Клинична имунология
Изтегляне 0.68 Mb.
|
|
29.3.1. Типизиране с висока разграничителна способност се дефинира като: а) определяне на HLA алелите с ниво на разграничаване, съответстващо на първото и второто поле (напр. DRB1*13:01) съгласно номенклатурата на СЗО и разграничаване на всички неразграничими комбинации, определени от полиморфизми в екзони 2 и 3 на HLA клас І локусите и екзон ІІ на HLA клас ІІ локусите, и б) разграничаване на всички нераразграничими комбинации, включващи нулев алел, независимо от това, къде е локализиран полиморфизмът, освен когато е доказано, че антигенът е експресиран върху клетъчната повърхност. 29.4. Определяне на хаплотипите. 29.4.1. Определянето на хаплотипите и генотипите се извършва чрез изследване на фамилията, включващо родители, сиблинги и/или деца на пациента. 29.4.2. Генотипна идентичност се доказва само при изследване и на двамата родители или когато сегрегацията на 4-те хаплотипа е ясно определена. 29.4.3. Наразграничими комбинации в хаплотипното разпределение се разграничават чрез типизиране по HLA-C и/или DQ и/или DР. Необходимо е типизиране с висока разграничителна способност за разрешаване на тези комбинации. 29.4.4. При установяване на рекомбинации те се посочват в резултата, включващ хаплотипното разпределение. 29.5. Неродствени индивиди. Определянето на най-вероятните хаплотипи, направено въз основа на популационни честоти, трябва да бъде ясно посочено. 29.6. Серологично HLA клас I типизиране: 29.6.1. Лабораторията трябва да е в състояние да определи HLA-A, В специфичностите, официално признати от СЗО. 29.6.2. Използват се утвърдените техники за оптималното определяне на HLA специфичностите. 29.6.3. Всяко типизиране включва поне по една положителна контрола - позитивен контролен серум, за който предварително е показано, че реагира с всички клетки. В случай че позитивната контрола не реагира както се очаква, резултатите от типизирането са невалидни. 29.6.4. Всяко типизиране включва поне един негативен контролен серум, за който предварително трябва да е показано, че не съдържа антитела. 29.6.5. Минималното количество живи клетки и реактивността на контролните серуми, изискващи се за валидност на серологичното типизиране, трябва да бъдат описани в лабораторния наръчник. 29.6.6. Всеки HLA-A, B, антиген се дефинира поне от два серума, ако и двата са функционално моноспецифични. При мултиспецифични серуми поне 3 частично неприпокриващи се серума се използват за определяне на всеки HLA-A, B антиген. 29.6.7. Неразграничими комбинации при серологичното типизиране се разграничават чрез ДНК метод. 29.6.8. Всяка нова партида типизиращи панели се тестува на поне 5 различни вида клетки с познати фенотипи, представящи основни специфичности или паралелно с вече тестувани панели. Всяка нова пратка от предварително тестувана партида типизиращи панели се верифицира с 1 вид клетки с познат фенотип. 29.6.9. Серологично определяне на единичен антиген (напр. HLA-B27) чрез лимфоцитотоксичен тест и флоуцитометрично. 29.6.9.1. Всяка партида моноклонални антитела или типизиращи плаки се тестува с контролните клетки: • контролите включват поне три вида клетки, експресиращи специфичния антиген; • контролите включват поне два вида клетки, експресиращи кръстосано реагиращ антиген; • контролите включват поне два вида клетки, които не експресират специфичния и кръстосано реагиращия антиген. 29.6.9.2. При лимфоцитотоксичния тест: • позитивната и негативната серумна контрола се тестуват по време на типизирането; • серумните контроли включват и два серума за всеки антиген, реагиращ кръстосано със специфичния; • серумите за дефиниране на всеки антиген съответстват на изискванията за серологично HLA типизиране. 29.6.9.3. При флоуцитометричния тест: • във всеки тест се използва негативна контрола, включваща моноклонално антитяло/антитела от същия вид и субклас, като моноклоналите, използвани за фенотипизиране; • при индиректно маркиране негативните контролни реагенти включват несъответстващо първо антитяло и съответното второ антитяло, белязано със същия флуорохром, използван в теста; • при директно маркиране негативните контролни реагенти включват несъответстващо антитяло, белязано с използвания в теста флуорохром; • всяка серия от тестове включва позитивна серумна контрола, за която е доказано, че реагира с всички HLA клас I антигени; • лабораторията трябва да има критерии за разграничаване на позитивните реакции; • в случай че се установи взаимодействие на моноклоналните антитела с антигени, различни от специфичните, трябва да съществува писмен протокол за начина на разграничаване на специфичен от неспецифичен антиген. 29.7. ДНК анализ: 29.7.1. Всички преамплификационни процедури се извършват само на определени за целта работни места. Препоръчителни са пространствено разделяне и ограничен поток на трафика. 29.7.2. В преамплификационната зона се използват само определени за целта оборудване, консумативи и лабораторно облекло. 29.7.3. Всички дейности, произтичащи от и включващи амплификация в PCR апаратите, се извършват в постамплификационната зона. 29.7.4. Методи, които използват двустъпална амплификация, предразполагат към грешки, свързани с PCR контаминация. Прибавянето на матрицата за втората амплификация е разделено физически от преамплификационното и постамплификационното работно място. Изисква се да се използват определени оборудване и консумативи. 29.7.5. Контрол за замърсяване ("wipe-test"). 29.7.5.1. Замърсяване се проследява при всички амплификационни процедури. 29.7.5.2. Рутинен wipe-test на преамплификационната зона и оборудване се извършва най-малко 1 път на всеки 2 месеца. Тестуване на другите зони е препоръчително. 29.7.5.3. Мониторирането на замърсяване се извършва по методи с чувствителност, съответстваща на рутинно използваните методи. 29.7.6. Оборудване и реактиви 29.7.6.1. Точността на PCR апаратите се верифицира чрез: поддръжка съобразно препоръките на производителя; проверка на функционирането на всеки апарат на 6-месечни интервали. 29.7.6.2. Инкубаторите и водните бани се контролират при всеки анализ. 29.7.6.3. Преди използване в рутинната работа всяка нова партида от реактивите и търговските китове се тестува. 29.7.6.4. За търговските китове се документират производител, партиден номер, срок на годност и условия на съхранение. 29.7.7. Праймери и сонди 29.7.7.1. Специфичностите на праймерите и сондите, позициите на праймерите и таргетните секвенции на сондите се документират. 29.7.7.2. Всеки партиден номер трябва да бъде тестуван върху поне една ДНК проба с известна специфичност. Интензитетът на сигнала трябва да бъде дефиниран, мониториран и да съответства на приемливото ниво. 29.7.7.3. Праймерите и сондите се използват при емпирично определени условия, осигуряващи специфичност в рутинното тестуване. 29.7.8. Изолиране на ДНК, електрофореза и анализ 29.7.8.1. Изолиране на ДНК 29.7.8.1.1. ДНК се изолира и пречиства по стандартен метод, който е документиран и валидиран в лабораторията. 29.7.8.1.2. Ако ДНК не се използва веднага след пречистване, лабораторията трябва да разполага с метод за съхранение, който запазва материала от деградиране. 29.7.8.1.3. ДНК трябва да бъде с достатъчна чистота и концентрация за осигуряване на надеждни резултати. 29.7.8.2. Електрофореза 29.7.8.2.1. Трябва да бъдат определени и документирани оптимални електрофоретични условия и приемливи граници. 29.7.8.2.2. Лабораторията установява критерии за приемане на всеки старт или капилярна гелна миграция. 29.7.8.2.3. Когато размерът на ампликона е критичен фактор при анализа, във всеки гел се включва маркер с размер на фрагментите, съответстващ на всички очаквани фрагменти. 29.7.8.3. Анализ 29.7.8.3.1. Приемливи граници на силата на сигнала се дефинират за определяне на позитивен и негативен резултат. 29.7.8.3.2. При мануално отчитане на позитивни/ негативни реакции и определяне на алелите при SSP и SSOP методите се извършват 2 независими интерпретации на първичните данни. При спешни ситуации е допустима 1 интерпретация. 29.7.8.3.3. Методът за определяне на алелите и алелната база данни се документират. 29.7.8.3.4. При неразграничим резултат всички възможни алелни комбинации се посочват в резултата. 29.8. Методи за типизиране 29.8.1. PCR-SSP 29.8.1.1. Всяка ампификационна реакция включва контрола за детекция на технически проблеми - вътрешна контрола (допълнителни праймери или матрица, които дават продукт, разграничим от специфичния амплификат). 29.8.1.2. При липса на специфичен амплификат и вътрешна контрола за дадена праймерна смес лабораторията трябва да има политика за приемане или отхвърляне на резултатите от типизирането. 29.8.1.3. Неспецифична или слаба амплификация и тенденция към образуване на праймерни димери трябва да бъдат документирани. 29.8.2. Секвениране 29.8.2.1.Матрицата за нуклеотидно секвениране се характеризира с достатъчна чистота, специфичност, количество и качество. 29.8.2.2. Пречистване на матрицата след амплификация се извършва за отстраняване на dNTP, Taq плимераза и амплификационни праймери. 29.8.2.3. Трябва да бъдат установени критерии за приемане на първичните резултати (интензитет на пиковете, флуктуации на базовата линия, форма на пиковете, точно определяне на константните позиции). 29.8.2.4. Съотношението сигнал/шум трябва да бъде достатъчно за надеждно определяне на нуклеотидите. 29.8.2.5. Методът за определяне на алелите се документира 29.8.2.6. Трябва да се използват методи, които да не допускат позициите, включени в амплификационните праймери, да се анализират при определянето на алелите. 29.8.2.7. Лабораторията документира базата данни, използвана при интерпретацията на данните. 29.8.2.8. Ако определената секвенция е неразграничима, крайният резултат посочва всички възможни алелни комбинации. 29.8.3. PCR-SSOP 29.8.3.1.Амплификацията се мониторира чрез гел-електрофореза преди извършване на хибридизация. 29.8.3.2. Всеки анализ включва вътрешна сонда, специфична за консервативен регион на амплифицирания продукт. 29.8.3.3. Всеки анализ включва съответни контроли за валидиране на хибридизацията и детекцията. 29.8.3.4. Всяка амплификация и хибридизация включва негативна контрола (без ДНК). 29.8.3.5. Автоматичните системи за хибридизация се калибрират най-малко 1 път в годината. 29.8.3.6. При използване на скенери се извършва второ визуално отчитане за потвърждаване на данните. 29.8.3.7. При автоматизирано отчитане всички критични елементи, оказващи влияние върху функционирането на машината, трябва да бъдат мониторирани. Лабораторията документира функционалната проверка на апаратурата. Почистването и калибрирането на флоуцитометър подобните инструменти се извършва и документира преди използването им. 30. Определяне на циркулиращи алоантитела 30.1. Лабораторията има документирана политика за оценяване сенсибилизацията на всеки пациент от времето на първоначалното характеризиране. 30.2. Лабораторията има програма за регулярен скрининг на серуми от всеки пациент за антитела срещу HLA антигени съобразно изискванията за трансплантация на органи и медицински стандарт "Имунологична подготовка при трансплантация на органи, тъкани и клетки". 30.3. Лабораторията разполага с документация за потенциално сенсибилизиращи събития на всеки пациент. Серумите след всяко от тези събития се тестуват за антитела срещу HLA антигени и се съхраняват за бъдещ кросмач. 30.4. Определя се и се документира специфичността на HLA антигени, срещу които са насочени откритите антитела. Необходимо е да бъдат разграничени антителата срещу HLA антигени от антитела с друга специфичност. 30.5. Използва се класическата комплемент-зависима лимфоцитотоксична техника и/или друга техника с чувствителност, еквивалентна или по-висока от тази на цитотоксичната. 30.6. За откриване на антитела срещу HLA клас II антигени се използва техника, която ги разграничава от антитела срещу HLA клас I антигени. 30.7. Панелът от HLA антигени включва достатъчен брой донори, за да се обхване най-голям брой антигенни специфичности и да се осигури съответствие на разпределението им в популацията. Броят на индивидите и на антигенните специфичности се документира. 30.8. Комплемент зависим лимфоцитотоксичен тест: 30.8.1. Във всяка плака се включва HLA специфична положителна контрола за активността на комплемента и отрицателна контрола за жизнеспособността на тестуваните клетки. 30.8.2. ИгГ и ИгM положителни контроли се включват, ако серумите се изследват след третиране с дитиотреитол (ДТТ). 30.9. Микросферов тест: 30.9.1. Лабораторията има утвърдена процедура за контролиране на неспецифичното свързване на антитела към таргетните микросфери. 30.9.2. Всяко изследване задължително включва отрицателна контрола - серум от неалоимунизиран човешки донор(и). 30.9.3. Всяко изследване включва положителна контрола - серуми от алоимунизирани индивиди, за които е документирано, че реагират с HLA антигени. Антителата са от подходящия за изследването изотип. 30.9.4. Лабораторията трябва да има изработени критерии за разграничаване на позитивните от негативните реакции. 30.10. Имуноензимен тест. 30.10.1. Всяко изследване на алоантитела чрез ИЕМ включва отрицателна и положителна серумна контрола както при микросферовия анализ. 30.10.2. Контрола без HLA антиген се включва в тест-системата. 30.10.3. Лабораторията документира свой собствен праг на сигнификантни нива на антитялово свързване. 31. Определяне на тъканна съвместимост чрез кросмач реакция. 31.1. Кросмач реакцията се извършва проспективно. 31.2. Използват се техники с еквивалентна чувствителност на скриниращия алоантителата тест. Могат да бъдат използвани тестове с доказана повишена чувствителност в сравнение с основния микролимфоцитотоксичен тест, напр. удължена инкубация, усилване на реакцията с антиглобулин или флоуцитометрия. 31.3. Лабораторията може да определя T- и B-клетъчен кросмач. 31.4. Лабораторията може да диференцира положителен кросмач, дължащ се на алоантитела, от този, дължащ се на автоантитела. 31.5. Серумите, взети на 14-ия ден след сенсибилизиращо събитие, се включват в кросмач реакцията преди трасплантация. 31.6. Лабораторията има утвърдена политика за подбор на положителни исторически серуми за тестуване в кросмач реакцията при сенсибилизирани реципиенти. 31.7. Лимфоцитотоксичен кросмач: 31.7.1. Във всяка плака се включва HLA специфична положителна контрола за активността на комплемента и отрицателна контрола за жизнеспособността на донорните лимфоцити. 31.7.2. ИгГ и ИгM положителни контроли се включат, ако кросмачът се извършва след третиране на серумите на пациентите с ДТТ. 31.8. Флоуцитометричен кросмач: 31.8.1. Препоръчва се многоцветна техника. 31.8.2. Свързването на човешкия имуноглобулин се установява чрез флуорохром-белязан F(ab')2 античовешки ИгГ. 31.8.3. Всяко изследване включва отрицателна и две положителни (силна и слаба) контроли. 31.8.4. Контролният нормален човешки серум е от неимунизирани, здрави индивиди и доказано флоуцитометрично негативен срещу човешки левкоцити. 31.8.5. Позитивната контрола включва човешки серуми, съдържащи антитела от определен изотип, специфични за HLA антигените или всякакви други алоантигени, които са от значение за кросмача. Позитивната контрола би трябвало да реагира с всички човешки лимфоцити. 31.8.6. Всяка лаборатория установява собствен праг за позитивен кросмач. Всяка значителна промяна в протокола или апарата изисква повторно характеризиране на позитивния праг. 32. Определяне на тумор-асоциирани антигени в серум. 32.1. Лабораторията е в състояние да изследва туморни маркери по един от утвърдените методи: РИА, ИЕМ, хемилуминесценция. 32.2. Изследването на туморни маркери за диагностично уточняване и контрол на лечението включва: 32.2.1. преди провеждане на терапия - изследване на най-подходящия маркер за вида и локализацията на тумора; 32.2.2. при отсъстващо или недостоверно повишаване стойностите на маркера може да се изследва маркер на втори избор; 32.2.3. повторно изследване на маркера се препоръчва не по-рано от 14 - 20 дни след терапевтичната интервенция; 32.2.4. в зависимост от промените в стойностите на туморния маркер в сравнение с предтерапевтичните и/или при промяна на терапевтичното поведение се изработва индивидуална схема за конкретния пациент за честотата на проследяване на маркера. 32.3. Всяко изследване включва контролни концентрации на дадения туморен маркер, вкл. серум с липса на маркера. По получените стойности от изследването на контролни концентрации се построява кривата за отчитане на резултатите. 32.4. При всяко изследване се използва един и същ серум с известна концентрация на маркера, като полученият резултат трябва да попада в указаните граници. 33. Определяне на хормони 33.1. Използва се международно приетата номенклатура на методите за анализ на хормони. 33.2. Полуколичествените методи (хроматографски принцип на тест ленти) се използват като диагностичен ориентир (скрининг тест). При получаване на резултати извън границите на нормата се използват количествени методи: радиоимунологичен анализ (РИА), имуно-радиометричен анализ (ИРМА), ензимно-имунен анализ (ЕИА), имуно-ензимен анализ (ИЕА), флуоро-имунен анализ (ФИА), имуно-флуорометричен анализ (ИФМА), луминесцентно-имунен анализ (ЛИА), имуно-луминесцентен анализ (ИЛМА). 33.3. Изборът на метод за анализ на хормони се съобразява с определени изисквания: 33.3.1. по отношение на чувствителност методите се нареждат по следния начин ЕИА = ИЕА < РИА < ИРМА = ИЛМА = ЛИА = ФИА = ИФМА; 33.3.2. за всеки вид хормон съобразно неговата структура, транспортни белтъци и пр. има оптимален вид анализ, който има предимства пред другите независимо от горепосочения ред. 33.4. Стриктно се спазват условията за вземане и съхранение на пробите при всеки отделен хормон. 33.5. Лабораторията може да определя количествено и полуколичествено стероидни хормони (кортизол, 17-ОН прогестерон, дехидроепиандростерон-сулфат, алдостерон и техните метаболити в кръвен серум, плазма и урина) по една от утвърдените техники. 33.6. Лабораторията може да определя количествено, а където е необходимо - и полуколичествено, репродуктивни хормони - естрадиол, прогестерон, тестостерон и техни метаболити в кръвен серум, плазма и урина, по една от утвърдените техники. 33.7. Лабораторията може да определя количествено тиреоидни хормони (общ трийодтиронин и тироксин, свободен трийодтиронин и типоксин, трийодтиронин-обратен, тиреоглобулин) в кръвен серум или плазма по една от утвърдените техники. 33.8. Лабораторията може да определя хипофизни хормони (адренокортикотропен хормон, тиреоид-стимулиращ хормон, соматотропен хормон, пролактин, фоликулостимулиращ хормон, лутеинизиращ хормон) по една от утвърдените техники: 33.8.1. Полуколичествените методи на тест ленти могат да се използват за скринингови цели и първоначален диагностичен ориентир. 33.8.2. При отклонение на резултата от нормалните стойности лабораторията може да анализира пробата по един от количествените методи: ФИА, ИЛМА, ИРМА. 33.9. Лабораторията може да определя инсулин и С-пептид и е препоръчително определянето на глюкагон в серум или плазма по една от утвърдените техники (ЕИА, МЕИА, РИА, DELFIA) за количествено определяне. Полуколичествените методи на тест ленти не се препоръчват. 34. Имунохистохимично и имуноцитохимично изследване. 34.1. Лабораторията е в състояние да идентифицира и локализира антигени в тъканни срези и цитологични препарати чрез съответно имунохистохимично или имуноцитохимично маркиране с антитела, използвани като специфични реагенти в антиген-антитяло реакция и последваща визуализация посредством флуоресцентни бои или ензимни системи. 34.2. Всяко изследване включва положителна и отрицателна контрола. 34.3. Фоновото маркиране се намалява максимално чрез специфично блокиране на ендогенните субстрати в зависимост от използваната визуализираща система. 34.4. Като отрицателна контрола на неспецифичното свързване на антителата се използват контролни изотипни антитела, специфични спрямо антигени, които не се срещат и не могат да бъдат индуцирани в тъкани на бозайници. 34.5. Като отрицателни контроли на имунохистохимичното или имуноцитохимичното изследване с цел оценка на наличието на ендогенен субстрат на визуализиращата система в изследваните тъкани или клетки успоредно се инкубират препарати от изследвания материал, при които е пропуснато първичното антитяло. 34.6. Като положителна контрола се използват тъкани или клетки, за които е известно, че са положителни за тествания антиген. При изследване на левкоцитни антигени хемопоетичната тъкан предоставя вътрешни положителни контроли за използваните антилевкоцитни антитела. 34.7. Лабораторията има възможности за морфологично изследване. Лабораториите, които не могат да проведат морфологичен анализ, създават добре функциониращ механизъм за комуникация със звена, осъществяващи морфологична оценка на същия клиничен материал. Каталог: wp-content -> uploads -> 2011 2011 -> Евгений Гиндев световната конспирация 2011 -> Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти 2011 -> Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти 2011 -> За минималния и максималния бал по паралелки в рио област софия-град 2011 -> 130 годишнината на ввму “Н. Й. Вапцаров” разкрива новите предизвикателства и перспективи в развитието на флагмана на морското образование 2011 -> Съюз на математиците в българия – секция бургас пробен изпит по математика за 7 клас – март, 2011 2011 -> Член на Приятели на Земята Интернешънъл 2011 -> Права и задължения на учениците 2011 -> В съответствие с ангажиментите в рамките на фаза 1 от мониторинга за изпълнение на задълженията по Конвенцията и Препоръката, през 2000 г 2011 -> Разграничение на трафика на хора от сродни престъпни дейности д-р Ива Пушкарова Изтегляне 0.68 Mb. Сподели с приятели:
|