Медицинска генетика
Изтегляне 0.54 Mb.
|
|
6. Качествен контрол Лабораторията задължително участва в система за външна оценка на качеството. 6.1. Контролни материали се получават и анализират ежемесечно и получените резултати се изпращат на контролната лаборатория, която ги оценява и връща с обратен резултат. 6.2. При установени отклонения лабораторията следва протоколите за ВКК и анализира източника на грешка с цел неговото отстраняване, което се отразява в лабораторните журнали. 6.3. Протоколите с анализираните проби се съхраняват като хартиен носител. В края на годината контролната лаборатория издава документ за оценка на качеството на извършваните анализи. Д. Специфични изисквания за провеждане на молекулярно-генетични изследвания и съхранение на генетичен материал в ДНК банка 1. Определение Молекулярно-генетичната диагностика е анализ на човешка ДНК, РНК и белтъци с цел откриване на изменения, свързани с проявата на генетични заболявания или генетични предразположения. 1.1. Лабораторията отговаря на всички критерии, залегнали в раздел ІV А. 1.2. Резултатите от молекулярно-генетичните изследвания са "лични данни" по смисъла на Закона за защита на личните данни. 1.3. Молекулярно-генетичните лаборатории в лечебни заведения могат да поддържат ДНК банка. 2. Човешки ресурси Съгласно раздел ІV, буква "А", т. 2. 3. Квалификация 3.1. Ръководител на молекулярно-генетична диагностична лаборатория е лекар с призната медицинска специалност по профила на лабораторията. 3.2. Специалистът е лекар с призната специалност (клинична лаборатория или друга по профила на лабораторията) или лекар, биолог, химик, фармацевт. 3.3. Медицинският лаборант трябва да притежава бакалавърска степен "медицински лаборант" или такава в областта на биологичните и химични науки. 3.4. Техническият секретар трябва да притежава средно образование и сертификат за компютърна грамотност. 4. Работна площ 4.1. Работна площ от минимум 90 м2, разпределена в самостоятелно обособени помещения: 4.1.1. За приемане, регистриране и разпределяне на материалите. 4.1.2. За документиране, разпечатване на резултати, архивиране и съхранение на документацията. 4.1.3. Работното лабораторно пространство трябва да има 5 основни физически разделени помещения: за изолирането на ДНК или РНК от биологичен материал; за приготвяне на реактиви и добив на дестилирана и дейонизирана вода; за подготовка на пробите за амплификация; за амплификация; за анализ на продуктите от амплификацията. 4.2. Лабораторията може да разкрива манипулационна и към нея следните задължителни помещения: 4.2.1. Чакалня с достатъчно седящи места. 4.2.2. Тоалетна за пациенти. 4.2.3. Помещение за вземане на кръв и кожни биопсии. 4.3. Помещение за хладилниците, камерите за дълбоко замразяване и съдовете за течен азот (в случаите на ДНК банка) трябва да бъдат следени ежедневно. 4.3.1. Записващи термометри са препоръчителни за механичните камери за дълбоко замразяване и хладилници. Препоръчва се те да бъдат свързани с алармена система, инсталирана на място, където може да се чува 24 часа в денонощието. 4.3.2. В лабораториите, използващи тeчeн азот за съхранение на замразени клетки, нивото на течния азот трябва да бъде следено на интервали с цел осигуряване на адекватното му подаване през цялото време. 4.3.3. Температурата на околната среда и/или температурата в инкубаторите, в които се извършват отделните етапи на изследванията, трябва да бъдат следени ежедневно и да съответстват на температурните интервали, посочени в работните инструкции. 5. Задължителен обем от дейности, които трябва да извършва молекулярно-генетична диагностична лаборатория 5.1. Изолиране на ДНК/РНК от биологичен материал. 5.2. Амплификация на специфични генетични локуси с полимеразно-верижна реакция. 5.3. Електрофоретично разделяне на нуклеинови киселини. 5.4. Рестрикционен анализ. 5.5. Основни видове хибридизационни методи на нуклеинови киселини. 5.6. Анализ на полиморфизми. 5.7. Възможност за директно автоматично секвениране или фрагментен анализ или експресионен анализ. 6. Минимална, задължителна лабораторна апаратура за молекулярно-генетична лаборатория
7. Аналитични принципи за извършване на ДНК изследвания за медицински цели 7.1. Методите трябва да са разработени и валидизирани в лабораторията. Използват се комбинации от реактиви, които могат да бъдат доставени от различни производители. Всяка лаборатория определя специфичните характеристики за дадения генетичен анализ съобразно изследваната популация от пациенти. Аналитичната и клинична валидизация на анализа се извършва и документира от лабораторията. 7.2. Изследванията, използващи готови търговски набори, са изцяло осигурени от конкретния производител. 7.3. Всички търговски набори, използвани за диагностични цели, трябва да съдържат информация за чувствителност, специфичност и надеждност на използвания анализ за конкретната диагностика и СЕ марка. 8. Подходи за молекулярно-генетични анализи за диагностични цели 8.1. Директният ДНК анализ за диагностични цели при заболявания с висока алелна хетерогенност трябва да позволява откриването на не по-малко от 80 % на молекулните дефекти, свързани с конкретното заболяване. 8.1.1. Известните молекулни дефекти са тези, за които има данни в HUGO MUTATION DATABASE. Всички методи, използвани за търсене на известни мутации, трябва да позволяват категоричното доказване на конкретен молекулен дефект. За това е необходимо използването на съответните референтни контроли (специфични мутации в хомо- и хетерозиготно състояние и нормална контрола). 8.1.2. Новооткритите секвенционни варианти, за които няма данни в HUGO MUTATION DATABASE, се приемат за молекулни дефекти, имащи отношение към определена патология, ако: е доказана косегрегацията с изследваното заболяване в семейството; мутацията не е открита в изследвана контролна група лица, доказано здрави по отношение на изследваната патология (Броят на лицата в контролната група зависи от честотата на заболяването. Например за заболявания с честота 1:10 000 се изследват минимум 100 здрави индивида.); мутацията е доказана в два независими амплификационни продукта; доказана е връзката й с патологията чрез експресионен анализ; променят еволюционно консервативна аминокиселина. 8.2. Индиректен подход е този, при който в изследваното семейство се проследява косегрегацията на заболяването с полиморфни маркери от болестния локус. 9. Общи аналитични изисквания към диагностичните ДНК методи 9.1. За диагностични цели могат да се използват следните биологични материали: 9.1.1. Кръвни проби с обем не по-малък от 2 милилитра в епруветки с EDTA антикоагулант. Кръвните проби могат да бъдат съхранявани и транспортирани не повече от 48 часа при температура 4° - 8° С. Съсирени кръвни проби не подлежат на анализ. 9.1.2. Амниотична течност - минимум 5 милилитра. Амниотичната течност може да бъде съхранявана и транспортирана не повече от 48 часа при температура 4° - 8° C. Амниотична течност с примес на кръв не подлежи на ДНК анализ. 9.1.3. Култивирани клетки - минимум 1x106 клетки. Те трябва да бъдат съхранявани и транспортирани в стерилна среда, при температура 4° - 8° C за не повече от 48 часа. 9.1.4. Некултивирани клетки (букална лигавица, цервикални, уретрални и др.) се взимат и транспортират съгласно указанията на конкретната лаборатория. 9.1.5. Тъканен материал - минимум 5 милиграма. Хорионните въси трябва да бъдат предварително очистени от децидуа. Те трябва да бъдат съхранявани и транспортирани в стерилна среда или физиологичен разтвор при температура 4° - 8° C за не повече от 48 часа. Фиксирани тъкани са приложими за анализ само в определени случаи, посочени от конкретната лаборатория. 9.1.6. Кръв, накапана върху специална филтърна бланка (от масовия неонатален скрининг). 9.2. Изолирането на ДНК/РНК от биологичен материал трябва да бъде извършвано със стандартизирани методики на базата на публикуваните в литературата данни или следвайки инструкциите на производителя при използването на готови набори. 9.3. Количеството на ДНК/РНК трябва да бъде измерено спектрофотометрично. Изолираната ДНК трябва да бъде съхранявана на -20° С (за ДНК банка при -70° С) под 96 % етилов алкохол или разтворена в специален буфер. Работните количества трябва да бъдат съхранявани на температури не по-високи от 4° C. 10. Изисквания към контролните материали 10.1. Подбор и приготвяне на контроли. В рамките на едно изследване основно се използват: (А) отрицателни контроли, (Б) положителни контроли, (В) контроли за диагностични маркери, (Г) контроли за определяне на молекулния размер на изследваните проби. 10.2. Точната нуклеотидна последователност на използваните ДНК сонди или зародиши (праймери) трябва да бъде документирана по изискванията на геномнитe бази данни или публикации в специализираната литература. Синтетичните олигонуклеотиди трябва да бъдат съпроводени с пълна техническа информация от страна на производителя. 11. Полимеразно-верижна реакция (PCR) 11.1. Препоръчително е използването на физични и/или биохимични бариери за предотвратяване на ДНК контаминация. Преамплифкационните процедури трябва да бъдат извършвани в помещение за подготовка на пробите за амплификация, където не се разрешава внасянето на амплификационни продукти. Предимство е физическо разделяне и ограничен поток на трафика, както и използване на ламинарен бокс. 11.2. При амплификация на ДНК/РНК се използват консумативи за еднократна употреба. 11.3. Като амплификационна матрица може да се използва ДНК или РНК /кДНК (от всеки тип ядрени клетки). При използване на РНК е необходимо включване на подходящи контроли за обратната транскрипция. 11.4. Подготовката на проби за амплификация, амплификацията и анализът на амплификационните продукти трябва да се извършват в отделни помещения. 11.5. Методи, които използват ре-амплификация, предразполагат към грешки, свързани с PCR-контаминация. Прибавянето на матрицата за втората амплификация да бъде разделено физически от преамплификационното работно място. 11.6. Изисква се да се използват индивидуални пипети на всяко работно място. 11.7. Всяка нова партида сонди (праймери) трябва да бъде проверена върху референтен материал за потвърждаване на специфичността и количеството на продукта. 11.8. Контрола за реактивите (без нуклеинови киселини) трябва да бъде включена във всяко изследване, използващо полимеразно-верижна реакция. Друга отрицателна контрола може да включва отворена епруветка на работното място. 11.9. Лабораторията трябва да има критерии за приемане или отхвърляне на специфичността на амплификацията. 11.10. В случай, че амплификационният продукт е краен резултат от анализа, е необходимо използване на подходящи положителни и отрицателни контроли за установяване на евентуална неуспешна амплификация във всяка амплификационна смес. 11.11. Условията за амплификация (напр. типът полимераза, концентрация на полимеразата, концентрация на нуклеозидтрифосфатите, концентрация на терминаторите) трябва да бъдат съобразени с вида на матрицата (напр. дължина на секвенцията, GC-съдържание). 12. Електрофоретично разделяне на ДНК/РНК върху агарозни и полиакриламидни гелове носители 12.1. Условията за разделяне трябва да бъдат предварително установени и потвърдени експериментално в лабораторията. 12.2. Концентрацията на използваните носители трябва да осигурява максимална разделителна способност за определяне на съответния вид проби. 12.3. Визуализацията на пробите може да бъде извършвана по различни начини и трябва да бъде фотодокументирана. 12.4. За всяка анализирана серия трябва да бъдат използвани молекулни свидетели или подходящи контроли за определяне на размера на пробите. 13. Рестрикционен анализ 13.1. Използването на специфични рестриктази за директен или индиректен ДНК анализ трябва да бъде основано на литературни данни или преки доказателства, гарантиращи правилната интерпретация на резултатите. 13.2. Задължително е използването на стандартизирани контроли във всяка изследвана серия, позволяващи отчитането на всички алелни варианти на локуса. 13.3. Задължително е използването на молекулен свидетел, съдържащ фрагменти, кореспондиращи максимално близко на очакваните алелни варианти. 14. Хибридизация с алелспецифични олигонуклеотиди (Southern хибридизация) 14.1. Рестрикционният анализ на изолирана ДНК трябва да бъде извършен съгласно възприетите лабораторни протоколи. 14.2. Качеството на рестрикционната реакция трябва да бъде удостоверено чрез проверка върху агарозен гел с използването на молекулни стандарти. 14.3. Преди подготовката на мембраната за пренос гелът трябва да бъде фотодокументиран. 14.4. Преносът върху мембрана трябва да бъде извършен съгласно възприети протоколи. 14.5. Хибридизацията трябва да се извършва съгласно възприети лабораторни протоколи. 14.6. При хибридизация трябва да се използват възприети за съответния анализ контроли. 14.7. Резултатите трябва да бъдат фотодокументирани и съхранявани в протоколи, придружаващи всяка анализирана серия. 15. Анализ на микросателити, минисателити и еднонуклеотидни замени 15.1. За изследване на ДНК фрагменти, съдържащи мини, микросателити и еднонуклеотидни замени, трябва да бъдат установени подходящи електрофоретични условия (напр. температура, сила на тока, продължителност на електрофорезата, буфер), позволяващи разграничаването на всички, различаващи се по дължина, алелни форми в изследвания локус. Условията трябва да бъдат протоколирани за всяка електрофореза. 15.2. Задължително е използването на контроли във всяка изследвана серия, позволяващи отчитането на наблюдаваните алелни варианти в локуса, а при многоалелните локуси (микро- и минисателити), използвани за идентификационни цели - използването на алелни свидетели, съдържащи всички чести алели в изследвания локус. 15.3. За целите за идентификация на индивида установените алели на високополиморфните (многоалелни) ДНК локуси трябва да се описват според общоприетата международна номенклатура, за да могат резултатите, получени в различни лаборатории, да бъдат съпоставими. 15.4. Отчитането и определянето на алелите трябва да бъде извършвано от двама специалисти, независимо, невключващи началника на лабораторията. 15.5. При количествено определяне на доза на даден алел трябва да се използват контроли, приготвени в същата аналитична серия. Освен визуалното интерпретиране на резултатите трябва да бъде извършено и денситометрично определяне със специализирана за този вид изследване компютърна програма. 15.6. Статистическата интерпретация на случаите на неизключване при определяне на спорен родителски произход трябва да отразява последните международни изисквания (популационни данни за съответната етническа група от българската популация, отчитане на майчиния генотип при определени алелни комбинации, използването на специфични формули при отсъствие на един от родителите от анализа и др.). 16. Директно автоматично секвениране на ДНК 16.1. Матрицата за секвениране трябва да се характеризира със съответна специфичност (напр. локусна или алелна специфичност), количество и качество. Методът за подготовка на матрицата трябва да осигурява секвенционна матрица с достатъчна дължина, която не съдържа инхибитори на секвенционните реакции и замърсявания и не трябва да оказва влияние върху точността на секвенцията (напр. мутации, възникнали при клониране, преференциална амплификация). 16.2. Диагностичният анализ на секвенциите трябва да се основава на данни от двете комплементарни вериги на ДНК. При наличие на секвенционна вариация анализът се потвърждава чрез повторно секвениране на новогенериран амплификационен продукт. 16.3. При установяване на алел, за който няма информация в геномната база данни, той трябва да се потвърди с повторно секвениране на новогенерирана матрица. 16.4. Всяка анализирана секвенция трябва да бъде сравнена с нормална контролна ДНК или с нуклеотидните последователности, регистрирани в най-актуалните версии на геномните бази данни. 16.5. Трябва да се избягва интерпретирането на резултати от секвенционни реакции, съдържащи "стопове", компресии или други артефакти. 16.6. При използване на автоматични секвенатори флуоресцентно белязаните нуклеотиди или зародиши трябва да бъдат съобразени с параметрите на апарата. 16.7. Всички секвенции трябва да бъдат съхранявани върху електронен носител не по-малко от 2 години. 16.8. Установени със секвениране молекулни дефекти, имащи отношение към заболяването, трябва да бъдат документирани с отпечатен резултат и приложени към досието на пациента. 16.9. Отбелязването на установените молекулни варианти трябва да бъде извършвано съгласно препоръките на HUGO. 16.10. Секвенциите трябва да бъдат анализирани от двама квалифицирани специалисти независимо, като единият от тях не включва началника на лабораторията. 17. Специфични изисквания за съхранение на генетичен материал в ДНК банка 17.1. Определение: В ДНК банката се съхранява ДНК, изолирана от биологичен материал, и информация за здравословното състояние и начина на живот на индивиди с цел извършване на бъдещи генетични изследвания за определяне на генетичен риск и генетична предразположеност за заболявания на донорите на ДНК и/или техните потомци и извършване на бъдещи диагностични и научни геномни и фармакогеномни проучвания. 17.2. Статут на ДНК банката. 17.2.1. ДНК банка се разкрива към лаборатория в лечебно заведение, извършваща молекулярно-генетична диагностика 17.2.2. ДНК банката отговаря на общите изисквания, посочени в раздел ІV А 17.3. Помещение и минимално оборудване Каталог: media -> filer public -> 2015 2015 -> Наредба за изменение и допълнение на наредба №36 от 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти 2015 -> М и н и с т е р с т в о н а з д р а в е о п а з в а н е т о н а р е д б а 2015 -> Наредба №25 от 10 ноември 2008 Г. За условията и реда за пускане в действие на медицински изделия без наличие на условията по чл. 8 От закона за медицинските изделия 2015 -> Наредба №1 от 10 октомври 2007 Г. За проучване, ползване и опазване на подземните води 2015 -> Наредба №9 от 12 февруари 2010 Г. За максимално допустимите стойности на вибрациите в жилищни помещения 2015 -> Име на проекта Паралелка/Клас 2015 -> Наредба №39 от 13 септември 2007 Г. За принципите и изискванията за добрата дистрибуторска практика 2015 -> Наредба №38 от 13 септември 2007 Г. За изискванията към данните върху опаковките и в листовките на лекарствените продукти 2015 -> Наредба №26 от 14 юни 2007 г за предоставяне на акушерска помощ на здравно неосигурени жени и за извършване на изследвания извън обхвата на задължителното здравно осигуряване на деца и бременни жени Изтегляне 0.54 Mb. Сподели с приятели:
|