Научни резултати постигнати при разработването на изследователски проекти, финансирани от му – София

1. Д-р Галина Железова Железова, д.м., главен асистент, Катедра микробиология, МФ-София; 2. Д-р Мария Стоянова Балабанова, главен асистент, Катедра микробиология, МФ-София.

За периода 1998 до юни 2005 г. бяха съхранени за проучването 211 щама S. pneumoniae, изолирани от материали на болни с обществено придобита пневмококова инфекция. Еритромицин-резистентни S. рneumoniaе (ERSP) бяха 25.6% от изолатите, а резистентни на клиндамицин бяха 10.4% от тях. ERSP бяха резистентни и на кларитромицин и азитромицин с МИК-90 стойности > 64 mg/l, а МИК-90 на клиндамицин беше 0.125 mg/l. Най-често установявахме серотипове/серогрупи 19, 6, 14 и 23 сред ERSP (85%).

Гените на резистентност, определени с PCR, показаха че най-честата причина за резистентност към еритромицин е mef A ген, установен в 57.8%. Erm В ген (MLS тип) е втори по-честота механизъм - 36.6%. Четири щама S. рneumoniaе (5.6%) бяха ERSP поради мутация в рибозомен протеин L4. Щамовете с mef A ген имаха ниски МИК-90 стойности от 1 до 8 mg/l за макролидите и бяха чувствителни на клиндамицин. Пневмококите с еrm В ген имаха високо ниво на резистентност - МИК-90 беше повече от 64 mg/l за еритромицин, кларитромицин, азитромицин и клиндамицин. Щамовете с L4 мутация бяха също с високо ниво на резистентност към макролиди, но бяха чувствителни на клиндамицин.

За фенотипиране на ERSP използвахме тройния дисков метод (еритромицин, клиндамицин и рокитамицин). M-фенотип бяха изолатите резистентни на еритромицин, но чувствителни на 16-членния рокитамицин и клиндамицин. MLS тип резистентност се проявява фенотипно като: частичен индуцибелен фенотип - iMcLS (индуцибелен ефект към 16-членния рокитамицин, но резистентни на клиндамицин без индукция); конститутивен MLS тип - cMLS (резистентни на еритромицин, клиндамицин и рокитамицин). Истински индуцибелен фенотип - iMLS (не е установен от нас за тестуваните щамове S. рneumoniaе). Изолатите с L4 мутация имаха различен фенотип (резистентни на еритромицин и рокитамицин без индукция, но чувствителни на клиндамицин). Тройният дисков метод позволява с по-голяма точност да се предположат механизмите на резистентност при ERSP.

Изследванията по научния проект и получените резултати предстои да бъдат публикувани в научно списание.

1. Сечанова Л.П., и др. “Резистентни на антибиотици Streptococcus pneumoniae в клиничната практика”, Доклад изнесен на І Конференция на Българското Дружество по Медицинска Микробиология (БДММ), София, 3-5 юни 2005, 35 стр., сборник резюмета.

***

1. Проф. Радка Аргирова, дмн, лаб. ретровируси, НЦЗПБ

2. Доц. Илия Манолов Илиев, дх, ФФ, Кат. “Органична химия”

3. Ст.н.с.Наташа Средкова Трендафилова, дх, ИОНХ – БАН, Лаб. по химия на коорд. съед.

4. Н.с. Ивелина Мирчева Георгиева, дх, ИОНХ – БАН,Лаб. по химия на коорд. съед.,

5. Хим.Цветан Трайчев Михайлов, ИОНХ – БАН

Фармацевтичен факултет при Медицински университет – София

Синтезираните петнадесет нови комплексни съединения на преходни метали (церий (III), лантан (III) и неодим (III)) с бис-кумарините: 3,3’-benzylidene-bis(4-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one) 1; 3,3’-(2-pyridylidene)bis(4-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one) 2; 3,3’-(4-pyridylidene)bis(4-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one) 3; 3,3’-(3-pyrazolilidene)bis(4-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one) 4 и 3,3’-(3-pyridylidene)bis(4-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one) 5 бяха изследвани с химични и спектрални анализи с оглед доказване на координационните места на свързване и най-вероятните структури. Съставът на комплексите е окончателно определен и еднозначно е доказана стехиометрията на комплексните съединения. Строежът и химичните връзки на получените комплексни съединения са потвърдени чрез използване на различни спектрални техники и анализи. Всички спектри са интерпретирани на базата на сравнение с изходните спектри на лигандите. Тези анализи доказаха еднозначно координационните връзки на церий (III), лантан (III) и неодим (III) с лигандите. На базата на така получените резултати се доказа, че лигандите се проявяват като тетрадентатни при координацията с лантаноидните йони.

Проведени са теоретични изследвания включващи моделиране на геометричната и електронна структура на изследваните съединения, посредством теорията на функционала на плътността (B3LYP/6-31G*) и теорията на Бейдър, Атоми в молекулата. Намерени са геометриите на глобалните минимуми на съединенията, енергиите на тези геометрии, енергиите на вътрешномолекулните водородни връзки, критичните точки на връзките, електронната плътност в критичните точки, лапласиана на електронната плътност и елиптичността на връзките, зарядите на атомите в състава на съответните съединения. Изчислен е молекулният електростатичен потенциал на неутралните и йонни форми на съединенията и са оценени подходящите места за електрофилна атака, водородни връзки и метална координация. Намерено е, че за неутралните съединения най-добро място за електрофилна атака и метална координация е азотният атом, следван от кислородните атоми. За йонните форми на съединенията изчисленията на молекулния електростатичен потенциал показаха, че най-подходящи места за електрофилна атака и метална координация са кислородните атоми.

Както бе отчетено преди, според изследването за инфекциозност с теста с NR (неутрал рот) 13 съединения (2 лиганда и 11 комплекса) показаха анти-НІV активност в микромоларни концентрации. Най-добре изразена инхибиция на НІV в клетъчна култура бе наблюдавана за NdL1 (51,5%), NdL3 (31,4%) и CeL5 (23,7%). Инхибирането на обратната транскриптаза (RT) бе значтелно по-слабо в сравнение с наблюдаваната биологична активност на всички комплексни съединения. Това показва, че RT не е мишена за демонстрираната антивирусна активност. Същото заключение бе валидно и за друга вирусна мишена – протеазата. За установяване на мишената и механизма на действие на активните комплексни съединения бе проведено култивиране на НІV-1 (10 – 20 серийни пасажа) с цел получаване на мутантни варианти на НІV-1 при третиране на вируса с повишаващи се концентрации. Последващият анализ на НІV-1 вариантите показа пълно репликативно преимущество с редуциран фитнес за репликация и инфекция на вариантите над изходния (дивия) вирус. В същото време, in vitro rRT активността бе неотличима в присъствие и отсъствие на активните комплексни съединения, приложени в крайни концентрации, довели до редуциране на репликацията. Получените от нас вирусни суспенсии бяха концентрирани чрез метод, използващ 30% PEG и подготвени за последващ анализ чрез верижна полимеразна реакция и секвениране. В резултат на изследванията са направени някои изводи относно връзката “структура - функция” на изследваните лиганди и комплексни съединения.

1. Kostova I.P. I.I. Manolov and G. Momekov. Cytotoxic activity of new neodymium (III) complexes of bis-coumarins. Eur. J. Med. Chem., 39, 2004, 765-775.

2. Kostova I.P., I.I. Manolov and G. Tzachev. Synthesis, analysis and cytotoxic activity of new neodymium (III) complexes of bis-coumarins. Book of the XVIII Congress of Chemists and Technologists of Macedonia, Ohrid, Republic of Macedonia, 23 - 25 September, 2004.

3. Kostova I.P. S. Raleva, Z. Mladenova, L. Froloshka, D. Dundarova and R. Argirova. Proceedings of 22^nd Workshop in Jena. Essentiality and Toxicity of Macro, Trace and Ultratrace Elements, Jena, Germany, 24 - 25 September, 2004.

4. Kostova I.P. S. Raleva, Z. Mladenova, L. Froloshka, D. Dundarova and R. Argirova. Proceedings of 22^nd Workshop in Jena. Essentiality and Toxicity of Macro, Trace and Ultratrace Elements, Jena, Germany, 24 - 25 September, 2004.

5. Kostova I.P., S. Raleva, P. Genova and R. Argirova. Recent advances in the discovery and development of plant-derived natural coumarins and their analogues as anti human immunodeficiency virus – type 1 (HIV-1) agents. Biotechnol & Biotechnol. Eq., 19 (1), 2005, 16-22.

6. Kostova I.P., S. Raleva, P. Genova, R. Argirova. Structure-activity relationships of synthetic coumarins as HIV-1 inhibitors. Bioinorganic Chemistry and Applications, 2005, in press.

7. T. Mihaylov, I. Georgieva, G. Bauer, Kostova I.P., I. Manolov, N. Trendafilova. Theoretical Study of the Substituent Effect on the Intramolecular Hydrogen Bonds in Di-(4-hydroxycoumarin) Derivatives. International Journal of Quantum Chemistry, 2005, in press.

1. T. Mihaylov, I. Georgieva, N. Trendafilova, I. Manolov and I. Kostova. Estimation of the electron density distribution and O-H…O hydrogen bond strength in benzylidene- and pyridinomethylene substituted di-4-hydroxycoumarins. DFT study. Second Humboldt conference on computational chemistry, Nessebar, Bulgaria, 1-5 September, 2004, poster.

2. T. Mihaylov, I. Kostova, I. Manolov, N. Trendafilova. Novel neodymium (III) complex with 3,3’-(orthopyridinomethylene)di-(4-hydroxycoumarin), Scientific Conference of Chemical Faculty of University-Sofia, IV Scientific Seminar “New materials of industry”, 23 November, 2004, poster, p. 47.

3. N. Trendafilova and T. Mihaylov Molecular structure and reactive sites of substituted di-(4-hydroxycoumarin)s derived from DFT calculations, Internet Electronic Conference of Molecular Design 2004, November 29-December 12.

4. R. Argirova, D. Dundarova. Principles to prove HIV-integrase inhibitors of viral replication in cell culture. Days of virology in Bulgaria, Oral presentation GV-O-07, Sofia, Sept. 24 – 25, 2004, page 10.

5. S. Raleva, P. Genova, D. Dundarova, L. Froloshka, I. Kostova, I. Manolov, R. Argirova. Studies of anti-HIV effect of synthetic complexes of lanthanides with 4-hydroxycoumarins (4-hc) in cell culture. 21^st Annual Meeting of Clinical Virology, Florida, USA, 5 – 8 May, 2005

6. S. Raleva, P. Genova, D. Dundarova, L. Froloshka, I. Kostova, I. Manolov, R. Argirova. Lowered fitness for replication of HIV-1 in the presence of increasing concentrations of synthetic complexes of lanthanides with 4-hydroxycoumarins in cell culture. Poster, TuPe6.1B03,3^rd IAS Conference on HIV pathogenesis and treatment, Rio, 25 – 28 July, 2005

Научният отчет е приет с ОТЛИЧНА оценка по скалата на Съвета по медицинска наука.
***
ДОГОВОР № 9 / 2004 г.

НАУЧНО НАПРАВЛЕНИЕ: Фармакогнозия и ботаника

ТЕМА НА ИЗСЛЕДОВАТЕЛСКИЯ ПРОЕКТ:биосинтез на Арилтетралинови лигнани в българския ендемит Linum. tauricum

ПЕРИОД НА ФИНАНСОВА ПОДКРЕПА: 2004 година

ВОДЕЩ ИЗСЛЕДОВАТЕЛ: доц. д-р Илиана Илиева Йонкова

ЧЛЕНОВЕ НА ИЗСЛЕДОВАТЕЛСКИЯ ЕКИП:

1. Илиана Илиева Йонкова, Доцент, доктор

2. Стефан Цветков Нинов, Главен асистент

3. Николай Петков Василев, докторант

4. Искра Антонова Антонова, биолог

5. Надя Пламенова Николова, студент-дипломант

На проучване за продукция на лигнани бе подложен Linum tauricum интактно растение. След изолиране чрез препаративна HPLC, бе установена структурата на две съединения, използвайки HPLC, UV и 1H NMR.

Създадени бяха калус , Hairy root и суспензионни и култури от Linum tauricum за да се проучи акумулирането на лигнани в тях. В конвенционалните култури бяха идентифицирани двата основни лигнана, деривати на подофилотоксина - 4’-demethyl-6-methoxypodophyllotoxin and 6-methoxypodophyllotoxin (MPTOX) чрез HPLC и UV. Сравнено бе съдържанието им с това в интактното растение. Двете съединения, идентифицирани чрез HPLC, UV и 1H NMR се изолират за първи път от интактното растение. Количественото съдържани в калус културите, растящи на MS хранителна среда с 0,1 mg/l 2,4-D, 0,2 mg/l IAA, 2.0 mg/l kinetin и 1,0 g/l casein бе респективно 0,127 mg/g сухо тегло и 0,516 mg/g сухо тегло.

Бе проведена фармакологичната оценка върху по-интересното в химично отношение ново вещество 4’-demethyl-6-methoxypodophyllotoxin (4’-DM-6-Mptox), изолирано като един от основните лигнани в Linum tauricum Willd. ssp. tauricum. Цитотоксичният ефект бе изпитан чрез MTT при човешки левкимични клетъчни линии HL-60, BV-173 и LAMA-84. Бе проведен допълнително и DNA-фрагментен анализ и NF-kB инхибиране. Бе установено, че 4’-DM-6-Mptox притежава силна цитотоксичност с IC50 стойност няколко пъти по-ниска от референтния стандарт- антинеопластичният агент etoposide.

1. N. Vasilev, G. Momekov, M. Zaharieva, S. Konstantinov, P. Bremner, M. Heinrich and I Ionkova, Cytotoxic activity of a podophyllotoxin-like lignan from Linum tauricum Willd, NEOPLASMA 5, 2005, 1-24 (IF-0,679)

2. Konuklugil B., I. Ionkova, N. Vasil;ev, T. Schmidt, J. Windhövec, E. Fuss, and A. Alfermann, (2005), Lignans from Linum species of sections Sylinum and Linum, Nat. Prod.Letters (in press) (IF-0,527)

Научни прояви

1. K. Danova, I. Ionkova, N. Vasilev Optimization of lignan production of in vitro cultures of Linum tauricum ssp. tauricum (Willd.) Petrova, 53GA Congress, 21-25 Aug, Florence, Italy

2. Надежда Николова, Биосинтез на Арилтетралинови лигнани в българския ендемит Linum tauricum var. tauricum (интактно растение и ин витро култури)

Научна сесия за студенти и млади научни работници, ноември 2004, (София)

3. По тематиката на проекта е защитена дипломна работа във Фармацевтичен факултет от Надежда Николова, участващ в работния колектив.

Научният отчет е приет с ОТЛИЧНА оценка по скалата на Съвета по медицинска наука.

***
ДОГОВОР № 10 / 2004 г.

Изолиране и идентифициране на бензофенони и ацилфлороглуцинолови производни от Hypericum annulatum и in vitro проучвания за противотуморна и клетъчно – протективна активност.

1. Параскев Тодоров Недялков, главен асистент, доктор, Фармацевтичен факултет

2. Димитрина Живкова Желева – Димитрова, маг. фармацевт, Фармацевтичен факултет

3. Цветомира Александрова Цанова, маг. фармацевт, Фармацевтичен факултет

Нов бензофенон О-гликозид неоанулатофенонозид (1) беше изолиран от надземните части на Hypericum annulatum Moris (Guttiferae) и идентифициран като 3`, 5`, 6-трихидрокси-4-метоксибензофенон-2-О-β-D-глюкопиранозид чрез химични и физични методи. Цитопротективните ефекти на новото съединение и на преди това изолираните от същия вид хиперикофенонозид (2), анулатофенон (3), анулатофенонозид (4), ацетиланулатофенонозид (5) и 1,3,7-трихидроксиксантон (6) бяха оценени върху модел на cisplatin - индуцирана клетъчна токсичност при левкемичната клетъчна линия К-562. Данните показват, че бензофенон О-гликозидите 1, 2, 4 и 5 имат значителен цитопротективен ефект спрямо cisplatin-индуцираната токсичност, докато агликоните 3 и 6 намаляват виталността на К-562 клетките и са изключени от по-нататъчни проучвания при използваните модели за цитопротекция. Съединенията 1, 4 и 5 намаляват токсичността на цисплатин върху бъбречните клетки, като е съхранена виталността на около 20% от тях. Съединенията 4 и 5 не повлияват клоногенността на костно-мозъчни клетки, докато 1 и 2 проявявят цитопротективен ефект.

Резултатите от нашите проучвания показват, че някои бензофенон-гликозиди изолирани от Hypericum annulatum проявяват цитопротективен ефект спрямо cisplatin и epirubicine. Изследванията върху механизмите на цитопротекция представлява значителен интерес с оглед тяхното възможно клинично приложение.

НАУЧНИ ПУБЛИКАЦИИ:

1. Nedialkov, P.T. et al. Cytoprotective effects of benzophenones from Hypericum annulatum. 2005 – в подготовка за печат.

1. Nedialkov, P.T. et al. Benzophenone derivatives from Hypericum annulatum and their in vitro antineoplastic and cytoprotective activities. 3 ^rd Conference on Medicinal and Aromatic Plants of Southeast European Countries, Nitra, Slovak Republic, 5 – 8 September 2004, p.81.

***
СПОРАЗУМЕНИЕ № 1/2004 г.

1. Николай Георгиев Ламбов, доц. д-р, катедра “Технология на лекарствата с биофармация”, Фармацевтичен Факултет, МУ-София.

2. Маргарита Христова Караиванова, проф., дмн, катедра “Фармакология и Токсикология”, Фарм. Факултет, МУ – София.

3. Спиро Михайлов Константинов, гл. ас., д-р, катедра “Фармакология и Токсокология”, Фарм. Факултет, МУ – София.

4. Георги Цветанов Момеков, ст. ас., катедра “ Фармакология и Токсикология”, Фармацевтичен Факултет, МУ – София.

5. Деница Богомилова Момекова, ст.ас., катедра “ Технология на лекарствата с Биофармация”, Фарм. Факултет, МУ – София.

Разработени са 50 липозомни състава на базата на SPC, DSPC и pH- чувстителни липозоми на базата на DOPE. Използваният метод за приготвяне на липозомите, позволява получаване на възпроизводими популации от малки униламеларни везикули с размери от 130 – 180 nm, подходящи за интравенозно приложение. Получени са стерично стабилизирани липозоми, чрез използването на хидрофобно модифицирани съполимери на базата на ПЕГ, носещи къси блокове от липидоподобни звена. Наблюдава се известна тенденция, съполимерите, съдържащи повече от едно липидо-миметични звена да осигуряват по-добри морфологични характеристики на везикулите и по-добър интегритет на липозомните мембрани т.е. по-добра колоидна стабилност. Използването на блоковите съполимери, като стерично стабилизиращи агенти са подходящи и за стерично стабилизиране на рН-чувствителни липозоми, тъй като не намаляват значително рН-чувствителността на мембраните. Тази тенденция е запазена дори и при високите концентрации на полимерите. Ефективността на включване в липозомите на подбраните цитостатици бендамусти и даунорубицин не се влияе значително от фосфолипидната композоция. Проучването на цитотоксичните ефекти на свободния и включения бендамустин, показва, че ефектите на енкапсулирания цитостатик значително нарастват при удължаване на инкубацията от 48 на 96 часа. Тези данни показват, че липозомните носители осигуряват забавено освобождаване на включения цитостатик, което е благоприятно особено за бендамустин, с оглед на неговия кратък плазмен полуживот

1. Slaveva D., Rangelov, St., Lambov N., Preparation and Properties of Soybean Phosphatidylcholine Liposomes Sterically Stabilized by Copolymers Bearing Short Blocks of Lipid-mimetic Units., In: Proceedings (CD).

The 3^-rd International Pharmaceutical Congress, Athens, Greece, April 1-3, 2005.

2. Momekova D.,Ranelov St., Lambov N., Effects of copolymers bearing lipid – mimetic units on the aggregate morphology, dimensions and properties of soybean phosphatidylcholine liposomes.

4^ти конгрес по Фармация с международно участие, София, България, 3-5 юни 2005

3. Momekova D., Rangelov St., Lambov N., Amphiphilic copolymers bearing short blocks of lipid-mimetic units for steric stabilizatin of liposomes.

15^th International Symposium on Microencapsulation, september 18-21, 2005, Parma, Italy

Научният отчет е приет с ВИСОКА оценка по скалата на Съвета по медицинска наука.

***
ДОГОВОР № 11 / 2004 г.

1. Митка Константинова Мичева; Доцент, доктор

2. Стефан Димитров Николов; Професор, дфн

3. Весела Бисерова Вичева; Маг. Фармацевт; Ст. асистент

4. Румяна Любомирова Симеонова; Маг. Фармацевт; Ст. асистент

5. Вирджиния Йорданова Цанкова; Маг. Фармацевт; Гл. асистент

6. Анри Анжел Аструг; Маг. Фармацевт; Гл. асистент

7. Илина Николаева Кръстева; Маг. Фармацевт; Гл. асистент

8. Магдалена Спасова Кондева; Маг. Фармацевт; специалист

9. Адрияна Захариева Кръстева; Маг. Фармацевт; докторант

Проследени са ефектите на пречистена сапонинова смес (ПСС), изолирана от Astragalus corniculatus Bieb. върху модели на токсичност: in vivo (парацетамолова и тетрахлорметанова) и in vitro (тетрахлорметанова, тертбутил хидропероксидна). Проследени са и ефектите на ПСС в условия на ензим- и неензим-индуцирана липидна пероксидация, както и в модел на допаминова токсичност в изолирани синаптозоми. За сравняване ефекта на ПСС е използван силимарин, като известен протективен агент от растителен произход.

В резултат на проведените експерименти и получените резултати се установява, че самостоятелно приложена, пречистената сапонинова смес проявява известен цитотоксичен ефект по отношение на контролата, както in vivo, така и in vitro, който е статистически значимо по-слаб в сравнение с цитотоксичния ефект на използваните токсични агенти. приложени самостоятелно.

В условия на токсичност ПСС проявява цитопротективен и антиоксидантен ефект, както in vivo, така и in vitro. В изследванията in vivo ПСС проявява цитопротективни ефекти, които са съизмерими с тези на силимарин. В изследванията in vitro, в условията на CCl₄ и t-BOOH токсичност в изолирани хепатоцити, ПСС проявява протективен ефект, който е по-силно проявен спрямо t-BOOH токсичност. В изолирани микрозоми протективеният ефект на ПСС е съизмерим с този на силимарин, както в условия на неезимна, така и в условия на ензим-индуцирана липидна пероксидация. Най-изявен протективен ефект ПСС проявява в условия на допаминова токсичност в изолирани синаптозоми. В условията на токсичност in vivo/in vitro, се отчита ефект на ПСС, свързан с протекция на жизнеността и количеството на редуциран глутатион, понижаване активността на LDH и количеството на МDA, холестерол и трансаминази.

1. M. Mitcheva¹, M. Kondeva¹, V Vitcheva¹, I. Krasteva², St. Nikolov². Effect of purified saponins’ mixture from Astragalus corniculatus on toxicity models in isolated rat hepatocytes. Acta Pharmacetica, in press

1. Kondeva M., Mitcheva M., Vitcheva V. Krasteva I., Nikolov S. Effect of the saponin mixture from Astragalus corniculatus on cell viability in fresh isolated rat hepatocytes. IPORSIP – 2004, Sept 20-22, Istambul, Turkey, Abstract book, p 73

2. Kondeva M., Mitcheva M., Krasteva I., Nikolov S. Protective effects of Astragalus corniculatus saponins against carbontetrachloride-induced hepatotoxicity in vitro. 4^th Congress of Pharmacy with International Participation, Sofia, 3-5 June, Pharmacia suppl. P 53-54

3. Simeonova R., Mitcheva M., Kondeva M., Dikov T., Krasteva I., Nikolov S. In vivo protective effect of Astragalus corniculatus saponins against carbontetrachloride-induced rat hepatotoxicity. 4^th Congress of Pharmacy with International Participation, Sofia, 3-5 June, Pharmacia suppl. p 54

***
ДОГОВОР № 15 / 2004 г.