Полизахариди от плодни тела и мицели на Ganoderma

През последните години има голям научен интерес към полизахаридите на Ganoderma, които представляват структурно различен клас от биологични макромолекули с широк диапазон на физикохимични свойства. Проучвания са показали, че най-активните имуномодулиращи полизахариди са водноразтворими P-1-3-D и P-1-6-D глюкани, които могат да бъдат преципитирани с етанол. Тяхната преобладаваща структура е β -1-3 D-глюкопиронан с 1-15 единици от β -1-6 моноглюкозил странични вериги. Техният гръбнак се състои от 1,3-свързани относително малки странични вериги и организирана хеликална структура благоприятстват имуностимулирането [84]. Има съобщения и за други имуномодулиращи полизахариди и особено гликопептиди[85] и протеогликани [86].

Съобщенията за фармакологичната активност на полизахаридите на Ganoderma са фокусирани основно върху противотуморните им ефекти, свързани с имуномодулиране, въпреки че се наблюдават и други ефекти като регулиране и протекция на клетките. Биоактивните водноразтворими полизахариди се изолират от плодни тела и мицелна биомаса, отглеждани в течна култура. Има няколко изолирани от самата течна култура. Идентифицирани са и няколко водонеразтворими антитуморни полизахариди [87].

Противотуморни ефекти и имунологични механизми

През 1971 Sasaki et al. [88] съобщиха за антитуморни полизахариди, изолирани от някои Polyporaceae, включително G. applanatum. Изучаването на антитуморните ефекти на G. lucidum и техните механизми стана обект на голям интерес. От 1980-те години насам многобройни фармакологични проучвания показват, че горещият воден екстракт на полизахаридите на G. lucidum потиска туморния растеж в няколко тумор-носещи миши модела [89-95], но механизмите на противотуморното действие на G. lucidum все още не са напълно известни. Издигната бе хипотеза, че полизахаридите на G. lucidum упражняват антитуморно действие посредством усилване защитните функции на собствената имунна система на тялото. Тази хипотеза бе използвана като ръководно начало за по-нататъшна изследователска работа чрез разработване на протоколи и експерименти за потвърждаването й.

По-нататъшни проучвания [96-99] показаха, че водноразтворимият екстракт на полизахариди от G. lucidum и G. lucidum инхибира in vivo растежа на S-180 саркома и белодробен карцином на Люис. Котато се добавят обаче към култури на S-180 или HL-60 туморни клетки, нито водният екстракт от G. lucidum, нито полизахаридите на G. lucidum инхибират пролиферацията или индуцират апоптоза в туморните клетки, дори когато полизахаридите са в много висока конценвтрация (400mg/l), което показва, че G. lucidum и нейната активна фракция нямат пряк цитотоксичен ефект върху туморните клетки.

През 1990-те години се изясни, че полизахаридите на Ganoderma наистина влияят върху имунната система. Много съобщения изтъкват, че полизахаридите стимулират имунните функции, както in vivo, така и in vitro и че в този механизъм участват макрофагите [100]. Пролиферацията на раковите клетки не се повлиява само от полизахаридите на Ganoderma а се инхибира значително и от средата, кондиционирана от активираните от полизахаридите кръвни мононуклеарни клетки [101-106].

Lei et al. [107] проучват антагонистичните ефекти на полизахаридите на G. lucidum върху имуносупресивния отговор, индуциран от циклоспорин А, хидрокортизона и антитуморните агенти и съобщават, че са наблюдавали усилване на клетъчномедиираните имунни функции и нарастване в продукцията на цитокини. Съобщават се и други имуномодулиращи ефекти като засилване на неспецифичните имунни функции[108], при което полизахаридите на Ganoderma въздействат върху свободния интрацелуларен калций и свободните кислородни радикали в миши перитонеални макрофаги.

Антитуморната активност на цитотоксични лекарства като циклофосфамида се усилва при орално приложение на полизахариди на G. lucidum. Подсилвайки макрофагната активност, полизахаридите на G. lucidum индуцират апоптоза от HL-60 клетките [96,97].

Shao et al. [111] изучават имунните рецептори за полизахаридите на G. lucidum. Проучването, което цели идентифицирането и характеризирането на имунните рецептори за тези полизахариди показва, че полизахаридите на G. lucidum активират in vitro BALB/c миши B клетки и макрофаги, но не и Т-клетките.

Chien et al. [112] съобщават, че фукозосъдържащата гликопротеинова фракция, изолирана от G. lucidum, повишава популацията и токсичността на CD56+ NK-клетките в човешки мононуклеарни клетки от кръв на пъпната връв.

Lei and Lin [113-114] съобщават, че у мишки G. lucidum промотира смесена лимфоцитна реакция (MLC), по време на която нейните активни полизахариди повишават синтеза на ДНК в далачните клетки чрез увеличаване индукцията на ДНК полимераза.

Противотуморният ефект на полизахаридите на G. lucidum се медиира чрез цитокините, освободени от активираните Т лимфоцити и макрофаги [102]. In vitro, полизахаридите на G. lucidum индуцират активиране и пролиферация на B лимфоцитите [113,115-117]. Проучванията върху продукцията на антитела, индуцирана от G. lucidum обаче варират в съобщенията на различните автори. Тя е изразена при полизахаридите на G. lucidum, чиято верига се състои от 1,4-свързани α-D-глюкопиранозил остатъци и 1,6-свързани β-D-галактопиранозил остатъци. Ефектът на клонове O-6 от глюкозни остатъци и O-2 от галактозни остатъци върху нивата на серумните IgG и комплемента (C3) след перитонеално инжектиране на доза от 25mg/kg за 4 дни е слаб [116]. У мишки с възпаление на дихателните пътища оралната инфузия на G. lucidum значително подтиска продукцията на IgG1 и увеличава тази на IgG2a [118].

Тези проучвания подсказват, че антитуморният ефект на G. lucidum се дължи на имунологичен механизъм. По-нататъшни проучвания, извършени чрез серологичен фармакологичен метод, потвърждават, че ендогенният имунологичен механизъм играе важна роля за антитуморния ефект на G. lucidum. След третиране на мишки с воден екстракт от полизахариди на G. lucidum or G. lucidum (инжекционно или чрез орална инфузия) се вземат и тестват серумни проби. Резултатите показват, че in vitro серумите, третирани с екстракт от G. lucidum инхибират пролиферацията на S-180 туморни клетки и индуцират тяхната апоптоза.

Няколко други автори също съобщават за засилване продукцията на цитокини, както от макрофагите, така и от Т лимфоцитите и специално на тумор некротизиращия фактор-α (TNF-α) и интерферон-γ (IFN-γ).

Полизахаридите както на G. lucidum, така и на G. lucidum промотират пролиферацията на лимфоцити, индуцирани от конканавалин А или липополизахарид и потенциират продукцията на интерлевкините (IL-1, IL-2, IL-3 and IL-6), тумор некротизиращия фактор a (TNF- α) и интерферон g (IFN- γ) и тяхната mРНК експресия в T лимфоцитите и макрофагите. [86,92,102,115,125].

Chen et al. [126] проучват ефекта на полизахаридите на G. lucidum върху експресията на цитокини в миши спленоцити. Една от фракциите (F3) активирала експресията на IL-1, IL-6, IL-12, IFN- γ, TNF- α, GM-CSF, G-CSF и M-CSF. Тези резултати, подкрепени от предходните проучвания, подсказват, че може да се предполага действието им да се дължи на макрофагите, като F3 се свързва с TLR4 рецептора и активира екстрацелуларната сигнал регулирана киназа, c-Jun N-terminal kinase и p38, за да се индуцира IL-1 експресия.

Boh et al. [104] съобщават резултатите си от in vitro тестване на екстрацелуларни и интрацелуларни фрокции на полизахариди на G. lucidum върху индукцията на цитокин синтеза в първични култури от човешки мононуклеарни клетки от „buffy coat” на здрави донори. Водноразтворимите полизахариди, изолирани от мицели, продуцирани чрез потопена култура във въртящ се биореактор индуцирали 3.0-630 pg/ml TNF-α и 1.23-2.18 pg/ml IFN-γ.

Zhu and Lin [124] проучват взаимодействието между полизахаридите на G. lucidum (Gl-PS) и цитокините и механизмите на действие на Gl-PS върху пролиферацията и антитуморното действие на цитокин индуцираните клетки убийци (CIK). Резултатите показват, че 400 mg/ml или 100 mg/ml от Gl-PS промотира пролиферацията на CIK клетките, а цитотоксичността е свързана с увеличаването на IL-2, продукцията на TNF, протеин и mРНК експресията на гранзим В и перфорин в CIK клетките чрез синтезиране на цитокини в намаляващи дози на IL-2 със 75% и на анти- CD3 с 50%.

Wang et al. [128] скринират различни щамове на G. lucidum и изучават техните противотуморни и имуностимулиращи свойства. Проучването върху антипролиферативното действие на етанолов екстракт и имуностимулиращото действие на воден екстракт на G. lucidum е проведено на K562 клетки и макрофаги. Резултатите показват, че туморните клетки се инхибират от етаноловия екстракт, а макрофагите се активират от водния екстракт на G. lucidum.

В разработката на Zhang et al. [129] полизахаридните фракции на щамовете G. lucidum инхибират значително пролиферацията на левкемични клетки. Ефектът на фракциите на плодното тяло за стимулиране пролиферацията на далачните лимфоцити Т и В и за активиране активността на NK е бил по-силен отколкото този на фракциите на мицелите. Фракциите на плодното тяло и мицелите са имали сходен ефект за стимулиране пролиферацията на Т и В клетките в мононуклеарни клетки в периферната кръв. Авторите установяват, че фракции от плодното тяло и мицелите подтикват мононуклеарните клетки в периферната кръв към освобождаване на TNF-α по дозозависим маниер. В ниски концентрации фракциите на мицелите имат сходен капацитет с фракциите от плодно тяло да индуцират продукция на TNF-α. Но във високи концентрации фракциите на мицелите са по-добри от тези на плодното тяло.

Няколко разработки показват, че G. lucidum има също положителен и протективен ефект върху живите клетки. Cao and Lin [106,109] откриват, че полизахаридите на G. lucidum имат ефект върху регулацията на съзряването и функциите на дендритните клетки. You, Lin et al. [134] съобщават за протективни ефекти на гликопептиди на G. lucidum върху макрофаги, увредени в резултат на оксигениране. Shi et al. [135] изучават водни екстракти от осем вида гъби и установяват, че G. lucidum има потенциал за протекция на клетъчната ДНК от оксидативно увреждане. Zhang et al. [136] съобщават за in vitro и in vivo протективен ефект на полизахариди на G. lucidum върху панкреатичните островчета срещу увреждане от алоксан. Този ефект зависи от дозата и се изразява в увеличаване на серумния инсулин и намаляване нивото на серумната глюкоза у мишки с предизвикан от алоксан диабет при интрагастрално третиране в продължение на 10 дни. Механизмът се основава на способността на полизахаридите да предпазват островчетата на панкреаса от свободните радикали. Установили са, че хомогенати от панкреаса на третирани с алоксан мишки имат повече липидни хипероксиди, отколкото животните, третирани с полизахариди на G. lucidum. В проучване на Lakshmi et al. [137] метанолов екстракт от G. lucidum има зависещ от дозата протективен ефект върху увредени от benzo[a]pyrene чернодробни клетки и съществена антимутагенна активност in vivo (у плъхове), дължаща се на възстановяване на антиоксидантната защита.

Един от най-отдавна изолираните от G. lucidum протеини е LZ-8, за чиито имуномодулиращи и имуносупресивни действие има съобщения [138]. От мицели на G. lucidum, продуцирани чрез ферментация с потапяне, Tian and Zhang [139] пречистват и характеризират протеиназа А инхибитор с молекулно тегло 38 kDa. Пречистването е проведено чрез преципитация с етанол

(50-80%), ACA44 гел филтрация и Source 30Q анионен обмен. Неговото въглехидратно съдържание е около 70%. Между гликана и сърцевия протеин има вероятно О-връзка. Изучаването на взаимодействието между инхибитора и разнообразни други протеинази показва, че този инхебитор има по-специфично действие от останалите спрямо дрождевата протеиназа А. Той показва забележителна термостабилност.

Една биоактивна фракция (GLPG) е екстрахирана от мицели на G. lucidum и пречистена чрез преципитация с EtOH и DEAE-целулозна колонна хроматография от Liu et al. [140]. GLPG е протеогликан със съотношение между въглехидратите и протеина 10.4:1. Продуктът има противовирусно действие. Проучен in vitro е възможният механизъм на антихерпетичното действие на протеогликана, изолиран от мицели на G. lucidum. Антивирусните му действия срещу Херпес симплекс вирусите от 1 и 2 тип са изследвани посредством изпитване на цитопатичния ефект върху клетъчна култура. Въпреки че все още не е изяснен точният механизъм, резултатите от това проучване насочват към инхибиране на вирусната репликация чрез ранна намеса в явлението – абсорбцията на вируса и навлизането му в клетките мишени. Поради това GLPG протеогликанът е потенциален кандидат за антихерпес симплекс агент.

Wang et al. [141] са изолирали от пресни плодни тела на G. lucidum рибонуклеаза с молекулно тегло 42kDa и N-терминална последователност, различна от останалите гъбични рибонуклеази. В процеса на пречистването рибонуклеазата е адсорбирана на DEAE-целулоза и Q-сефароза и след това на CM-сефароза. Нейното оптимално pH 4.0 е ниско в сравнение с тези на останалите гъбени рибонуклеази. За оптималната й ензимна активност е необходима температура от 60°C. Рибонуклеазата е уникална сред всички гъбени рибонуклеази по това, че има най-голяма сила към поли poly(U), следвана от poly(A). Нейната активност към poly(G) и poly(C) е около една втора от активността й към poly(A) и една четвърт от тази към poly(U).

Wang et al. [142] изолираха 15-kDa протеин от плодни тела на G. lucidum, и го нарекоха ганодермин. Процедурата за изолиране включва хроматография на DEAE-целулоза, Affi-gel blue gel, CM-сефароза и Супердекс 75. Ганодерминът упражнява антифунгална активност посредством инхибиране на мицелния растеж на Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum и Physalospora piricola.