Механизми на анти-туморно и имунно-модулиращо действие с гъбни полизахариди

Гъбните полизахариди проявяват анти-туморното си действие предимно чрез активиране на имунния отговор на организма на приемника. Тези съставки са смятани за модификатори на биологичния отговор (biological response modifiers – BRMs; Wasser and Weis 1999). Това основно означава, че те: (1) не предизвикват вреда и не поставят допълнителен стрес върху тялото; (2) помагат на тялото да се адаптира към различни биологични и други стресове, присъщи на средата; и (3) прилагат неспецифично действие върху тялото, поддържайки някои или всички основни системи, вкл. нервна, хормонална и имунна система, както и регулиращите функции (Brekhman 1980).

Имунно-модулиращото действие на гъбните полизахариди е особено ценно като профилактична, лека и неагресивна форма на лечение, както и при профилактика от метастазни тумори, и др., описани по-горе. Полизахаридите от гъби не атакуват пряко раковите клетки, а произвеждат техни анти-туморни ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Това беше доказано в много експерименти, например загубата на анти-туморния ефект на полизахариди в неонатални thymectomized мишки или след администриране на анти-лимфоцитен серум (Ooi and Liu 1999). Тези резултати предполагат, че анти-туморното действие на полизахаридите изисква незасегнат компонент на T-клетка, и че действието се предава чрез имунен механизъм, зависещ от тимуса. Освен това, анти-туморното действие на лентинана и други полизахариди е забавено чрез предварително третиране с антимакрофагни агенти (като карагенан). Така че, смята се, че различните ефекти на полизахаридите се дължат на засилване на отговора на предшестващи Т-клетки и макрофаги към цитокини, произведени от лимфоцити след специфично разпознаване на туморните клетки (Hamuro and Chihara 1985). Като допълнение, въвеждането на подчертано увеличение в количествата на CSF, IL-1, и IL-3 от полизахариди водят до узряване, разграничаване и разпространение на имунно-способните клетки за защитни механизми на приемника (Hamuro and Chihara 1985). Гъбните полизахариди са известни като стимулатори на естествените клетки убийци, Т-клетки, В-клетки, и отговорите на имунната система, зависима от макрофаги.

Лентинан е известен с възможността си да възстановява подтиснатата дейност на помагащите Т-клетки в приемника, притежаващ тумор, до нормалното им състояние, водещо до пълно възстановяване на хуморални имунни отговори (Ooi and Liu 1999). Същият ефект важи за PSK, докато той няма съществени ефекти върху имунните отговори в приемника при нормални условия.

Инфилтрацията на еозинофили, неутрофили и гранулоцити около целевите тъкани също се засилва от лентинан. Той активира отделянето на активен кислород и производството на цитокини в перитонеалните макрофаги. Лентинан увеличава също цитотоксичността на перитонеалните макрофаги срещу метастазни тумори; той може да активира нормалните и алтернативни пътеки на допълнителната система и може да раздели C3 на C3a и C3b, засилвайки активирането на макрофаги (Aoki 1984; Wasser and Weis 1997a; Hobbs 2000).

Имунно-активиращата способност на лентинана може да се свърже с неговата модулация на хормонални фактори, които играят роля в туморния растеж. Aoki (1984) показа, че анти-туморното действие на лентинана е силно намалено с администриране на тироксин или хидрокортизон. Лентинанът може също да възстанови специфичната за тумора анти-ген ориентирана реакция на хиперчувствителност от забавен тип.

Schizophyllan активира макрофагите (ин витро и ин виво), което води до засилване действията на Т-клетките и увеличава чувствителността на цитотоксични LAK и NK клетки към IL-2 (Mizuno 1996). Въпреки че е структурно свързан с лентинана, schizophyllan не активира пряко Т-клетките (Hobbs 1995). Възможните пътеки на такива действия на лентинана са описани в Chihara (1981) и Hamuro and Chihara (1985), и прегледани от Wasser and Weis (1999), а тези за β-D-глюкан BRMs (Mizuno 2002) са показани на фиг. 2 и фиг. 3, Приложение 2.

Избрани примери на важни медицински гъби с анти-туморни полизахариди в плодните тела и култивирания мицел

Нашата група изследва един от най-важните ядливи и медицински биотехнологични сорта, известен като A. blazei. Анализът на данните за култивираната гъба, произхождаща от Бразилия, и изследването на типов материал от A. blazei Murrill показват драматични разлики между тях. На основата на съществуващи различия беше предложено правилното име на ширококултивираната гъба да бъде нов за науката сорт Agaricus brasiliensis (S. Wasser et al). A. blazei е северно-американският ендемичен некултивиран сорт, известен само от три местности – една във Флорида и две в Южна Каролина (Wasser et al. 2002).

Ксилоглюкан (Xyl:Glc, морално съотношение =2:10), съдържащ 9% протеин, получен чрез фракционизиране и пречистване на екстракт от A. blazei, показа съществено действие срещу Сарком 180 при мишки (Mizuno 2002).

Не само плодните тела, а и култивираният мицел от A. blazei, са източник на анти-туморни полизахариди. Анти-туморна органична съставка, наречена ATOM, беше получена от A. blazei (Iwade strain 101), която е PSPC (Ito et al. 1997). Друг PSPC, 0041, беше получен от потопена мицелна култура; основните компоненти на този полизахарид са глюкоза и маноза (Hikichi et al. 1999). Наскоро беше отделен нов анти-туморен полизахарид срещу Сарком 180 от течен култивиран мицел на A. blazei: β-(1→2)-; β-(1→3)-глюкоманан (Tsuchida et al. 2001). Този полизахарид изглежда напълно различен от анти-туморните полизахариди от плодните тела на A. blazei (Mizuno et al. 1999b).

Филтрат във водна среда, отделен от мицел след потопено култивиране на A. blazei, съдържаше манан-протеинов комплекс (AB-FP) с молекулно тегло 10⁵–10⁷ Da и малко количество глюкоза, галактоза и рибоза. Добивът на AB-FP беше 575 мг/1 филтрат във водна среда, и съдържа съществено анти-туморно действие (Mizuno 2002).

Следователно, анти-туморните полизахариди, изследвани в плодното тяло на A. blazei, мицелни култури или произведени екстраклетъчно в културна среда, имат различни химични структури. Полизахаридите от плодните тела показаха глюкани с различни видове връзки на единици глюкоза или хетероглюкани; мицелните култури съдържаха глюкоманани, а манан-протеинови комплекс беше произведен в културна среда при потопено култивиране.

Ganoderma tsugae е друга медицинска гъба, чиито полизахариди са добре изследвани и в плодното тяло, и в мицела. От 14 водоразтворими и 15 водонеразтворими фракции от плодните тела на G. tsugae, бяха получени 7 гликани със силни анти-туморни действия (Wang et al. 1993). Водоразтворимите фракции бяха протеин-съдържащи глюкогалактани, свързани с маноза и фукоза, а водонеразтворимите фракции представяха протеин-съдържащи β-(1→3)-глюкани с различно протеиново съдържание.

От мицела на G. tsugae бяха получени 16 водоразтворими полизахариди и изследвани за анти-туморни ефекти върху Сарком 180 при мишки (Zhang et al. 1994b). Получените 3 активни полизахариди бяха: гликан-протеинов комплекс, съдържащ 9.3% протеин, с хетерополизахарид, съставен от маноза and ксилоза; a глюкан-протеинов комплекс, съдържащ 25.8% протеин; и гликан-протеин с глюкоза като основен компонент, и свързан с арабиноза, маноза, ксилоза и галактоза. Сравнение на активни водоразтворими полизахариди, получени от плодно тяло и мицел, показаха, че тези от плодното тяло бяха глюкогалактанпротеин комплекси, а тези от мицел бяха хомоглюкан-протеинови комплекси или хетерогликан, съставен от маноза и ксилоза.

За разлика от състава на полизахарида в плодното тяло, не са открити β-глюкан сред анти-туморните активни фракции, получени от културен мицел (отгледани върху Whatman филтърна хартия, напоена с течна хранителна среда), събран преди началото на плодните тела (Mizuno and Zhuang 1995). Във водоразтворимите фракции бяха открити фукогалактоманан-протеинов комплекс, глукогалактоманан, маногалактофукан, и галактоглукоманофукан-протеинов комплекс. Във водонеразтворими фракции бяха открити манофукоглукоксилан, маноглукофукоксиланпротеин комплекс, манофукоглукоксилан-протеинов комплекс, и глукоманофукоксилан-протеинов комплекс (Zhuang et al. 1994a). Следователно, полизахариди от G. frondosa са хетероманани, хетерофукани и хетероксилани, или техни комплекси с протеини, т.е. видове полизахариди, които не бяха намерени в плодните тела на тази гъба.

Трябва да кажем, че полизахаридната структура в култивирания мицел може да зависи от структурата на хранителната среда, използвана за култивиране. Така Ohno и колеги (1985, 1986) стигнаха до извода, че анти-туморният глюкан грифолан, получен от култивиран мицел на G. frondosa, е β-(1→3)-, β-(1→6)-глюкан, същият като този в плодното тяло на гъбата. В този експеримент чиста култура беше отгледана в течна среда в стационарна култура или с клатене. Полученият мицел беше допълнително култивиран за 3 дни в buffer, състоящ се от глюкоза (5%) и лимонова киселина, pH 4.5. Анти-туморно активните β-(1→3)-, β-(1→6)-глюкани бяха получени чрез екстракция на мицел, отгледан в хранителна среда и чрез алкохолно утаяване на buffer supernatant (Adachi et al. 2002).

Броят на полизахаридите, получени от плодни тела или култивиран мицел от същия сорт, зависи много от използвания метод на фракцинизиране, но по принцип общият брой на полизахаридите в плодните тела е по-висок (вж. табл. 4, Приложение 1).

Броят на фракциите, показани на табл. 4, включва в някои случаи не само окончателно пречистени полизахариди, а и някои междинни фракции, които бяха тествани за анти-туморно действие.

Съотношението на биологично активни полизахаридни фракции в плодни тела и култивиран мицел е много високо. Така 20 от 29 полизахаридни фракции, получени от плодното тяло на G. frondosa, показаха различни нива на анти-туморно действие (Mizuno et al. 1986), а 24 от 29 полизахаридни фракции, получени от култивиран мицел на същата гъба, показаха анти-туморно действие (Zhuang et al. 1994a).

Общият брой на полизахаридите, получени от плодното тяло, по принцип е по-висок от тези, получени от култивиран мицел. Например, общо водоразтворимите и водонеразтворими полизахариди, получени от склеротум на I. obliquus, са 2-3 пъти повече от тези, получени от култивиран мицел (вж. табл. 5, Приложение 1).

Заключение

Higher Basidiomycetes гъби са все още далеч недостатъчно изследвани; дори списъкът с известните сортове е непълен, включващ може би само 10% от реалния брой съществуващи сортове (Hawksworth 2001; Kirk et al. 2001). Броят на гъбите с известни фармакологични качества е още по-малък. Въпреки всичко сортовете, изследвани досега, представляват голям източник на анти-ракови и имунно-стимулиращи полизахариди. Много, ако не всички гъби Basidiomycetes съдържат биологично активни полизахариди. От 651 сорта и 7 инфраспецифични таксони от 182 вида higher Hetero- и Homobasidiomycetes, огромно мнозинство съдържат фармакологично активни полизахариди в плодни си тела, култивирани мицели или култивиран бульон (Reshetnikov et al. 2001).

Гъбните полизахариди имат различен химичен състав, предимно принадлежащи към групата на β-глюкани (Mizuno 1999a, 2000). Анти-туморните полизахариди от различни гъби са обособени според техните молекулни тегла, степен на разклоняване и по-висока (третична) структура. Очевидно е, че такива структурни характеристики като β-(1→3) връзки в основната верига на глюкан и допълнителни β-(1→6) разклонени точки са необходими за анти-туморното действие. β-глюканите, съдържащи предимно (1→6) връзки, имат по-слабо действие. Глюканите с високо молекулно тегло изглежда са по-ефективни от тези с ниско молекулно тегло (Mizuno 1996, 1999a, b). За разлика от β-(1→3)-глюкани, α-(1→3)-glucuronoxylomannans, които са характерни за желираните гъби, не зависят много от молекулното тегло.

Съществуват различни подходи за подобряване анти-туморното действие на гъбните полизахариди чрез химична модификация, която е необходима и за подобряване на техните клинични качества, разтворимост във вода и възможност за проникване през стомашните стени след орално поглъщане. Двете основни процедури за химично подобряване са: модификация на гъбните полизахариди чрез разграждане на Смит (oxydo-reductohydrolysis) и активиране чрез метода на формолиза. Най-успешните схеми за такива методи са били разработени за Ganoderma lucidum, Grifola frondosa и Leucopaxillus giganteus (= Tricholoma gigantea). Карбоксиметилация е друг химичен метод, който трансформира β-глюкани във водоразтворима форма.

Голям брой експериментални и клинични данни показват полезните резултати на гъбните полизахариди за следните цели: (1) предпазване от онкогенезис чрез орално консумиране на гъби или техните препарати; (2) пряко анти-туморно действие срещу различни алогенни и сингенни тумори; (3) имунно-засилващо действие срещу тумори заедно с химиотерапия; (4) превантивни ефекти върху туморни метастази. Повечето от клиничните данни идват от търговските полизахариди лентинан, PSK (krestin), и schizophyllan, но съществуват също забележителни нови данни за полизахариди от Phellinus linteus, Flammulina velutipes, Hypsizygus marmoreus, A. blazei и други.

Биохимичните механизми, които пренасят биологичното действие на полизахаридите, са все още недостатъчно изучени. Полизахаридите от гъби не атакуват раковите клетки пряко, а произвеждат техни анти-туморни ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Анти-туморното действие на полизахаридите изисква непокътнат компонент на Т-клетки; тяхното действие се пренася чрез имунен механизъм, зависещ от тимуса (Borchers et al. 1999). Гъбните полизахариди са известни като стимулиращи естествените клетки убийци, Т-клетки, В-клетки и макрофаг-зависещи отговори на имунната система. Имунно-модулиращото действие на гъбните полизахариди е особено ценно като средство за профилактика, лека и неагресивна форма на третиране, предпазване от метастазни тумори и като лечение заедно с химиотерапия.

Сред higher Basidiomycetes гъби са открити много биологично активни полизахариди, а тяхното практическо приложение зависи не само от уникалните им свойства, а и от биотехнологичната наличност. Изолацията и пречистването на полизахариди от гъбен материал са сравнително лесни и ясни, и могат да се извършват с минимални усилия (Mizuno 1996, 1999a). Мицелите, формирани от отглеждане на чисти култури в потопени условия, са с постоянен състав, а потопената култура е най-добрата техника за получаване на правилни и безопасни гъбни продукти (Wasser et al. 2000; Reshetnikov et al. 2001).

Приложение 1

Таблица 1