Биосинтеза на РНК
След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели:
А. Знания
1. Да посочат принципите, на които се основава синтезата на РНК;
2. Да изброят ензимите, необходими за синтезата на РНК в прокариоти и еукариоти;
3. Да изброят етапите, през които минава синтезата на РНК;
4. Да дефинират какво представляват промоторите, цис-действащи последователности в ДНК и транс-действащи фактори, стартова точка;
5. Да опишат структурата и функциите на промоторите при прокариоти;
6. Да опишат структурата и функциите на промоторите при еукариоти;
7. Да дефинират какво представляват транскрипционните фактори, силансерите и енхансерите;
Б. Разбирания
1. Да обяснят разликите между РНК полимеразите в прокариоти и еукариоти;
2. Да обяснят разликите между РНК полимерази І, ІІ и ІІІ в еукариоти;
3. Да обяснят образуването на преинициационния и инициационния комплекс в еукариоти;
4. Да обяснят как протича елонгирането на РНК;
5. Да обяснят как протича терминирането на РНК синтезата;
6. Да опишат следсинтетичната обработка на РНК-транскриптите в прокариоти;
7. Да опишат следсинтетичната обработка на рРНК-транскриптите и тРНК-транскриптите в еукариоти;
8. Да опишат следсинтетичната обработка на иРНК-транскриптите в еукариоти;
9. Да обяснят посттранскрипционното редактиране на иРНК
В. Умения да приложат познанията си върху този раздел, за да:
1. преценят кои инхибитори на синтезата на РНК могат да се използват като антибиотици;
2. обяснят причините за смъртоносното действие на токсина -аманитин от отровната гъба червена мухоморка;
3. обяснят механизма на някои заболявания като -таласемии, чуплива X-хромозома и др.
13.1 Резюме
Транскрипцията протича в три етапа: иницииране, елонгиране и терминиране. Като матрица се използва едноверижен участък от ДНК. Синтезираната РНК е комплементарна на участък от матричната верига на ДНК. Синтезата на РНК върви в посока от 5' към 3'-края. Катализира се от ензими, наречени ДНК зависими РНК полимерази.
РНК полимеразата в прокариоти за разпознаване на промотора се нуждае от специална субединица s, която не е необходима за елонгирането. В еукариоти има три типа РНК-полимерази I, II и III за синтеза на рРНК, иРНК и тРНК, съответно.
В прокариотните промотори има два участъка, разположени най-често преди стартовото място, които определят верността на транскрипцията. Еукариотните промотори са по-сложни. Промоторите, разпознавани от РНК полимераза II съдържат два класа участъци, осигуряващи основната и регулираната експресия. В голям брой случаи основната експресия зависи от разпознаването и свързването на РНК полимераза към олигонуклеотидни блокове в промотора, означавани като ТАТА- и ЦААТ- блокове. Свързването към първия осигурява верността на транскрипцията, а към втория - нейната честота. Регулираната експресия зависи от втория клас регулаторни участъци, съдържащи други олигонуклеотидни блокове, с различна ориентация и различно отдалечени преди или след стартовата точка, наречени енхансери и силансери. Тe медиират ефекта на различни сигнали (хормони, топлинен шок, тежки метали и др.).
За всеки от етапите на транскрипцията освен РНК полимеразата са необходими и други ензими или белтъчни фактори.
Следсинтетичната обработка (посттранскипционно зреене) на различните първични РНК-транскрипти е също сложен процес. В прокариоти и еукариоти различните рРНК се получават от общ по-голям транскрипт, а всеки тРНК-транскрипт съдържа от 2 до 5 различни тРНК. В прокариоти иРНК не се обработват, а направо се използват като матрици за белтъчна биосинтеза. В еукариоти към първоначалния иРНК-транскрипт се добавя т.н. "шапка" и "опашка", отделят се интроните и се съединяват екзоните. Този процес се означава като сплайсинг (снаждане). Чрез алтернативен сплайсинг могат да се получат различни иРНК. Възможно е и посттранскрипционно редактиране на иРНК. То е причина за различната експресия на гена за аполипопротеин В в черен дроб и в черва.
Инхибиторите на РНК синтезата се свързват с ДНК или към РНК полимеразата. Тези, които инхибират бактериална РНК полимераза, но не засягат синтезата на РНК в еукариоти, се използват като антибиотици. Смъртоносният ефект на токсини от мухоморка се обяснява с инхибиране на еукариотната РНК полимераза II. С грешки в сплайсинга се обясняват таласемиите, при което не се образува нормална или -верига в хемоглобин. Разгледано е и заболяването "Чуплива Х хромозома".
13.2 Обща характеристика
Синтезата на РНК протича в два етапа - транскрипция (презаписване) на ДНК матрицата и следсинтетична обработка на първичните транскрипти (посттранскрипционно зреене). Транскрипцията протича в три етапа: иницииране (начален етап), елонгиране (удължаване на веригата), терминиране (завършване).
Като матрица за синтеза на определена РНК се използва едноверижен участък от ДНК, много малък в сравнение с целия геном. Новосинтезираната РНК е комплементарна на матричната верига на ДНК и съвпада с кодиращата верига на ДНК (фиг. 13-1), т.е. Т, Г, Ц от ДНК определят включването на А, Ц, Г, съответно. А от ДНК определя включване на У в РНК. Дадена верига от ДНК може да бъде матрична за едни гени, а кодираща за други.
Фиг. 13-1. Комплементарност между матричната верига на ДНК и първичния иРНК транскрипт.
Информацията в матричната верига на ДНК се чете в посока от 3' към 5'-края. Синтезата на РНК се извършва в посока от 5' към 3'-края.
Субстрати за синтезата са рибонуклеозидтрифосфатите УТФ, ЦТФ, АТФ, ГТФ. Енергия за изграждане на фосфодиестерните връзки се осигурява при разграждане на макроергичната връзка между и -фосфатните групи в субстратите.
13.3 Ензими
Ензимите, които катализират синтезата на РНК върху ДНК матрица се наричат ДНК-зависими РНК полимерази. 3'-5'-фосфодиестерната връзка се образува като 3'-ОН група на последния нуклеотид във веригата атакува алфа-фосфатната група на следващия присъединяван нуклеозид трифосфат, съпроводено с отделяне на пирофосфат.
Смяташе се, че за разлика от ДНК полимеразите, РНК полимеразите не притежават допълнителни ензимни активности. Но при някои РНК полимерази е установена 3'-5'-екзонуклеазна активност.
13.3.1 РНК полимераза в прокариоти
Escherihia coli има една РНК полимераза с м.т. 350 000, сложно устроена. По време на елонгирането се състои от пет субединици: , , , ', [1]. За разпознаване на промотора и за правилно иницииране ензимът се нуждае от допълнителна (сигма) субединица или фактор (м. т. 80 000). Когато тази субединица е свързана към ензима, той се означава като холоензим (фиг. 13-2). В бактериите има много фактори. Всеки от тях променя способността на РНК полимеразата да разпознава различни гени.
|
Фиг. 13-2. Структура и действие на РНК полимераза в E. coli.
|
1 - Свързване на -фактор към РНК полимераза, за да се получи холоензим;
2 - чрез -фактора холоензимът разпознава определен промотор в ДНК;
3 - иницииране на РНК синтезата. РНК полимеразата катализира последователното свързване на около 10 нуклеотиди в посока от 5' към 3' края;
4- отделяне на - фактора и елонгиране на веригата;
5 - терминиране на биосинтезата на РНК и освобождаване на РНК-транскрипта от ензима, който може да свърже нов -фактор и да започне нов синтезен цикъл.
13.3.2 РНК полимерази в еукариоти
В еукариоти има три ядрени РНК полимерази (РНКП) (500 - 600 kDa) (табл. 13-1) и една митохондриална. Ядрените ензими се означават с римски цифри I, II и III. Всички те имат общ механизъм на действие, но разпознават различни промотори и образуват различни РНК. Полимераза I синтезира повечето от рРНК, полимераза II - иРНК, а полимераза III образува малки РНК - тРНК и 5S рРНК, съответно. Различават се по чувствителността си към отровата на гъбата червена мухоморка.
РНК полимераза II се състои от 14 субединици. Двете най-големи (около 200 kDa) съответстват на бактериалните '. В карбоксилния им край има участък с многократно повтарящ се пептид от 7 остатъка: Тир-Сер-Про-Тре-Сер-Про-Сер. Този участък е субстрат за няколко кинази. Ензимът се активира при фосфорилиране в Сер и Тре остатъци и се инактивира при дефосфорилиране. Този участък е и свързващо място за медиаторни (супресорни) белтъци (Srb). При свързването на тези Srb белтъци към РНК полимераза II, се оформя холоензимът.
Табл. 13-1. Разлики между ядрени ДНК-зависими РНК полимерази в еукариоти.
Вид полимераза
|
І
|
ІІ
|
ІІІ
|
Чувствителност към
-аманитин
|
няма
|
много чувствителна към ниски концентрации
|
чувствителна към високи концентрации
|
Продукт
|
повечето рРНК
|
иРНК
|
тРНК и 5S рРНК
|
13.4 Иницииране на транскрипцията
13.4.1 Представа за промотори
РНК полимеразата не изисква зародиш. Ензимът трябва да разпознае стартовата точка в матричната верига за определен ген. Сложността на задачата проличава от следния пример. В Е. coli има 2000 стартови точки от общо 4 млн bp (двойки бази). В човек има около 100 000 стартови точки, разпръснати сред общо 3 х 109 bp. Затова гените, освен кодиращи участъци имат и регулаторни участъци. Те служат като ориентири или сигнали, които ензимът разпознава в ДНК и които го ориентират откъде да започне. Тези специфични участъци върху матричната верига на ДНК се наричат промотори. В промотора има олигонуклеотидни последователности, означавани като блокове (или рамки), определящи стартовата точка и честотата на транскрипция за даден ген. Тъй като са разположени върху същата ДНК молекула и близо до гена, който те регулират, блоковете се означават като цис-действащи. Белтъци, които се свързват към тези блокове и улесняват или пречат на свързване на РНК полимеразата, се означават като транс-действащи, защото са кодирани от други гени, различни от тези, които те регулират.
Общоприети са следните термини и означения. Регулаторните консенсусни (т.е. най-често срещани) олигонуклеотидни последователности в гена се описват в посока 5'->3' върху кодиращата верига, въпреки че функционират само в двойноверижна ДНК. Позиция 1 (стартова точка) на гена е базата, еквивалентна с първата база в 5'-края на първоначалния РНК-транскрипт. Нуклеотидите, предшестващи първата база, се номерират отрицателно. Нуклеотидите след първата база се номерират положително.
13.4.2 Структура и функция на промоторите в прокариоти
Прокариотните промотори са сравнително къси участъци с около 40 bp, разстояние, съпоставимо с големината на РНК полимеразата. Холоензимът при свързването си покрива изцяло промотора. В промотора има два къси консервативни блока преди стартовата точка, разпознавани от -субединицата на РНК полимеразата, чрез което се осигурява верността на транскрипция (фиг. 13-3-1).
1) ТТГАЦА-блок, наричан още блок на Yanofsky или -35 секвенция, тъй като отстои на около 35 бази преди стартовата точка.
2) ТАТА-блок, наричан още блок на Pribnow или -10 секвенция, тъй като отстои на около 10 бази преди стартовата точка. Последователността в този участък е идентична или близка до следната: ТАТААТ.
Фиг. 13-3-1. Структура на промоторите в прокариотна ДНК.
Показани са консервативни участъци в промоторите, разпознавани от -субединицата на РНК полимеразата, за да се осигури вярност на транскрипцията..
При свързване на холоензима към ТГТТГАЦА-блок се получава т.н. затворен комплекс (фиг. 13-3-2), тъй като все още няма разделяне на двете вериги в ДНК. Свързването на ензима и към ТАТА-блок улеснява разединяването на веригите и достъпа на ензима до матричната верига.
Фиг. 13-3-2. Затворен транскрипционен комплекс в прокариотни клетки.
Затвореният комплекс се превръща в отворен комплекс (фиг. 13-2-3). Разтварянето на веригите в ТАТА-блок е улеснено от липсата на Г и Ц в този участък, което определя по-ниска точка на топене на ДНК. След добавянето на около 10 нуклеотиди, факторът обикновено (но не винаги) се отделя от РНК полимеразата и ензимът продължава елонгирането.
Фиг. 13-3-3. Отворен транскрипционен комплекс в прокариотни клетки.
13.4.3 Структура и функции на промоторите в еукариоти
Еукариотните промотори са по-сложни. Промоторите за РНК полимераза I и II, също като промотора на прокариотната РНК полимераза, са разположени преди стартовата точка. Промоторите за РНК полимераза III са уникални с това, че обикновено са след стартовата точка, в рамките на кодиращия участък от гена. Известни са две строго консервативни секвенции А и В в интрагенния промотор, които кодират участъци в областта на D и ТЦ бримки.
Промоторите, разпознавани от РНК полимераза II, съдържат два класа участъци (фиг. 13-4):
1) Участъци, осигуряващи основната експресия.
В голям брой случаи основната експресия зависи от разпознаването и свързването на РНК полимераза към следните олигонуклеотидни блокове в промотора:
а) проксимален ТАТА-блок, чието разпознаване осигурява верността на транскрипцията. Винаги има ориентация 5'-3'. Обикновено отстои на 15-30 bp преди стартовата точка.
В малък брой гени вместо ТАТА-блок има друг блок със същата роля, означаван като Inr (iniciator), който съдържа три нуклеотида преди и пет нуклеотида след стартовото място.
б) ЦААТ-блок (или други подобни, означавани Sp1, NF1, Ap1 и др), по-отдалечен от старта в минусова посока и определящ честотата на транскрипция. Тези участъци работят най-добре, когато са ориентирани 5'-3', но могат да имат и обратна ориентация.
2) Участъци, осигуряващи регулираната експресия
Регулираната експресия зависи от втори клас регулаторни участъци, съдържащи други олигонуклеотидни блокове, с различна ориентация и различно отдалечени преди или след стартовата точка, наречени енхансери и силансери. Тe медиират ефекта на различни сигнали (хормони, топлинен шок, тежки метали и др.).
Фиг. 13-4. Примерна структура на промотор за иРНК в еукариотни клетки.
Промоторът се състои от два класа участъци:
1) Участъци, отговорни за основната експресия, съдържащи ТАТА- и ЦААТ-блокове. Разпознаването на ТАТА-блока осигурява верността на транскрипцията. Разпознаването на ЦААТ-блока определя честотата на транскрипция.
2) Участъци, осигуряващи регулираната експресия, съдържащи други олигонуклеотидни блокове (енхансери, силансери и др.) с различна ориентация и различно отдалечени преди или след стартовата точка, медииращи ефекта на хормони, топлинен шок, тежки метали и др. За тези многобройни и специфични блокове се използва и названието "респонсни елементи" (response element"), напр. СХ-РЕ - респонсен елемент за стероидни хормони, цАМФ-РЕ - респонсен елемент за цАМФ и пр.
13.4.4 Транскрипционен комплекс в еукариоти
За осигуряване на безпогрешна и регулируема транскрипция в еукариоти РНК полимеразите се нуждаят от голям брой белтъци (около 50 на брой). Без тях РНК полимерази не разпознават промоторите. Едни от белтъците улесняват свързването към определен промотор, а други са необходими за регулиране скоростта на иницииране на транскрипцията.
Основният комплекс (фиг. 13-5) се образува при свързване на РНК полимераза с промотора посредством белтъци, означавани като транскрипционни фактори ТF.
Фиг. 13-5. Структура на основния транскрипционен комплекс в еукариоти.
Основният комплекс се образува при свързване на РНК полимераза с промотора посредством белтъци, означавани като транскрипционни фактори ТFII(D, B, A, F, H, E). Единствено ТFII D контактува директно с ДНК в ТАТА-участъка. TFII D се състои от ТАТА-свързващ белтък (ТВР) и 8-10 различни ТВР-асоциирани фактори (ТАFs, наричани още коактиватори, тъй като те подпомагат други белтъци активатори).
Известни са следните ТF за РНК полимераза II (TFII):
1) TFII D - състои се от ТАТА-свързващ белтък (ТВР) и 8-10 различни ТВР-асоциирани фактори (ТАFs, наричани още коактиватори, тъй като те подпомагат други белтъци активатори). TFII D е единственият ТFII, контактуващ директно с ДНК в ТАТА-участъка.
2) други транскрипционни фактори по реда на тяхното добавяне:
- TFII В (стабилизира комплекса, който се ориентира по-прецизно в иниициращото място)
- TFII F (съответства структурно и функционално на фактора в прокариоти).
- TFII А (стабилизира комплекса и позволява взаимодействие с активатори).
- TFII Е (усилва киназната активност на TFII Н.
- TFII Н (има киназна активност).
С добавянето на тези TFII се оформя основният, наричан още преинициационен комплекс (PIC). Размерите му са такива, че той обхваща или покрива около 60 bp (от -30 до +30 спрямо стартовата точка. Този комплекс осъществява основна транскрипция.
13.4.5 Енхансери и силансери в еукариотна ДНК
Тук спадат участъци, които медиират ефекта на различни сигнали (хормони, топлинен шок, тежки метали и други вещества). Всички тези участъци поради отдалечеността си не контактуват директно с основния комплекс. Те упражняват своя ефект чрез свързване на белтъци (транскрипционни трансактиватори), които пък се свързват с коактиваторите от основния комплекс и увеличават честотата на транскрипция. Сложните взаимодействия на отдалечените контролиращи елементи с основния комплекс, опосредени чрез транскрипционните трансактиватори и коактиватори са възможни поради възникване на огъвания в ДНК.
Има два модела за образуване на активен инициационен комплекс (фиг. 13-6):
Според единия модел предварително се образува основният комплекс върху ТАТА-участъка в промотора и след това към TAF коактиваторите се свързват транскрипционни трансактиватори, свързани от друга страна с отдалечени елементи в ДНК, напр. ЦААТ. Огъване в ДНК осигурява тези взаимодействия (фиг. 13-6-1).
Според другия модел транскрипционните трансактиватори се свързват с отдалечени елементи в ДНК, напр. ЦААТ, и взаимодействат с кофактори от предварително оформен ТВР-основен комплекс, несвързан с ДНК. Новополученият комплекс се прикрепя към ДНК в ТАТА-участъка (фиг. 13-6-2).
|
Фиг. 13-6. Два модела за образуване на активен инициационен комплекс в еукариоти.
|
1 - Предварително образуване на основен комплекс върху ТАТА-участък в промотора и последващо взаимодействие на трансактиватори, свързани с отдалечения ЦААТ елемент към TAF коактиватори от основния комплекс. Огъването на ДНК прави възможно взаимодействието на отдалечени елементи;
2 - Транскрипционните трансактиватори се свързват с отдалечени елементи в ДНК, напр. ЦААТ, и взаимодействат с кофактори от предварително оформен ТВР-основен комплекс, несвързан с ДНК. Новополученият комплекс се прикрепя към ДНК в ТАТА-участъка.
13.5 Елонгиране
Елонгирането се свежда до последователно присъединяване на рибонуклеотиди в посока от 5' към 3'-края, комплементарни на тези от ДНК матрицата (фиг. 13-7). Двойната спирала на ДНК веригата се развива и разтваря на около 20 bp непосредствено преди елонгационния комплекс. Това предполага, че полимеразата действа съвместно с разсукващ ензим. След отминаването на РНК полимеразата, ДНК се затваря. Топоизомераза, следваща полимеразата, предпазва от суперспирализиране. Една и съща матрична верига на даден ген едновременно в различни негови участъци може да се транскрибира от повече от една полимеразна молекула.
Елонгирането продължава до достигане на сигнал за терминиране.
Фиг. 13-7. Елонгиране на веригата при транскрипция на РНК. Двете вериги на ДНК са разединени. Информацията се чете от матричната верига на ДНК в посока 3' към 5'-края. РНК веригата нараства в посока 5' към 3'-края. РНК е комплементарна и антипаралелна на матричната верига, но идентична с кодиращата верига на ДНК с тази разлика, че срещу А от матрицата в РНК се включва У. РНК полимеразата катализира образуването на 3', 5'-фосфодиестерна връзка чрез прикрепване на 5'-ОН група на идващия нуклеотид към 3'-ОН група на нарастващата верига с освобождаване на пирофосфат.
13.6 Терминиране
В прокариоти има два начина за прекратяване на транскрипцията: зависимо от белтъчния -фактор терминиране и независимо от -фактор терминиране.
1) Зависимо от белтъчния -фактор терминиране
Сигналите за терминиране включват около 80 нуклеотиди преди мястото за спиране. Характерно е наличие на Ц през 12 нуклеотиди.-Факторът е АТФ-зависима ДНК-РНК хеликаза, която разделя ДНК-РНК комплекса. Новополучената РНК се отделя. РНК полимеразата се отделя от ДНК матрицата и може отново да присъедини фактор за започване на нов транскрипционен цикъл.
2) Независимо от белтъчния -фактор терминиране
Сигналите за терминиране се разпознават от РНК полимеразата. Това са консервативни последователности (около 40 bp) в ДНК, съдържащи прекъснат обърнат повтор. Този повтор е богат на Г и Ц бази и предхожда участък, богат на АТ двойки. Първичният транскрипт има структура, позволяваща образуване на фуркетна бримка с по-здрави водородни връзки между Г и Ц. След тази бримка следва участък, богат на урацил. Водородните връзки между базите А в ДНК и У в РНК по-лесно се разкъсват и това води до отделяне на транскрипта от ДНК.
В еукариоти РНК полимераза I прекратява транскрипцията с помощта на фактор, подобен на фактора. Не се знае как полимераза III прекратява транскипцията. Известно е, че РНК полимераза II преминава 3'-края на транскрипта. Повечето гени се транскрибират няколко хиляди bp след точката на полиаденилиране. След това РНК ендонуклеаза разкъсва първичния транскрипт в позиция 15 бази преди консенсусна последователност ААУАААА, смятана като сигнал за разкъсване.
13.7 Зреене (следсинтетична обработка) на РНК транскриптите
Зреенето на РНК предшествениците в еукариоти за всички видове РНК протича предимно в ядрото и е по-сложен процес отколкото при прокариоти.
13.7.1 Зреене на РНК транскрипти в прокариоти
В прокариоти, където липсва ядро, получените иРНК не се обработват. Те се използват като матрици за белтъчна биосинтеза дори преди да е завършена транскрипцията. Транскрипцията и транслацията в прокариоти не са пространствено разделени.
Транскриптите (предшествениците) на рРНК и тРНК се обработват до получаване на зрели РНК. Рибозомните РНК 16S рРНК, 23S рРНК, 5S рРНК и някои тРНК се получават от общ 30S предшественик, като ендонуклеази изрязват ненужните разделящи (спейсерни) последователности между тях. Останалите тРНК се получават от други тРНК транскрипти, съдържащи от 2 до 7 тРНК.
13.7.2 Зреене на рРНК транскрипти в еукариоти
В еукариоти рРНК се обработват по подобен начин, както в прокариоти.
Три от рРНК (18S рРНК, 28S рРНК и 5.8S рРНК) се получават от общ 45S предшественик (фиг. 13-8). Гените за рРНК са в ядърцето. Във всяка клетка има стотици техни копия. Този голям брой от еднакви гени е необходим, за да се синтезират достатъчно рРНК от всеки вид за образуване на 107 рибозоми във всяка новополучена клетка. Полученият 45S предшественик при отделянето си от ДНК се свързва с белтъци и образува рибонуклеопротеинова частица. Към нея се присъединява и 5S рРНК, получена извън ядърцето от друг ген. Последователностите в 45S предшественика, които ще се превърнат в зрели рРНК, се метилират преди изрязване на ненужните разделящи участъци със специфични ендонуклеази и екзонуклеази. Под тяхното действие се стига до 28S, 5.8S и 18S рРНК.
5.8S РНК се свързва комплементарно и антипаралелно с участък от 28 S рРНК. Комплексът от 28S рРНК, 5,8S рРНК и 5S рРНК с около 50 рибозомни белтъци оформя голямата субединица на рибозомата (60S). Комплексът от 18S рРНК с около 40 рибозомни белтъци оформя малката субединица на рибозомата (40S).
|
Фиг. 13-8. Следсинтетична обработка на рРНК в ядърцето и изнасяне на рибонуклеопротеиновите комплекси, които в цитоплазмата образуват двете субединици (40S и 60S на рибозомата (80S).
|
13.7.3 Зреене на тРНК транскрипти в еукариоти
Всеки тРНК предшественик съдържа от 2 до 7 тРНК. Специфични рибонуклеази изрязват отделни тРНК предшественици с дължина около 100 нуклеотиди от общия транскрипт, които оформят структура от типа "детелинов лист" (вж глава 3) и биват скъсявани в двата края от екзонуклеази. Някои предшественици съдържат един интрон (10-40 bp) близо до антикодонната бримка. Това налага изрязването му чрез ендонуклеази и правилното съединяване на веригата в областта на антикодонната бримка чрез РНК лигаза. Някои тРНК не съдържат ЦЦА-триплет в 3'-края и той се добавя от тРНК нуклеотидил трансфераза. Част от базите се модифицират, което е необходимо за придобиване на уникална конформация, необходима за тяхната функция. Модифицирането включва метилиране, редукция, дезаминиране и преместване на гликозидни връзки за превръщане на уридин в псевдоуридин.
13.7.4 Зреене на иРНК предшественици в еукариоти
Еукариотните иРНК предшественици са с много по-високо молекулно тегло от зрелите иРНК. Те претърпяват следните операции в процеса на зреене в ядрото:
13.7.4.1 Добавяне на т.н. шапка (вж глава 3)
Някои шапки се състоят само от от 7-метилгуанозин трифосфат, добавен към 5'-края на предшественика чрез 5'-5'-трифосфатна връзка, други имат и допълнителна 2'-метилова група в рибозата на първия нуклеотид в предшественика или още една такава група в рибозата на втория нуклеотид. Шапката е необходима за иницииране на белтъчната биосинтеза и защита на 5'-края на иРНК от 5'-->3'-екзонуклеази.
13.7.4.2 Добавяне на полиаденилова "опашка" в 3'-края (полиА)
Тези "опашки" съдържат 200-300 аденилови нуклеотиди, свързани чрез фосфодиестерни връзки. Предполага се, че "опашката" защитава 3'-края на иРНК от 3'-->5'-екзонуклеази и увеличава стабилността на иРНК. В цитоплазмата опашката бавно се скъсява. Към опашката е прикрепен 78 kDa белтък. Когато опашката намалее дотолкова, че този белтък не може да се задържа повече върху нея, той се отделя и тогава опашката и иРНК се разграждат бързо.
13.7.4.3 Отстраняване на междинни некодиращи последователности (интрони) в гените (сплайсинг)
В иРНК-предшествениците има екзони (кодиращи последователности за белтъци), които са разпръснати и разделени от интрони (междинни некодиращи последователности). Думата екзон е съкращение от израза "expressed portion of the gene". Отстраняването на интроните и прецизното съединяване на екзоните се нарича сплайсинг (splicing = снаждане) (фиг. 13-9).
Фиг. 13-9. Принцип на механизма за следсинтетична обработка на предшествениците на иРНК чрез сплайсинг (отстраняване на интроните и снаждане на екзоните).
Различните гени съдържат различен брой интрони - напр. само 2 в -глобиновия ген, но 50 и повече в други белтъци. Известни са консервативни последователности на границата между екзоните и интроните в иРНК предшествениците - обикновено AGGU. Почти всички известни интрони започват с 5'-ГУ и завършват с 3'-АГ (фиг. 13-10).
Освен това в интрона има друг консервативен участък, наречен разклоняващо място. То е разположено 20-40 нуклеотида преди 3'-края на интрона. В дрожди този участък съдържа УАЦУААЦ, а в бозайници ПиНПиПиПуAПи, където Пи е пиримидинов, Пу - пуринов и Н - кой да е нуклеотид (фиг. 13-10).
Фиг. 13-10. Консервативни последователности на границите между екзони и интрон и в разклоняващото място в интрона ПиНПиПиПуAПи в бозайници, където Пи е пиримидинов, Пу - пуринов и Н - кой да е нуклеотид.
Структурата, която осигурява снаждане на интроните с голяма точност, се нарича сплайсозома (50-60S). Тя съдържа предшественика на иРНК и 5 малки ядрени рибонуклеопротеини (snRNР, наричани още "snurps") U1, U2, U5, U4-U6. Тези "snurps" съдържат над 50 различни белтъци, а буквата U идва от това, че малките ядрени РНК в тях са богати на урацил. АТФ доставя енергия за точното снаждане.
Тези малки ядрени рибонуклеопротеини действат като рибозими - разпознават консервативните последователности в интроните, срязват последователно 5'-края и 3'-края на интрона и сближават екзоните за безпогрешно снаждане (фиг. 13-11).
В този сложен процес U6 действа като централен организатор и молекулярен посредник. Чрез комплементарни взаимодействия U1 се свързва към ГУ в 5'-края на интрона, а U2 в разклоняващото място. U5 благоприятства сближаването на 5'-края, разклоняващото място и 3'-края на интрона, което води до огъване на интрона. U4 се отделя. Предполага се, че двете скъсвания в 5'-края и 3'-края на интрона се катализират от комплекса U2-U6.
Първо се срязва фосфодиестерната връзка между екзон 1 и интрона. Освобождават се 3'-OH група на екзон 1 и 5'-ОН на интрона. Последната образува необичайна 2'-5'-връзка с А в разклоняващото място, огъвайки интрона като ласо. 3'-ОН група на екзон 1 атакува и разкъсва връзката между интрона и екзон 2, след което екзон 1 и екзон 2 се съединяват. Отделеният интрон се разгражда.
Ролята на U6 като централен организатор личи от факта, че дрожди с дефект във U6 са нежизнеспособни.
|
Фиг. 13-11. Следсинтетична обработка на предшественици на иРНК (сплайсинг).
|
13.7.5 Посттранскрипционно редактиране на иРНК
Пример за промяна в секвенцията на иРНК след приключване на транскрицията дават аполипопротеини В100 (интегрален белтък в ЛПМНП) и В48 в хиломикроните. АпоВ100 (4536 аминокиселинни остатъка) се синтезира в черния дроб, като генът се експресира 100 %. Същата иРНК се използва в червата, но под действие на цитидин дезаминаза триплетът ЦАА (кодиращ Глн) се превръща в УАА (стоп сигнал) и се получава верига, дълга 48 % от тази в черния дроб.
13.8 Приложение на познанията върху синтеза на РНК в медицината
13.8.1 Инхибитори на РНК синтезата - антибиотици и токсини
Значението на РНК полимераза за живота се демонстрира от последствията, които се проявяват при нейното инхибиране от антибиотици или токсини .
Инхибиторите на РНК синтезата са вещества, които се свързват с ДНК или към РНК полимераза. Тези от тях, които инхибират бактериална РНК полимераза, но не засягат синтезата на РНК в еукариоти, се използват като антибиотици.
Актиномицин D има феноксазинов пръстен, който се вмъква между базите в ДНК и пречи както на репликацията (фиг. 12-16), така и на транскрипцията. Твърде токсичен е за клинична употреба, но се използва експериментално за изучаване на РНК синтезата.
Рифамицин В и рифампицин (фиг. 13-12) се свързват към бактериална РНК полимераза и пречат на иницииране на транскрипцията на РНК, но не спира елонгирането на вече започнати вериги. Особено важно, е че рифампицин, изолиран от Streptomyces, инхибира РНК полимераза от Mycobacterium tuberculosis, който не е чувствителен към голям брой други често използвани антибиотици [2]. Поради различията между бактериална и човешка РНК полимераза този антибиотик няма висока токсичност за човека. Наред с антиметаболита ниазид, рифампицинът допринася за снижаване на смъртността от туберкулоза в развитите страни. Все още обаче в много страни има ендемични огнища. Особено лесно податливи на тази инфекция са болни от СПИН.
Стрептолидигин също се свързва към бактериална РНК полимераза, но инхибира елонгирането на РНК вериги.
Токсинът -аманитин от смъртоносно отровната гъба червена мухоморка (Amanita phalloides) инхибира РНК полимерази II и III от бозайници (вж табл. 13-1) и причинява необратими увреждания на черния дроб и бъбреците [3]. Отравянето протича в два етапа: първоначално има само относително меки гастро-интестинални симптоми. След 48 часа се проявява пълна чернодробна недостатъчност, тъй като важни РНК и кодирани от тях белтъци, се разграждат, а нови не се синтезират.
|
Фиг. 13-12. Структура на рифамицин В и рифампин, инхибитори на синтезата на РНК.
|
13.8.2 Алтернативен сплайсинг на иРНК при -таласемии
В различни тъкани или в различни периоди на развитието сплайсингът може да се извърши по различен начин (алтернативен сплайсинг) и да се получат различни иРНК. Това е един от начините за регулация на генната експресия в клетката. Участието на голям брой белтъци и мяРНК в този процес и неговата многостъпалност позволяват промяна в структурата на РНК. С грешки в сплайсинга се обяснява -таласемия, при която не се образуват нормални -вериги в хемоглобин [4]. Промяна в нуклеотида Г в А на границата между екзон и интрон не позволява отстраняването на интрона и обърква рамката на четене на иРНК при белтъчната синтеза.
13.8.3 Чуплива Х-хромозома
Заболяването "чуплива Х-хромозома", с честота 1/1250 при мъже и 1/200 при жени, се характеризира с умствено изоставане [5, 6]. Неврологичните симптоми са следствие от инактивиране на гена FMR1, разположен в Х-хромозомата. В 5'-нетранскрибиращия се край на този ген нормално има от около 30 до 200 повтори ЦГГ. В пациенти с това заболяване повторите са много повече - 200 до хиляди, като броят се увеличава от поколение на поколение.
Наличието на този висок брой повтори индуцира метилиране на ДНК в целия промотор на гена FMR1, а метилираната ДНК е транскрипционно неактивна. Не се синтезира иРНК за FMR1-белтъка. Отсъствието на този белтък е причина за патологичните прояви. FMR1-белтъкът се намира нормално в цитоплазмата на всички тъкани на плода и по-късно, в мозъка му. Смята се, че това е РНК-свързващ белтък, който помага в транслацията на специфични белтъци по време на развитието.
Сподели с приятели: |