Возможности использования цитогенетических методов при обследовании населения, подвергшегося облучению
Методика проведения цитогенетического анализа
Изтегляне 162 Kb.
|
Свързани:
khristov, Sv prichastie, English Fairy Tales M
| Методика проведения цитогенетического анализа
Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление хромосомных препаратов проводили с использованием стандартного протокола [12, 16]. Культуральная среда RPMI 1640 содержала 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2,5% фитогемагглютинина, 10 мМ 5-бромдезоксиуридина и антибиотики. Инкубацию клеточной культуры проводили при 37°С в течение 48 часов. Препараты метафазных хромосом, предназначенные для анализа нестабильных хромосомных аберраций, окрашивали с использованием технологии «флюоресценция плюс краситель Гимза» (FPG-метод), позволяющей учитывать хромосомные аберрации в лимфоцитах, находящихся на стадии первого после их стимуляции к делению в культуре митотического цикла [11]. При микроскопировании учитывали все типы хромосомных аберраций, распознаваемые без кариотипирования. Анализ стабильных хромосомных аберраций проводили с помощью метода окрашивания, основанного на молекулярной гибридизации ДНК зонда с ДНК метафазных хромосом, фиксированных на предметном стекле (in situ), с последующим использованием флуоресцентной микроскопии для детекции результатов гибридизации (FISH метод). Для анализа использовали коктейль проб: меченые биотином ДНК-пробы для 1, 4 и 12 хромосом в комбинации с меченой дигоксигенином панцентромерной пробой. Процедуру окрашивания проводили по методу [18] в модификации [12]. Для выявления гибридных молекул ДНК применяли иммунохимическое окрашивание препаратов хромосом с использованием FITC-меченого стрептавидина и конъюгированного с биотином антистрептавидина для хромосомных проб и АМСА – меченых антител для панцентромерных проб. Часть препаратов обрабатывали с помощью коммерческих наборов фирмы MetaSystems GmbH, которые включают ДНК зонды, меченные прямыми флюорохромами и специфичные к 1, 4 и 12 хромосомам человека. При проведении цитогенетического анализа учитывали «полные» (реципрокные, tc) и «неполные» (нереципрокные, ti) транслокации, инсерции и комплексные хромосомные обмены. Пересчет частоты обменных аберраций с участием окрашенных хромосом на геномную частоту этих событий осуществляли по формуле, приведенной в работе [15]. Статистический анализ результатов исследования, который включал анализ различий и связей, проводили с применением параметрических и непараметрических методов [4, 8]. Для расчетов использовали пакет программ STATISTICA (StatSoft USA-Russia, версия 6.1). Достоверность статистических гипотез оценивалась при пороговом уровне значимости р<0,05. Изтегляне 162 Kb. Сподели с приятели:
|