Клинична имунология
Изтегляне 0.68 Mb.
|
|
18.1. Лабораторията е в състояние да изследва антитела от ИгГ и ИгМ изотипове към антигени от централна и периферна нервна система - миелин, миелин базичен протеин (МБП), протеолипиден протеин (ПЛП), миелин олигодендроцитен гликопротеин (МОГ), миелин асоцииран гликопротеин (МАГ), ганглиозиди GM1, GD1b, S100 протеин, ацетилхолинови рецептори, калциеви канали, церебеларни клетки, цитоплазмения антиген Yo, антинуклеарните Hu, Ri, неврофиламенти, синаптозоми, глутаматергични рецептори, глутамат декарбоксилаза (ГАД), b-интерферон и др. 18.2. Използват се утвърдените за това методи: имуноензимни, радиоимунологични, дот-блот техники индиректна имунофлуоресценция. 18.3. Стандартната ИИФ техника се препоръчва като скриниращ тест (миелин, церебеларни клетки). 18.4. ИЕМ и дот-блот техники се препоръчват за типизиране на специфичността на автоантителата срещу антигени на централната и периферната нервна система (МБП, ПЛП, МОГ, МАГ, GM1, GD1b, Yo, Hu, Ri и т.н.). 18.5. Всеки тест съдържа отрицателна и положителна контрола. 18.6. Всички серумни и ликворни проби, положителни на ИИФ скрининга, се изследват за наличие на специфични антитела с ИЕМ. 19. Определяне на глиадинови и тъканни трансглутаминозни антитела(АТГА). 19.1. Лабораторията трябва да е в състояние да определя глиадинови и трансглутаминозни антитела според общоприетата номенклатура. 19.2. Трябва да се използват утвърдени имуноензимни техники за определяне наличието, количеството и класа. 19.3. Определят се ИгГ и ИгА . 19.4. Лабораторията трябва да извърши количествено определяне на АГлА и АТГА срещу стандартна крива от стандарти с определена концентрация, определени от производителя. 19.5. Всяко изследване трябва да включва положителна и отрицателна контрола, дефинирана от производителя. 19.6. Трябва да се използват търговски набори с предоставена информация за специфичността и чувствителността на тестовете. 19.7. Задължително трябва да се определя и серумното ниво на ИгА. 20. Определяне на антитела срещу тъканна трансглутаминаза (AtTg). 20.1. Лабораторията трябва да е в състояние да определя антитела срещу тъканна трансглутаминаза според общоприетата номенклатура. 20.2. Трябва да се използват утвърдени имуноензимни техники за определяне наличието, количеството и класа. 20.3. Определят се ИгГ и ИгА изотипове на антитрансглутаминазни антитела. 20.4. Лабораторията трябва да извършва количествено определяне на антитрансглутаминазни антитела срещу стандартна крива от калибратори с определена концентарция, предоставени от производителя. 20.5. Всяко изследване трябва да включва положителна и отрицателна контрола, дефинирана от производителя. 20.6. Задължително трябва да се определя и серумното ниво на ИгА. 21. Определяне на спонтанна и стимулирана активация и пролиферация на лимфоцити. 21.1. Лабораторията може да определя спонтанна и стимулирана активация и пролиферация на лимфоцитите in vitro, като се използват утвърдени методики, като изотопна, флоуцитометрична. 21.2. Вариантът на метода (с изолирани лимфоцити или с цяла кръв) се подбира според целите на изследването. 21.3. Всички процедури по изолирането и култивирането на клетките се извършват в стерилна непирогенна, полистиренова посуда за еднократна употреба. 21.4. Лимфоцитната стимулирана активация се изследва с поликлонални митогени, специфични антигени и ко-стимулиращи фактори. 21.5. Лабораторията трябва да установи според метода подходящи концентрации на активатора, като: минимална (прагова), средна (50 % активация) и максимална (плато на активацията), при които се активират достатъчен процент от лимфоцитите. 21.6. Заедно с кръвта на изследваните пациенти като контрола се изследва кръв от здрав донор. 21.7. Всяко определяне включва негативна контрола (нестимулирана проба) за спонтанна активация и пролиферация на лимфоцити. 21.8. При флоуцитометричния метод всяко определяне на активацията на лимфоцити включва изотипна контрола на активирана и неактивирана кръв. 21.9. Когато се работи с изолирани клетки, концентрацията им трябва да бъде еднаква, а когато се работи с цяла кръв, обемът на материала е еднакъв във всяка ямка (епруветка). 21.10. Строго се съблюдава качеството на използваната хранителна среда и допълващите я ингредиенти. По възможност се работи с продуктите на един установен производител. 21.11. При използването на изотопен метод: 21.11.1. да се работи с една и съща минимална активност на изотопа; 21.11.2. внасянето на изотопа и прекъсването на култивирането се извършва винаги в точно определен час от общото време за култивиране; 21.11.3. използваните филтри за утаяване на клетките са с една и съща големина на порите. 21.12. За определяне на степента на активация чрез флоуцитометрия: 21.12.1. се използва експресията на повърхностни активационни маркери (като CD69, HLA-DR и др.); препоръчва се моноклоналните антитела за активационните маркери да бъдат конюгирани с флуорохрома фикоеритрин и да се използват в комбинация с поне едно антитяло, определящо вида на лимфоцитната субпопулация (напр. CD3, CD4, CD8, CD56 и др.); 21.12.2. анализът е за най-малко 2500 клетки в аналитичния прозорец на изследваната субпопулация. 21.13. Лабораторията има разработени критерии за определяне степента на активация и пролиферация. 22. Количествено определяне на цитокини в супернатанти от стимулирани in vitro мононуклеарни клетки. 22.1. Лабораторията може да определя количеството на цитокини в супернатанти от стимулирани in vitro мононуклеарни клетки. 22.2. Прилагат се утвърдени методики за стимулиране синтеза на цитокини in vitro. 22.3. За стимулатори на мононуклеарни клетки се използват митогени или специфични антигени. 22.4. Вариантът на метода (с изолирани лимфоцити или с цяла кръв) се подбира според целите на изследването. 22.5. Всички процедури по изолирането и култивирането на клетките, както и по обработването на цялата кръв, се извършват в стерилна непирогенна полистиренова посуда. 22.6. Когато се работи с изолирани клетки, концентрацията им във всички ямки трябва да бъде еднаква, а когато се работи с цяла кръв, обемът на материала е еднакъв във всяка ямка. 22.7. Лабораторията определя времето за култивиране на клетките според характеристиката на търсения цитокин. 22.8. Лабораторията използва утвърдени методи, като имуноензимен метод, за определяне количеството на съответния цитокин в супернатаната. 23. Количествено определяне на антиген-специфични CD4 и CD8 Т лимфоцити. 23.1. Лабораторията е в състояние да определя количествено антиген специфичните CD4+ и CD8+ Т клетки чрез флоуцитометрия и ИЕМ на ниво единична клетка. 23.2. За неспецифичен активатор се използва най-често митоген в предварително определена работна концентрация. 23.3. За специфичен активатор се използват съответни пептидни антигени в предварително определена работна концентрация. 23.4. Всяко определяне на активацията на лимфоцити включва: 23.4.1. негативна контрола (нестимулирана проба); 23.4.2. положителна контрола - кръв, стимулирана с подходящ неспецифичен активатор-митоген. 23.5. При определяне на антиген-специфични Т лимфоцити на ниво единична клетка: 23.5.1. натоварването на плаките със съответните специфични моноклонални антитела, посяването и култивирането на клетъчния материал се извършват при спазване на общоприетите изисквания за стерилност; 23.5.2. лабораторията определя броя на антиген-специфичните клетки по продукцията на цитокина IFN-g на ниво единична клетка; 23.5.3. работи се винаги с една и съща концентрация на клетките във всички ямки; 23.5.4. плаката се отчита изключително прецизно, като се изброява всеки отделен спот (петната), представляващ единичната цитокин-продуцираща антиген-специфична клетка; 23.5.5. броят на антиген-специфичните клетки се отчита с помощта на стереомикроскоп или апарат за отчитане на спотовете (ELISpot Reader); 23.5.6. след отчитането плаките се съхраняват на тъмно и сухо място поне за една година. 23.6. При флоуцитометричния метод: 23.6.1. всяко определяне на активацията на лимфоцитите включва изотипна контрола на активирана (със специфичен антиген) и неактивирана кръв; 23.6.2. за определяне на антиген специфичните клетки се използват моноклонални антитела, конюгирани с флуорохром, чрез които се установява коекспресията на повърхностни активационни маркери (като CD69) и вътреклетъчни цитокини (интерферон-g, TNF-a и др.); 23.6.3. антителата срещу активационните маркери и интрацелуларните цитокини се използват в комбинация с поне едно антитяло, определящо вида на лимфоцитната субпопулация (напр. CD3, CD4, CD8, CD56 и др.); 23.6.4. изброяването обхваща най-малко 20 000 лимфоцити в аналитичния прозорец (CD4 или CD8 Т лимфоцити). 24. Определяне на фагоцитоза и оксидативен взрив. 24.1. Лабораторията трябва да е в състояние да определи фагоцитоза и оксидативен взрив по един от следните утвърдени методи: микроскопски, спектрофотометрично или флоуцитометрично. 24.2. Нитроблутетразолов тест (НБТ): 24.2.1. Лабораторията е в състояние да определи микроскопски процент на неутрофилни гранулоцити от периферна кръв, които са погълнали багрилото нитроблутетразол и са го редуцирали в цитоплазмата до тъмносини формазанови кристали. 24.2.2. Работи се с унифицирана методика за оцветяване на периферни гранулоцити с НБТ. 24.2.3. За всеки пациент се изготвят по две контролни натривки от инкубирана с буфер вместо с пирогенал клетъчна суспензия. 24.2.4. Лабораторията е в състояние да определи с помощта на спектрофотометър количеството на екстрахирания формазан, който е погълнат по време на фагоцитозата. 24.2.5. Всяко определяне на оксидативен взрив на периферни неутрофили и моноцити на пациенти включва проба на клинично здрав донор с нормални стойности на оксидативен взрив. 24.3. Флоуцитометричен тест: 24.3.1. Лабораторията е в състояние да определи процент фагоцитирали и оксидативно активни гранулоцити и моноцити и тяхната фагоцитарна и ензимна активност за единична клетка. 24.3.2. Използват се утвърдените флоуцитометрични техники за оптимално определяне на фагоцитоза и окислителен взрив на периферни неутрофили и моноцити. 24.3.3. Препоръчва се използването на стандартизирани обекти за фагоцитоза - E. coli, Staph. аureus, флуоресцентни микрочастици. 24.3.4. При оксидативния взрив се препоръчва използването и на слаб стимулатор като хемотактичния пептид fMLP. 24.3.5. Всяко определяне на фагоцитоза и окисидативен взрив на периферни неутрофили и моноцити на пациенти включва негативна контрола на проба на пациента на 0 °С. 25. Флоуцитометрично имунофенотипизиране на лимфоцити. 25.1. Лабораторията е в състояние да извършва имунофенотипизиране на лимфоцити в кръв и други биологични течности чрез флоуцитометрия. 25.2. Имунофенотипизиране с флоуцитометрия се провежда със съответно валидирана многоцветна имунофлуоресценция. 25.3. Имунофенотипизирането на лимфоцити чрез флоуцитометрия включва съпоставима изотипна контрола. 25.4. Всяко двуцветно имунофенотипизиране на лимфоцити в кръв чрез флоуцитометрия за количествени цели включва CD45 и CD14 антитела. 25.5. За количествено определяне на лимфоцитни популации чрез двуцветна имунофлуоресценция се използва следният стандартен набор: CD3+ Т лимфоцити CD3+CD4+ Т лимфоцити CD3+CD8+ Т лимфоцити CD19+ В лимфоцити CD3-CD16+ плюс CD56+ NK клетки (CD3-CD16+ или CD3-CD56+ типизиране е приемливо за определяне на NK клетки) 25.6. За проследяване броя на CD4+Т лимфоцити чрез флоуцитометрия панелът включва определяне най-малко на следните лимфоцитни субпопулации: CD3+ Т лимфоцити CD3+CD4+ Т лимфоцити CD3+CD8+ Т лимфоцити 25.7. За многоцветен анализ се използва CD45/SSC прозорец на лимфоцитите, базиран на силно светеща CD45+ популация с нисък SSC. 25.8. За многоцветен набор за маркиране изотипна контрола се използва за проби с трудно разграничими положителни от отрицателни популации. 25.9. За количествено определяне на дадена субпопулация чрез флоуцитометрия трицветният анализ следва да използва набор за маркиране, включващ: CD3/CD4/CD45 CD3/CD8/CD45 CD3/CD19/CD45 CD3/CD16+56/CD45. 25.10. За количествено определяне на дадена субпопулация чрез флоуцитометрия четирицветният анализ следва да използва набор за маркиране, включващ: CD3/CD4/CD8/CD45 CD3/CD56 ± CD16/CD19/CD45. 25.11. За три- или четирицветните набори се включват минимум две епруветки със същия маркер (напр. CD3 в епруветките с CD3/CD4/CD45 и CD3/CD8/CD45). 25.12. Всяка лаборатория може да използва допълнителни комбинации от моноклонални антитела за изследване на други маркери (клетъчни субпопулации) за нуждите на дианостично-лечебния процес. 25.13. Анализът обхваща най-малко 2000 лимфоцита в прозореца. 25.14. Лимфоцитната чистота в прозореца се определя за всички проби. 25.15. Лимфоцитният добив (процента на лимфоцитите, включени в аналитичния прозорец) се определя за всяка проба. 25.16. За двуцветен анализ всички стойности на лимфоцитите се коригират за лимфоцитна чистота. 25.17. Стойностите на CD3 се проследяват в лимфоцитния имунофенотипизиращ панел на пациента. 25.18. Сборът на лимфоцитите се проследява, когато всички лимфоцитни популации са включени в панела за лимфоцитен анализ. 25.19. Сумата на Т клетките (CD3+CD4+ плюс CD3+/CD8+) се проследява в рамките на лимфоцитния имунофенотипизиращ панел на пациента. 25.20. Лабораторията има възможности за определяне на бели клетки и ДКК, необходими за изчисление на абсолютния брой на лимфоцитни/левкоцитни субпопулации. Абсолютният брой на субпопулациите може да се определя и чрез индиректен метод с частици. 26. Флоуцитометрично имунофенотипизиране за левкемия/лимфом. 26.1. Лабораторията е в състояние да идентифицира и характеризира имунофенотипно чрез флоуцитометрия патологично разраснали хемопоетични клетки от различни линии на диференциация. 26.2. Пробите за изследване могат да бъдат получени от периферна кръв, костен мозък, ликвор, малигнени изливи, лимфни възли или туморни формации след изготвяне на клетъчна суспензия. 26.3. Лабораторията трябва да има възможности за морфологично и цитохимично изследване. Лабораториите, които не могат да проведат морфологичен анализ, създават добре функциониращ механизъм за комуникация със звена, осъществяващи морфологична оценка на същия клиничен материал. 26.4. Всяко несъответствие между данните от морфологичното и имунофенотипното изследване следва да бъде изяснено. 26.5. Препоръчва се при невъзможност за анализиране на пробата веднага след получаването й морфологичното изследване да се извърши два пъти - веднъж след получаване на пробата и втори път - непосредствено преди маркирането й. 26.6. Имунофенотипизирането на левкемии и лимфоми с флоуцитометрия се провежда минимум с валидирана двуцветна имунофлуоресценция (4-параметърна флоуцитометрия). С използването на 5- или 6-параметърен анализ се увеличава възможността за идентифициране и характеризиране на абнормна популация в рамките на хетерогенната проба. 26.7. Резултатите при повтарящото се антитяло (антитела) в рамките на тест панела на пациента са устойчиви (в границите на 5 %), освен ако рутинно не се получава по-голяма разлика поради използването на различни флуоресцентни маркери или антитела, разпознаващи различни антигенни епитопи. 26.8. Тест панелът се подбира така, че да включва поне един антиген с ярка експресия върху повечето клетки в пробата, какъвто е CD45. 26.9. Резултатите се представят като процент положително маркирани клетки в електронния прозорец на предполагаемите неопластични клетки и включват коментар за линейната принадлежност и степен на съзряване. 26.10. При получаване на абнормална реактивност (по-висок или по-нисък интензитет на светене от наблюдавания върху нормални клетки, аберантно съчетаване на линейно-асоциирани антигени и др.) резултатът трябва да включва и описание (слабо или с нисък интензитет и/или ярко или с висок интензитет, линейно-кръстосана или асинхронна експресия и т.н.). 27. Флоуцитометрично определяне на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки. 27.1. Лабораторията е в състояние да извършва определяне на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки в периферна кръв, костен мозък или кръв от пъпна връв чрез флоуцитометрия. 27.2. Определянето на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки с флоуцитометрия се провежда със съответно валидирана дву- или трицветна имунофлуоресценция. 27.3. Определянето на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки чрез флоуцитометрия не изисква включване на изотипна контрола. 27.4. Всяко двуцветно определяне на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки чрез флоуцитометрия включва CD45 и CD34 антитела. 27.5. За определяне на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки чрез флоуцитометрия се използват CD34 антитела само от клас II, конюгирани с фикоеритрин, или клас III независимо от вида на конюгата. 27.6. За определяне на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки чрез флоуцитометрия се използват CD45 антитела, които установяват не само всички изоформи, но и всички гликоформи на CD45 антигена. 27.7. Анализът включва минимум 100 CD34(+)-положителни събития или не по-малко от 75 000 CD45(+)-положителни събития във всяка епруветка. 27.8. Анализът се осъществява в две успоредно маркирани проби от един и същ клиничен материал и броят CD34(+) хемопоетични стволови клетки се определя като средна стойност от двата резултата. 27.9. Определянето на броя CD34(+) хемопоетични стволови клетки чрез флоуцитометрия изисква стратегия на последователно определяне на електронни прозорци за анализ: 27.9.1. за анализ се използва CD45/SSC прозорец, базиран на слабо светеща CD45(+) популация с нисък SSC; 27.9.2. използва се CD34/SSC прозорец, базиран на силно светеща CD34(+) популация с нисък SSC; 27.9.3. използва се FSC/SSC прозорец, базиран на популация с нисък SSC и нисък, но не по-нисък от този на лимфоцитите FSC; 27.9.4. определя се популация хемопоетични клетки със следните характеристики: нисък SSC и нисък FSC, но не по-нисък от този на лимфоцитите, силно светеща CD34(+) и слабо светеща CD45(+). 27.10. Резултатът се представя като процент CD34(+) хемопоетични стволови клетки, определен на базата на броя CD34(+) събития, отговарящи на критериите в 27.9.4, и броя CD45(+) събития (и в двата случая представени като средни стойности от анализа на две успоредно маркирани проби). 27.11. Абсолютният брой на CD34(+) хемопоетични стволови клетки може да се определя и чрез индиректен метод с частици. 28. Флоуцитометрично определяне на ин витро алерген специфична активация/дегранулация на базофили. 28.1. Лабораторията е в състояние да определя ин витро алерген специфична активация/дегранулация на базофилни гранулоцити чрез флоуцитометрия. 28.2. Пациентите, тестирани ин витро, не трябва да са приемали най-малко до 48 часа преди вземането на кръвната проба антиалергични лекарствени средства, като антихистамини, или да са преустановили преди два месеца приема на кортикостероиди. 28.3. На етапа стимулация на базофилите е недопустимо замърсяване на кръвните проби с въздушни алергени. Ин витро активацията се извършва в чисти помещения и закрити боксове. 28.4. Лабораторията установява подходящите концентрации за всеки нов алерген или за всяка нова партида алергени. 28.5. Всяко определяне на активация/дегранулация на базофили включва отрицателна и положителна контрола. Като положителна контрола се използва неспецифичен активатор (например хемотаксичен пептид fMLP). 28.6. Данните се събират през аналитичен прозорец за базофилната популация, експресираща високи нива на ИгЕ. 28.7. Изброяват се най-малко 1000 базофила за проба или 50 000 до 100 000 левкоцита при анализ на клетките според параметъра големина (FSC). 28.8. Определя се процентът на дегранулираните базофилни гранулоцити според експресията на активационния антиген gp 53 (CD63) след анализ на съответните контроли за всеки отделен пациент - отрицателна и положителна. 29. Определяне на HLA системата. 29.1. Терминологията на HLA антигените трябва да съответства на последния доклад на комитета по номенклатура към Световната здравна организация (СЗО). 29.2. Фенотипите и генотипите се означават съобразно препоръките на СЗО, напр.: 29.2.1. Единични алели: HLA-B*07. Единични антигени: HLA-B7 или само В7 в случай, че HLA се подразбира от контекста. 29.2.2. HLA тип. Серологично записване: HLA-A2, 30; B7, 44; Cw5. ДНК записване: НLA-A*02,*30; B*07,*44; C*05,*16; DRB1*01,*04; DQB1*05,*03:01. 29.2.3. Генотип. Серологично записване : HLA-A2, B44, Cw5 / A30, B7, Cw-, . ДНК записване: HLA-A*02, B*44, C*05, DRB1*01, DQB1*05 / A*30, B*07, C*16, DRB1*04, DQB1*03:01. 29.3. Ако е открит само един антиген или алел за даден локус чрез серологично или ДНК типизиране, той може да бъде записан два пъти във фенотипа само в случай, че хомозиготността е потвърдена чрез изследване на фамилии или типизирането недвусмислено показва носителство на 2 различни алела от една и съща специфичност (напр. DRB1*13:01/59, DRB1*13:03/33, специфичността се записва два пъти DRB1*13,*13). Каталог: wp-content -> uploads -> 2011 2011 -> Евгений Гиндев световната конспирация 2011 -> Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти 2011 -> Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти 2011 -> За минималния и максималния бал по паралелки в рио област софия-град 2011 -> 130 годишнината на ввму “Н. Й. Вапцаров” разкрива новите предизвикателства и перспективи в развитието на флагмана на морското образование 2011 -> Съюз на математиците в българия – секция бургас пробен изпит по математика за 7 клас – март, 2011 2011 -> Член на Приятели на Земята Интернешънъл 2011 -> Права и задължения на учениците 2011 -> В съответствие с ангажиментите в рамките на фаза 1 от мониторинга за изпълнение на задълженията по Конвенцията и Препоръката, през 2000 г 2011 -> Разграничение на трафика на хора от сродни престъпни дейности д-р Ива Пушкарова Изтегляне 0.68 Mb. Сподели с приятели:
|