Публикации в научни списания

Публикации в научни списания

5. Danova S., Petrov K., Pavlov P., Petrova P. (2005) “Isolation and characterization of Lactobacillus strains involved in koumiss fermentation” International Journal of Dairy Technology, vol. 58 (2), 100-105.

Светла Данова, Калоян Петров, Пламен Павлов, Пенка Петрова

Процесът на млечнокиселата ферментация, причинена от кумисните лактобацили е по-бърз в сравнение с останалите. За 9 – 13 часа, в зависимост от изследвания щам, между 47% и 79% от глюкозата се превръща в млечна киселина. Всички щамове са устойчиви на ниско рН. Три от изолатите бяха устойчиви и на продължително съхранение – във ферментирало мляко – показаха добра виталност след 3 седмици съхранение при 4°С.

6. 
   Petrova P., Gouliamova D. (2006) Rapid screening of plasmid-encoded small hsp-genes in Streptococcus thermophilus, Current Microbiology, vol. 53, 422-427.
   

В настоящата работа е представен нов бърз метод за откриване на гени, кодиращи малки термошокови протеини (shsp). Чрез подход, базиран на PCR, единични колонии от 49 щама Streptococcus thermophilus – индустриални и домашни стартерни култури бяха изследвани за наличието на термошокови гени.

Пет от щамовете съдържаха плазмидно-кодирани shsp. Анализът на техните секвенции показа, че тези гени са консервативни и при сравнение между тях бяха открити едва няколко различни нуклеотида.

Всички новоизолирани плазмиди принадлежат към pC194-семейството плазмиди, реплициращи се по механизма на „търкалящото се колело” – RCR.

Бе направен изводa, че най-вероятно shsp гените винаги се предават заедно с pC194-репликативния район. Бе изследвана степента на преживяемост на плазмидни и безплазмидни щамове S. thermophilus в условия на температурен шок.

7. Petrova P., Petrov K., Stoyancheva G. (2007) “Probiotic properties of Bulgarian vaginal Lactobacillus isolates”, Comptes Rendus de l'Academie Bulgare des Sciences, vol. 60 (8), 873-880.

“Пробиотични свойства на български вагинални изолати от род Lactobacillus”
Пенка Петрова, Калоян Петров, Галина Стоянчева
Вагиналните лактобацили представляват мощен механизъм за защита от патогенна бактериална инвазия. С цел да бъдат селекционирани пробиотични щамове, които да послужат за алтернативно лечение на уро-генитални смущения, от вагинални проби на здрави български жени бяха изолирани десет щама Lactobacillus. Всички те бяха оценени като пробиотични, тъй като подтискаха растежа на два различни щама Escherichia coli strains (HB101 and C600).

Антимикробната активност на изолатите беше оценена количествено чрез сравнение на продуцираните от всеки щам антимикробни агенти: млечна киселина, етанол и водороден пероксид, както и възможността за натрупване на биомаса. Получените резултати показаха, че най-висока антимикробна активност имат щамове, които синтезират едновременно високи количества на млечна киселина и водороден пероксид, които имат синергично действие. Антимикробната активност на етанола се оказа доста по-слаба, макар че хетероферментативните щамове го продуцираха в значителни количества. Хидрофобността на клетъчната повърхност на различните щамове варираше от ниска до средна, което показа, че имат слаби възможности за неспецифична адхезия.

8. 
   Petrov K., Petrova P., Beschkov V. (2007) Improved immobilization of Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 in polyacrylamide gel, preventing cell leakage during lactic acid fermentation, World Journal of Microbiology & Biotechnology, vol. 23 (3), 423-428.
   

Калоян Петров, Пенка Петрова, Венко Бешков

Разработен е нов метод за подобрена имобилизация на Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, продуцент на L(+)-млечна киселина, в полиакриламиден гел. Бе изследвана клетъчната имобилизация в поредица гелове с различна концентрации и различен ред на добавяне на реагентите, като бяха проведени периодични и последователни периодични процеси. Получените резултати показаха, че най-важната стъпка за успешна имобилизация е предварителното инкубиране на клетките в чист 10% акриламид и това води до подобрено захващане за полиакриламида. Обратно, ако клетките се поставят в предварително приготвен стоков разтвор на акриламид и бис-акриламид, в хода на ферментацията се получава освобождаване на клетките от гела и се формира голямо количество външна биомаса.

Най-успешната получена имобилизация бе при приготвянето на гел, съдържащ клетките на L. rhamnosus, инкубирани в 10% акриламид, с добавка на 1% бис-акриламид. Този гел показа оптимална пропускливост и в същото време клетките останаха напълно захванати в полимерната матрица - след 48 часа култивиране бяха образувани само 0.03 г свободна биомаса. Освен това, при използването на този гел в периодични процеси бе постигнато 85% превръщане на лактоза в млечна киселина до доста висока концентрация на лактоза - 30 г/л.

Следващите експерименти бяха насочени към изясняване на механизмите, по които протича подобреното имобилизиране и показаха, че настъпват физикохимични взаимодействия между клетъчната повърхност на L. rhamnosus и акриламида.

8. 
   Petrov K., Urshev Z., Petrova P. (2008) “L (+) - Lactic acid production from starch by a novel amylolytic Lactococcus lactis subsp. lactis B84”, Food Microbiology, vol. 25 (4), 550-557.
   

Калоян Петров, Золтан Уршев, Пенка Петрова

Нов щам Lactococcus lactis subsp. lactis B84, способен да разгражда нишестето като еднинствен въглероден източник и да образува L (+)-млечна киселина беше изолиран от спонтанно ферментирало ръжено тесто. С цел да бъде получена максимална продуктивност на млечна киселина, бяха варирани съдържанието на хранителната среда и условията на култивиране. В среда MRS, без дрождев и месен екстракт, при 33°С, разбъркване при 200 rpm и рН 6.0 за шест дни беше постигната пълна хидролиза на 18 г/л нишесте и бе образувана 5.5 г/л млечна киселина.

Идентификацията на щама с генетични методи – АРДРА анализ, ПСР с видовоспецифични праймери и секвениране на 16S рибозомалните гени доказа видовата му принадлежност.

Четири гена, отговорни за деградирането на нишестето бяха открити в генома на В84 - amyL, amyY, glgP и apu, кодиращи съответно цитоплазмена и извънклетъчна алфа-амилаза, гликоген-фосфорилаза и амилопулуланаза.

Есперименти с ПСР с обратна транскрипция показаха, че два от гените, кодиращи амилази (amyL и amyY) се транскрибират в матрична РНК, докато glgP и apu не се експресират.

Изследване на амилазната активност бе направено при различни рН и температури. Клетъчно-свързаната амилаза се оказа ключовият ензим, отговорен за хидролизата на нишестето. Неговата активност е максимална при 45°С и рН 5.4.
10. Atanasova N., Petrova P., Ivanova V., Yankov D., Tonkova A. (2008) Novel alkalophilic Bacillus strains for cyclodextrin glucanotransferase production, Applied biochemistry and biotechnology, vol. 149 (2), 155-167.

„Нови алкалофилни щамове Bacillus за продуциране на циклодекстрин-глюканотрансфераза”

За следващи изследвания на фенотипните характеристики бяха определени 3 от изолатите - 20RF, 8SB и 24WE. Те са аеробни, формиращи ендоспори щамове Bacillus. Два от тях са облигатни алкалофили (20RF and 8SB), а третия е алкало-толерантен (24WE). Двата облигатни алкалофила бяха идентифицирани чрез секвениране на 16S rRNA гените.

Показаната ЦГТ-азна активност (230–250 U ml⁻¹ от 20RF и 130–160 U ml⁻¹ от 8SB) дефинира новите изолати като обещаващи продуценти на ензима. Особено интересен е Bacillus sp. 8SB, тъй като той синтезира термостабилна алкална β- ЦГТ-аза. И двата щама образуват само два типа циклодекстрини – бета и гама, което е допълнително предимство на щамовете при индустриално производство.

11. Petrov K., Petrova P. (2009) “High production of 2,3-butanediol from glycerol by Klebsiella pneumoniae G31”, Applied Microbiology and Biotechnology, 84 (4) 659–665.

По-алкалното начално рН доведе до повишена продукция на 2,3-бутандиол, като отговор на увеличените амплитуди на рН вариациите. Процесите бяха сравнени с ферментация с контролирано рН, при което продуцирането на 2,3-бутандиол остава доста слабо, тъй като клетките загиват след 72 часа. Обратно, при неконтролирано рН културата се развива и произвежда 2,3-бутандиол 280 часа.

В заключение, формирането на 2,3-бутандиол е резултат от адаптивен механизъм на рН-самоконтрол, отговарящ на спонтанните спадове в рН по време на глицеролната ферментация.

12. Petrova P., Petrov K., Beschkov V. (2009) “Production of 1,3-propanediol from glycerol by newly isolated strains of Klebsiella pneumoniae”, Comptes Rendus de l'Academie Bulgare des Sciences, vol. 62 (2) 233-242

Сравнителните експерименти без рН контрол и при поддържано рН 7.0 показаха, че неутралното рН насочва процеса към увеличаване на количеството на 1,3-пропандиола, и до значителен спад в синтезата на 2,3-бутандиол. При такова рН (7.0) G31 и G46 продуцираха 25.86 и 21.42 г/л 1,3-пропандиол от 50 г/л глицерол и съответно 1.7 и 0.0 г/л 2,3-бутандиол. Количеството 1,3-пропандиол, произведен от щам G31 съответства на добив от 62.6 mol/100 mol глицерол и е най-голямото, получено в периодичен процес от щам Klebsiella до този момент.

13. Petrov K., Petrova P. (2009) “Isolation and molecular identification of Klebsiella pneumoniae strains, producing diols from glycerol”, Biotechnology & Biotechnological equipment, vol. 23, 814 – 817
„Изолиране и молекулярна идентификация на щамове Klebsiella pneumoniae, продуциращи диоли от глицерол”

Калоян Петров, Пенка Петрова

Сред обещаващите биотехнологии за производство на ценни химически съединения, едни от най-важните са тези за производството на диоли: 1,3-пропандиол и 2,3-бутандиол – вещества с широко приложение в козметичната и хранителната промишленост, като антифризи, масла, добавки към горивото, а също и като реагенти в производството на полимери. Възможността тези диоли да бъдат синтезирани от отпаден глицерол е ценна поради две главни причини. Първо, отпадният глицерол се произвежда в огромни количества при получаването на биодизел от рестителни масла и е евтин и възобновяем субстрат. От друга страна, освобождаването на големи количества отпаден глицерол в природата би било свързано със сериозни екологични проблеми.

В настоящата работа описваме изолирането на три нови щама, способни да превръщат глицерола в големи количества 1,3-пропандиол и 2,3-бутандиол. Те са изследвани чрез класически микробни тестове и генетичния подход 16S рДНК секвениране. Физиологичните и биохимични характеристики на щамовете показаха, че те най-вероятно принадлежат към вида Klebsiella pneumoniae: те са факултативни анаероби, оксидазо-негативни и каталазо-позитивни, не растат на 10°C и не образуват сероводород и ферментират типичните за вида въглеводороди.

Секвенирането на 16S рДНК потвърди принадлежността на G9, G31 и G46 към вида Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae. Сравнението с базата данни на NCBI показа, че секвенцията на G31 е 99% идентична на секвенцията на типовия щам K. pneumoniae subsp. pneumoniae ATCC 13883^T. Щамовете G9 и G46 са с 99% идентичност с друг колекционен щам - MGH 78578, а също и с K. pneumoniae TUAC01, познат в литературата като щам, способен на успешна конверсия на глицерола. Беше направено филогенетично дърво, в което новооткритите щамове са отдалечени от други глицерол-консумиращи видове като K. oxytoca и K. planticola.

14. Petrova P., Gouliamova D., Petrov K., Stoyancheva G., Dimitrov R. (2009) “Starch-degrading activities of Bulgarian yeast isolates”, Biotechnology & Biotechnological equipment, vol. 23, 651 – 654.

Двадесет дрождеви щама, способни да разграждат нишесте бяха изолирани от растения и насекоми, населяващи българските планини, както и от ферментирали храни. Пробите бяха взети сперилно и съответната микрофлора беше изолирана като чисти култури в селективни среди. Идентификацията на щамовете бе въз основа на клесически критерии: клетъчна и колонийна морфология, физиологични изисквания, усвояеми въглехидрати и тестове за ензимни активности.

Новите изолати принадлежаха към родовете Saccharomyces, Geotrichum, Candida, Metschnikowia, Clavispora, Wickerhamiella, Debaryomyces, Kloeckera и Rhodotorula. С цел да открием щамове с потенциално биотехнологично приложение, бяха изследвани главните ферментационни продукти, получени след култивиране на изолатите в различни среди. След аеробно култивиране на среда с 20 г/л глюкоза, 14 щама продуцираха големи количества етанол, всички образуваха млечна, а шест щама – сукцинова киселина. Способността на щамовете да разграждат нишестето бе изследвана количествено чрез измерване на адсорбцията на йод-нишестения комплекс.

Бяха проведени периодични процеси със среда, съдържаща 10 и 20 г/л нишесте и всички щамове го разградиха в различна степен. Изследваните дрождеви изолати имат потенциала да произвеждат ценни продукти от нишесте.

15. Stoyancheva G., Gouliamova D., Petrova P. (2009) Molecular study of the useful and contaminant microflora in fermented dairy products. Biotechnology & Biotechnological equipment, vol. 23, 551 – 553.

„Молекулярно изследване на полезната и вредната микрофлора във ферментирали млечни продукти”

Галина Стоянчева, Дилнора Гулямова, Пенка Петрова
Млечнокиселите бактерии се използват като закваски от векове. Повечето млечни продукти съдържат млечнокисели бактерии, но също и микрофлора от замърсяване. В настоящата работа изследвахме микробното съдържание на домашно приготвени и промишлено произведени млечни продукти. Бяха изолирани 26 щама и бяха идентифицирани след физиологични и генетични експерименти.

От микроорганизмите, отговорни за ферментацията на млечните продукти и определени като полезни за човека, доминантни бяха Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus и Lactobacillus plantarum.

Друга част от изолираните щамове, определени като представители на родовете Kluyveromyces, Rhodotorula и Candida бяха отнесени към контаминантната микрофлора – резултат от лоша хигиена или съхранение на млечните продукти. Получените резултати повдигат въпроса за ефикасността на микробиологичния контрол и безопасността на храните.

16. Gouliamova D., Dimitrov R., Petrova P., Stoyancheva G., Petrov K. (2009) “Genomic approaches to yeast taxonomy”, Biotechnology & Biotechnological equipment, vol. 23, 519 – 523.

„Геномни подходи към дрождевата таксономия”

Дилнора Гулямова, Румен Димитров, Пенка Петрова, Галина Стоянчева, Калоян Петров

Дрождите са микроорганизми с екологично, медицинско и биотехнологично значение. Те са първостепенни участници в кръговрата на въглерода и са едни от най-ценните микроби с промишлено приложение. Въпреки тяхната важност, дрождите все още не са напълно класифицирани таксономично. Точната им идентификация е от изключителна важност за медицината, биотехнологиите и за разбиране на взаимоотношенията в екосистемите. Настоящият обзор се фокусира върху методите, използвани понастоящем в геномиката на дрожди.

17. Ishlimova D., Urshev Z., Stoyancheva G., Petrova P. Minkova S., Doumanova L. (2009) Genetic diversity of bacteriophages highly specific for Streptococcus thermophilus strain LBB.A. Biotechnology & Biotechnological equipment, vol. 23, 1340-1345.

Даниела Ишлимова, Золтан Уршев, Галина Стоянчева, Пенка Петрова, Светлана Минкова, Любка Думанова

Сравнението на рестрикционните HindIII и EcoRV профили на фаговите ДНКи показаха ниска степен на подобие между изолатите, кластерирайки заедно само øA5 и øA6 фагите. Анализът откри и подобие между øSfA, øPtA и øA7.

Всички осем бактериофага бяха определени като cos-тип фаги. Бе открит консервативен 2.2 kbp EcoRI район, типичен за повечето бактериофаги, атакуващи S. thermophilus. Той присъства при 6 от бактериофагите и отсъства при øDmA и øA1.

PCR амплификацията на район VR2, кодиращ част от антирецептора, показа наличието му при 7 от фагите. Големината на фаговите геноми варира между 33.4 и 37.3 kb. Измежду 62 щама S. thermophilus, фагите øA1, øDmA and øPtA инфектираха само 2 щама. Независимо, че съществува огромно разнообразие от фаги, атакуващи S. thermophilus LBB.A, две стъпки на селекция са достатъчни за подбор на мутанти, резистентни към осем от бактериофагите.

18. Petrov K., Petrova P. (2010) “Enhanced production of 2,3-butanediol from glycerol by forced pH fluctuations”, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 87 (3), 943–949.
„Повишена продукция на 2,3-бутандиол от глицерол чрез изкуствени рН флуктуации”

Калоян Петров, Пенка Петрова

19. Petrova P., Emanuilova M., Petrov K. (2010) “Amylolytic Lactobacillus Strains from Bulgarian fermented beverage Boza”, Zeitschrift für Naturforschung, vol. 65c (3-4), 218-224.

„Амилолитични щамове Lactobacillus от българската ферментирала напитка боза”

Пенка Петрова, Милена Емануилова, Калоян Петров

Бе направена оптимизация на състава на хранителната среда при единствен въглероден източник нишесте. Хидролизата на нишестето бе най-успешна в среда, съдържаща 4 g/l дрождев и 8 g/l месен екстракт. L. plantarum Bom 816 успя да консумира 14 g/l нишесте, докато L. pentosus N3 – 17 g/l. Най-високите стойности на произведената млечна киселина бяха 9.5 g/l, синтезирани от Bom 816 и 5.5 g/l от N3. В присъствието на дрождев екстракт L. pentosus N3 образува 0.8 – 1 g/l секцинова киселина.

Ензимите с амилазна активност, продуцирани от двата щама са главно клетъчно-свързани. Техният рН оптимум на действие е 5.5, а активността им варира в зависимост от условията – от 3 - 4 до 21 U/ml за L. pentosus N3 и от 0.5 до 11.5 U/ml за L. plantarum Bom 816.

20. Petrova P., Petrov K. (2011) Direct starch conversion into L (+) lactic acid by a novel amylolytic strain of Lactobacillus paracasei B41, Starch-Starke, in press.

Генът amy1 (1779 bp), кодиращ ензима амилопулуланаза в В41 бе идентифициран и секвениран. Той кодира протеин, съставен от лидерен пептид от 28 аминокиселини и зрял пептид от 564 аминокиселини. Сравнението с амилазите на близкородствени видове показа, че при B41 са протекли пет важни аминокиселинни замени. В следващи експерименти бе доказан индуцибелният контрол на експресията на гена amy1. Ферментационните характеристики на L. paracasei B41 бяха изследвани в процеси на периодично култивиране с и без рН контрол. Най-голямото количество млечна киселина от нишесте - 37.3 g/l - бе получено след 48-часова ферментация от 40 g/l субстрат при рН 5.0. Степента на превръщане на нишестето в млечна киселина е 93.3%, а освен това е постигната най-високата докладвана досега продуктивност за 24 h - 1.30 g/l h.

21. 
    Petrov K., Petrova P., Beschkov V. (2005) Continuous process of lactic acid production using immobilized in polyacrylamide gel Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, Bulgarian Chemical Communication, vol. 37 (3), 173-177.
    

A new biotechnological method for lactic acid production based on Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 cells immobilised in polyacrylamide gel was developed. Different gels with variable concentrations of the monomer (acrylamide), the cross-linking agent (N,N’-methylene-bis-acrylamide), the catalyst and the initiator of the polymerization were elaborated. The amount of the immobilised cells was optimized.

The experimental data revealed that at a special ratio between the components, a gel could be obtained (10% АА (w/v) and 1% МВАА (w/v)), possessing permeation ability that enables the substrate molecules (lactose) to pass through the gel particles. Thus the process of lactic acid fermentation was accomplished in the gel and the product (lactic acid) leaked out in the media. At the same time, the immobilised cells remained entrapped in the polymer lattice.

In this way a complete separation of the lactic acid from the biomass was achieved. The product separated from the biomass was highly concentrated, as the yield from the initial amount of the substrate was about 85% without any pH control (with initial lactose concentrations up to 30 g/l). Using the described gel in a batch culture, the free cells are less than 1% of the biomass of the standard culture (non-immobilised cells). When a continuous process is performed, the cells immobilised by our method lead to less than 30% biomass, compared to the standard and very stable operating performance.

Калоян Петров, Евгения Василева, Пенка Петрова, Венко Бешков

През последните години бе сложено началото на изследванията в тази област и в нашата страна. Нови щамове Klebsiella, супер-продуценти на диоли бяха изолирани и идентифицирани. Бяха изучени условията, при които има повишена синтеза и бяха определени оптималните параметри на ферментацията на глицерол. Бе направена детайлна оптимизиция на състава на хранителните среди, както и влиянието на различните фактори върху количеството на всеки от диолите. Бе оценено потенциалното приложение на българските изолати и икономическото и екологично влияние на свързаните с тяхната употреба биотехнологии.

Благодарности: Авторите благодарят на Европейския Социален Фонд за финансовата подкрепа, договор BG051PO001-3.3.04/30.
23. Petrova P., Petrov K. (2010) “Amylolytic lactic acid bacteria and their industrial application” Journal of International Scientific Publications: Materials, Methods & Technology, vol. 4 (1), 349-358.
„Амилолитични млечнокисели бактерии и тяхното промишлено приложение”

Пенка Петрова, Калоян Петров
Способността да разграждат нишестето и да го превръщат в млечна киселина е желано и рядко срещано качество на млечнокиселите бактерии (МКБ). Поначало лишени от амилазни ензими, описаните до този момент амилолитични млечнокисели бактерии са съвсем малко, въпреки важните им промишлени приложения. На първо място, това са съвременните биотехнологии за продуциране на млечна киселина мономер на биодеградимите пластмаси и реагент в редица органични синтези. Биотехнологичното получаване на млечна киселина с участието на амилолитични МКБ, особено от отпадъчно нишесте от растителна биомаса (3.5 млрд тона годишно) е евтино и ефективно поради способността им да превръщат нишестето в млечна киселина в едностъпален процес на ферментация.

Друго приложение на амилолитичните МКБ е хранително-вкусовата промишленост. Тъй като част от тях образуват L (+) стереоизомера на млечната киселина, който се усвоява от човека, те са незаменими закваски при производството на зърнени храни и напитки. Поради пробиотичното действие на голяма част от разглежданите щамове, амилолитичните МКБ могат да бъдат използвани в разработването на функционални храни.

Благодарност: Авторите благодарят на Европейския Социален Фонд за финансовата подкрепа, договор BG051PO001-3.3.04/32.


Доклади, публикувани в сборник трудове от международна конференция:

24. 
    Danova S., Diankova S., Pavlov P., Stoyancheva G., Petrova P., Manasiev J., Valcheva R., Andreeva P., Miteva V. “Molecular identification and cluster analysis of Bulgarian vaginal Lactobacillus strains” X Congress of Microbiology, Plovdiv 2002, Proceedings book.
    

Vaginal lactobacilli include a large number of novel species, which require a new taxonomic standard for classification. In this study we combine a classical and genotyping method as a first stage in the development of appropriate strategy for molecular identification of this group of microorganisms.

The efficacy of a biochemical kit “API 50 CHL” for identification of vaginal lactobacilli was evaluated by comparing with results of dot hybridization assay. Eight strains of mesophilic lactobacilli isolated from Bulgarian healthy women were grouped and characterized according to their genetic relatedness. Strains were identified by sugar fermentation patterns using the “API 50 CHL” galleries and by random DIG labeled DNA probes in dot-blot hybridization experiments. Two strains were classified as Lactobacillus fermentum and one as L. salivarius subsp. salivarius. Most of the strains could not be grouped using only carbohydrate fermentation profiles. The strains affiliated as L. acidophilus, L. casei subsp. ramnosus, L. reuteri and L. delbrueckii were not founded by both methods.. By specially created DIG labeled DNA probes all newly isolated lactobacilli were grouped according to the similarities with referent ATCC strains.

24. 
    Petrova P., Danova S., Stoyancheva G., Miteva V. “Cloning of selective markers in bifunctional plasmids”, X Congress of Microbiology, Plovdiv 2002, Proceedings book.
    

Five series of bifunctional constructions, which are able to multiply in E. coli and S. thermophilus had been made. The most successful of them, pBSOTsh (4.7kb) and pCROTsh (5.7kb) were on the base of 1.8kb restriction fragment of pt38, bearing dso (double stranded origin). Except the replication determinants of the pt38, they contain an origin of replication and beta-lactamase gene (bla) of E. coli. The cat-gene (cloramphenicol-acetyl-transpherase) of the staphylococcal plasmid pC194 was cloned in the new shuttle vectors pBSOTsh and pCROTsh. The expression of the cat-gene was proved by protein SDS-PAGE. Seven streptococcal dairy starters were checked for their resistance to aminoglucoside antibiotics. All of them, except one strain, were naturally resistant to streptomycin, spectinomycin, kanamycin, neomycin, gentamycin and tobramycin. That is why the selective marker kanamycin- resistance of pCROT-family could not to be applied to streptococcal host.

24. 
    Danova S., Pavlov P., Stoyancheva G., Diankova S., Manasiev J., Petrova P., Jordanova T., Ivanovska N. “Antagonistic activity of Lactobacilli from different ecological nishes”, Научна конференция с международно участие, Стара Загора, юни 5-6, 2003, Сборник с материали, том IV, част I, стр. 59-63.
    

Lactobacilli are an important group of industrial starter cultures applied in the production of fermented foods. They are a part of protective microbota in human and animals. The most important characteristics of these species is the antibacterial activity. This study shows antagonistic activity of 9 referent ATCC strains and 56 Lactobacillus strains, isolated from different ecological niches. The spectrum of activity includes this against soma pathogenic and food-spoiling bacteria. The higher % of anti- Listeria active strains was reported for the group of strains isolated from traditional Bulgarian white cheeses. The group of 30 vaginal lactobacilli and 12 referent ATCC strains demonstrate a broad spectrum of activity against different Gram (+) and Gram (-) test-microorganisms. Three newly isolated Lactobacillus strains had bacteriocinogenic activity. Every investigation looking for the biological activity of the “friendly” bacteria – lactobacilli is a point of interest in dairy industry and monitoring of probiotic strains.

24. 
    Petrova P., Gouliamova D., Stoyancheva G. Heat shock response of Streptococcus thermophilus industrial strains, XI congress of Microbiology, 5-7 October 2006, Varna, Bulgaria, Proceedings book.
    

The response of S. thermophilus strain ST2980, containing 3.3 kb plasmid and its plasmid free derivative (ST2980*) to heat-shock was studied. The percentage of survived cells was determined by counting of colony forming units. Significant differences in survival between strain variants were observed, especially when the cells were transferred from 42°C directly to 62°C. After 1 hour only 1% of ST2980* cells were still alive, compared to 50% of ST 2980. The prior incubation at 52°C (pre-shock) enables the plasmid-cured cells to survive more efficiently. However, after 2 hours of exposure to the increased temperature, about 7% of ST2980 cells were alive, compared to 0% of ST2980*. The analysis of growth curves allows suggesting that the role of small hsp is the fast reaction to changes in the environment. It is possible that the 16.4 kDa Hsp works as a signal molecule, inducing the expression of other (60 – 100 kDa) heat-shock proteins.

This work was financially supported by National Council for Scientific Research of Republic of Bulgaria (Grant K 1307/2003).

24. 
    Stoyancheva G., Dimitonova S., Petrova P., Aleksandrova R., Tzvetkova I., Danova S. Study of vaginal lactobacilli from Bulgarian women, XI congress of Microbiology, 5-7 October 2006, Varna, Bulgaria, Proceedings book.
    

The human vagina is a complex dynamic ecosystem containing an abundance of microorganisms. In women of childbearing age this system is dominated by Lactobacillus spp., producing a variety of metabolites including lactic acid which maintains the acidic conditions (pH<4.0), hydrogen peroxide (H2O2), bacteriocins and other antimicrobial substances as important inhibitors of the pathogenic organisms in the vagina. The use of probiotics to control certain infections and to reestablish the human bacterial microbiota is gaining acceptance as an alternative to conventional antibiotic therapy. The present study summarised results from tree-years research project on Lactobacillus microflora of sixty reproductive-age Bulgarian women. Forty eight strains isolated from collected vaginal samples were determined as Lactobacillus sp. Antagonistic activity of all vaginal lactobacilli were evaluated by different in vitro methods.

Active strains inhibiting the growth of pathogens were selected. Qualitative tests for H2O2 and exopolysaccharides production was made. Some of these exopolysaccharides promoted Lactobacillus adhesion to epithelial cells and it is important for vagina colonization. In order to revealed the biodiversity of studied Lactobacillus strains six molecular methods (ribotyping, ARDRA, rep-PCR, PCR with species-specific primers, hybridization with speciesspecific probes and sequencing analysis) were applied. The predominant species in the studied group was L. fermentum. Three strains, possessing high antimicrobial activity were studied by sequencing analysis of 16S rDNA.

After additional research, these strains could be used as therapeutic agents for the treatment and prevention of urogenital infections.

This work was financially supported by National Council for Scientific Research of Republic of Bulgaria. (Grant 1406/2004).

24. 
    Beschkov V., Angelov I., Petrova P. Biogas production from waste glycerol with inhibition from carboxylic acids, Linnaeus ECO-TECH ’10, November 22-24, 2010, Kalmar, Sweden.
    

One of the ways for waste glycerol utilization is biogas production. This biogas could be used for partial energy supply of the main biodiesel plant. An important hinder for this application is the accumulation ofcarboxylic acids leading to strong inhibition of the methanogenesis and shift to production of gas with very low methane content.

The present paper studies the possibility of biogas production from waste glycerol in a multi- stage anaerobic digester composed by consecutively situated cells separated by baffles. This cascade-type bioreactor enables the separation of zones with different pH and organic acid content and therefore to achieve flexible operation. The experiments show stable pH-profile along the bioreactor stages with minimum pH-values in the middle cells. Identification of the intermediate products resulting of the digestion was carried out. A strong correlation between the acid content and the pH-value in each reactor stage was observed. Microbiological study shows that the microbial profile along the reactor varies with the progress of fermentation. The initial glycerol biodegradation is accomplished by aerobes and facultative anaerobes, whereas the methanogenesis starts after the first stage and it is represented consecutively along the stages by the genera Methanosarcina, Methanobacterium and Methanobrevibacter. Their concentrations are strongly sependent on the pH values. It was shown that overloading with glycerol leads to gradual decrease of methane in the produced biogas with an un-desired long period of further restoration of the normal reactor functioning.


Доклади, публикувани в сборник трудове от национална конференция:

24. 
    Калоян Петров, Пенка Петрова „Влияние на изкуствените рН флуктуации върху биоразграждането на глицерол” Лятна школа, Бургас, 6-8 юли 2010 (CD).
    

24. 
    Петрова П. “Генетични детерминанти и активност на амилазните ензими в български млечнокисели бактерии”, Първи работен семинар “Кои сме ние и какво работим” по проект “Ефективно обучение на докторанти и подпомагане на развитието и реализацията на пост-докторанти и млади учени в приоритетни области на микробиологията”, 24-25 юни 2010 г., София, Сборник доклади, стр. 24-27.
    

Млечнокиселите бактерии (МКБ) са били използвани в смесени ферментации от хилядолетия, но тяхната възможност да усвояват нишестето без помощта на симбиотичен партньор е била забелязана едва през последното десетилетие. Щамовете МКБ с амилазна активност са рядко срещани, а природата на участващите ензими и генетичната база на това явление не са изяснени.

Цел на настоящата работа е да бъдат детерминирани гените, отговорни за амилолитичните свойства на изолираните МКБ, да бъде проследена генната експресия и определена активността на съответните хидролитични ензими. Изпълнението й включва анализ на микробното съдържание на нишесте – съдържащи суровини, храни и напитки и създаване на микробна колекция от амилолитични МКБ с точна видова идентификация на изолираните щамове. Предвижда се доказване наличието на амилазни гени чрез PCR и експресията им чрез RT-PCR. Ще бъде направена и количествена оценка на активността на амилолитичните ензими.

24. 
    Петрова П. “Амилолитични пробиотици с приложение в хранително-вкусовата промишленост”, Втори работен семинар “Кои сме ние и какво постигнахме” по проект “Ефективно обучение на докторанти и подпомагане на развитието и реализацията на пост-докторанти и млади учени в приоритетни области на микробиологията”, 29-30 юни 2011 г., София, Сборник доклади, стр. 5-7.
    

От проби от боза бяха изолирани три щама лактобацили с висока амилазна активност и способни да превръщат нишестето в големи количества млечна киселина. Щамовете бяха идентифицирани и отнесени към следните видове: L. plantarum, L. pentosus и L. paracasei. Изследването на амилазната активност показа, че щамове L. plantarum Bom 816 и L. pentosus N3 продуцират клетъчно свързана амилаза, докато щам L. paracasei B41 – екстрацелуларна амилопулуланаза. И трите щама превръщат ефективно нишестето в млечна киселина, която при L. paracasei B41 е предимно L(+) лактат. Изследваните лактобацили подтискат растежа на както на Грам-положителни, така и на Грам-отрицателни микроорганизми: Escherichia coli HB101, Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae и Bacillus subtilis.