Действие
|
От кого се извършва
|
Кога се извършва
|
Как се извършва
|
1. Подготовка на серумни проби
|
лаборант
|
В началото на реакцията
|
За всяка ямка за проба са необходими 4 μl кръвен серум. Може да се тества пресен, охладен или замразен по-рано серум.
|
2. Подготовка на млечни проби
|
|
В началото на реакцията
|
За всяка ямка за проба са необходими 100 μl обезмаслено мляко. Пробите от мляко трябва да се центрофугират в продължание на 15 минути при 2000 об/ мин за отстраняване на липидния слой.
|
3. Подготовка на PBS- Tween буфер
|
|
В началото на реакцията
|
20х концентриран разтвор на PBS-Tween се разрежда 1:20 в дестилирана вода.
За една плака са необходими 500 мл разтвор, който се получава чрез прибавяне на 25 мл концентриран PBS-Tween разтвор към 475 мл дестилирана вода и внимателно разбъркване.
Ако в стъклото с 20х концентриран разтвор на PBS-Tween има кристали, то се затопля и се разклаща добре до разтварянето им.
|
4. Разтваряне на HRP- конюгат
|
|
Приготвя се непосредствено преди употреба
|
Лиофилизираният HRP конюгат се разтваря с 11,5 мл PBS-Tween буфер. Оставя се за 1 мин и се разбърква внимателно.
Ако остане неупотребен разтворен конюгат, може да се съхранява при -20 оС и да се замразява и размрaзява отново до 3 пъти.
|
5. Темпериране
|
|
Преди употреба
|
Всички реактиви трябва да се темперират до стайна температура, 18-25оС
|
6. Прибавяне на PBS- Tween буфер
|
|
След темпериране
|
Прибавят се по 100 μl PBS-Tween буфер във всяка ямка, която ще се използва за серумни проби и серумни контроли
|
7. Прибавяне на серумни контроли
|
|
След прибавяне на PBS- Tween буфер
|
Прибавят се по 4 μl серумна положителна контрола и по 4 μl серумна отрицателна контрола в съответните избрани ямки, покрити с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва серумните контроли да се тестват в по две ямки
|
8. Прибавяне на серумна проба
|
|
След прибавяне на серумни контроли
|
Прибавят се 4 μl серумна проба в избрана ямка покрита с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва серумните проби да се тестват в по две ямки.
|
9. Прибавяне на млечни контроли
|
|
След прибавяне на серумна проба
|
Прибавят се по 100 μl млечна положителна контрола и по 100 μl млечна отрицателна контрола в съответните избрани ямки, покрити с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва млечните контроли да се тестват в по две ямки
|
10. Прибавяне на обезмаслено мляко
|
|
След прибавяне на млечни контроли
|
Прибавят се 100 μl проба от обезмаслено мляко в избрана ямка покрита с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва пробите да се тестват в по две ямки
|
11. Разклащане
|
|
След прибавяне на мляко
|
Старателно се разклаща и се покрива
|
12. Инкубиране
|
|
След разклащане
|
Инкубира при 37оС в продължение на 1 час.
|
13. Промиване
|
|
След инкубиране
|
Следва трикратно промиване с PBS-Tween буфер и внимателно се отстраняване на всички остатъци от течността чрез почукване на плаката
|
14. Прибавяне на HRP- конюгат
|
|
След промиване
|
Прибавят се във всички ямки по 100 μl HRP конюгат
|
15. Инкубиране
|
|
След прибавяне на HRP конюгат
|
Плаката се инкубира при 37оС в продължение на 1 час
|
16. Промиване
|
|
След инкубиране
|
Трикратно промиване с PBS-Tween буфер и внимателно се отстраняване на всички остатъци от течността чрез почукване на плаката
|
17. Прибавяне на субстратен разтвор
|
|
След промиване
|
Прибавят се по 1000 μl субстратен разтвор във всяка ямка
|
18. Инкубиране
|
|
След прибавяне на субстратен разтвор
|
При стайна температура в продължение на 10 минути. Времето започва да се отчита след напълването на първата ямка.
|
19. Стопиране на реакцията
|
|
След инкубиране
|
Реакцията се стопира чрез прибавяне по 50 μl блокиращ разтвор във всички ямки и внимателно разбъркване.
|
20. Измерване на оптична плътност
|
|
След стопиране на реакцията
|
Оптичната плътност (OD) на контролите и пробите се измерва с ELISA ридер с дължина на вълната 450 nm в рамките на 15 минути, след добавяне на блокиращия разтвор.
|
21. Оценяване на резултатите
|
|
След измерване на OD
|
Критерии за валидност на серумния тест- За да се гарантира валидността, серумната положителна контрола трябва да има стойност на OD > 0,6, а серумната отрицателна контрола трябва да има стойност на OD < 0.2. При невалидни тестове, анализите се повтарят.
Изчисляване на кътоф стойността при серумни проби
А= ОD стойност на отриц. контрола х 2.0
Ако А > 0.2, то А се използва за кътоф стойност
Ако А < 0.2, то 0.2 се използва за кътоф стойност
Критерии за валидност на млечния тест- За да се гарантира валидността, млечната положителна контрола трябва да има стойност на OD > 0,3, а млечната отрицателна контрола трябва да има стойност на OD < 0,15. При невалидни тестове, анализите се повтарят
Изчисляване на кътоф стйността при млечни проби
А= ОD стойност на отриц. контрола х 2.0
Ако А >0.1, то А се използва за кътоф стойност
Ако А < 0.1, то 0.1 се използва за кътоф стойност
Тълкуване на резултатите
-
всички проби с OD стойност > кътоф стойността се смятат за положителни;
-
всички проби с OD стойност < кътоф стойността, се смятат за отрицателни.
|