тези РНК, за които са характерни присъщите за биологичните катализатори каталитична активност и висока специфичност по отношение на субстрата, се наричат рибозими.

Някои от тях (U1, U2, U4-U6, U5-snurps - т. 3.9) катализират отстраняването на интрони и съединяването на екзони при зреенето на иРНК (вж гл. 13).

Друг пример дават 28S рРНК в еукариоти и 23S рРНК в прокариоти, действащи в белтъчната биосинтеза като рибозим с пептидилтрансферазна активност (гл. 14).

РНК с каталитична активност има и в състава на ензима теломераза (гл. 12).

3.11. Приложение на познанията върху нуклеинови киселини в клиничната практика

3. 11.1. Пуринови и пиримидинови аналози като антиракови и антивирусни агенти

Голям брой синтетични аналози на естествените бази, нуклеозиди и нуклеотиди потискат злокачествен растеж и инфекции като или инхибират ензими, които са важни за синтезата на нуклеиновите киселини, или изместват естествените нуклеотиди в нуклеиновите киселини и с това значимо променят взаимодействията между базите.

На фиг. 3-26 са дадени формулите на 6-меркаптопурин (пуринов аналог) и на 5-флуорурацил (пиримидинов аналог).

6-Меркаптопурин (6-МП) е полезен антитуморен агент при хора. В туморните клетки той се превръща в 6-меркаптопурин рибонуклеотид, който се натрупва в клетките и инхибира синтезата на пурини. Добавянето на алопуринол, инхибитор на ензима, който разгражда 6-МП, забавя неговото разграждане и усилва антитуморните свойства на 6-МП. По-подробно механизмът на действието на 6-МП е разгледан в глава 9.

5-флуорурацил сам по себе си не е активен агент. Но той се превръща от клетъчните ензими до активните метаболити 5-флуоруридин-5'-трифосфат (F-УТФ) и 5-флуор-2'-дезоксиуридин-5'-фосфат (F-дУМФ). F-УТФ се включва в РНК и инхибира превръщането на прекурсорна рРНК в зрелите 28S рРНК и 18S рРНК. Освен това променя превръщането на прекурсорни иРНК в зрели иРНК.

F-дУМФ е мощен и специфичен инхибитор на ензима, който синтезира тимин, тъй като се свързва необратимо към него. Това води до необразуване на ТМФ и смърт на клетката поради липса на тимин.

По-подробно механизмът на действието на F-УТФ и F-дУМФ е разгледан в глава 9.



Фиг. 3-26. Примери за синтетични пиримидинови и пуринови аналози с клинично приложение: 5-флуорурацил (пиримидинов аналог) и 6-меркаптопурин (пуринов аналог).

3.11.2. Генетични болести. Примери: сърповидно-клетъчна анемия и фенилкетонурия

Генетичните (или наследствени, генетично-обусловени) болести са заболявания, при които клиничните симптоми са свързани с промени в ДНК. Промените могат да бъдат твърде различни: от точкови мутации до хромозомни увреждания. Поради това генетичните болести се разделят на четири групи: моногенни дефекти (напр. сърповидно-клетъчна анемия), мултифакторно-зависими заболявания вследствие на полигенни дефекти и фактори на околната среда (напр. захарен диабет), хромозомни увреждания (напр. синдром на Dawn), митохондрийни болести. Допълнителна група са ненаследяващи се от поколението генетични дефекти в соматични клетки, като много видове рак.

При мутациите в единични гени се синтезира дефектен ензимен или структурен белтък с променена структура и активност, водещо до заболяване. Те могат да бъдат автозомални доминантни (напр. фамилна хипехорестеролемия) и автозомални рецесивни - напр. фенилкетонурия и сърповидно-клетъчна анемия, разгледани съответно в

Тук е важно да разберем, че първопричината за всяко от тези заболявания е промяната в гена, кодиращ съответния белтък. Промяната в гена за фенилаланинхидроксилаза при фенилкетонурия и в гена за HbS при сърповидно-клетъчната анемия води до белтъци с променена структура. Това от своя страна води до отклонения във функциите и заболяване.

3.12. Насоки за самостоятелна работа

3.12.1. Примерни писмени задачи:

1. Напишете с формули част от полинуклеотидна верига, съдържаща в посока от 5'- към 3'- края четирите нуклеотида, характерни за РНК. Напишете и част от верига на ДНК с характерните за нея нуклеотиди.

С помощта на фиг. 3-2 и 3-11 проверете дaли правилно сте написали скелета на полинуклеотидните вериги, нуклеотидите и връзките (N-гликозидни, естерни и фосфодиестерни).

3.12.2. Изберете главната страница на "Интерактивни тестове". От нея изберете теста:
"Нуклеинови киселини" в желан от Вас режим.

3.12.3. Молекулна графика с компютърната програма RASMOL (RASWIN)

1. Свалете файла rasmol3.zip и го разархивирайте в отделна папка. Отворете програмата Rasmol, любезно предоставена за нашия сайт от нейния автор Roger Sayle, Bioinformatics group, Metaphorics, Santa Fe, New Mexico , и я разучетe.

С програмата RasMol отворете файла bdna.ent, съдържащ атомните координати на част от В-ДНК.

Маркирайте с различен цвят двете вериги, базите, водородните връзки между базите. Разгледайте молекулата под различен ъгъл и я представете с различните модели: Wireframe, Sticks, Ball and Sticks, Spacefull, Ribbons.
3.12.4. Посетете Web-site: "http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html">http://Human Genome Project information (http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html), в който има информация за проекта за разшифроване на човешкия геном.

Ако някоя от връзките не работи поради промяна, извикайте търсачката Google (http://www.google.com) и напишете ключовите думи - напр. human genome project.

3.13. Литература

1. Sayle, R., BioMolecular Structures Group of Glaxo Research & Development, UK,

RASWIN molecular graphics program, 1994.

2. Mondragon, A. and S. C. Harrison. J. Mol. Biol. 219, 1991, 321. The phage 434 Cro/Or1 complex at 2.5 A resolution. PDB Id 3CRO, MMDB [3010].

3. C.K. Liew, K.Kowalski, A.H.Fox, A.Newton, B.K.Sharpe, M. Crossley & J.P.Mackay. Solution Structure Of The Ninth Zinc-Finger Domain Of The U- Shaped Transcription Factor. PDB Id.:1FU9, derived from ASN1.

4. Marti. D. N., I. Jelesarov and H. R. Bosshard. Nmr solution structure of a designed heterodimeric leucine zipper, PDB Id. 1FMH.

5. PDB Id.: IGD2 Leucine zipper

6. Kinniburg, A. J. Nucleic Acids Res. 17, 1989, 7771. A cis-acting transcription element of the c-myc gene can assume a H-DNA conformation