Доклад за извършените изследвания, както и тяхното изчерпателно описание. Посочената информация не се изисква, когато е изпълнено едно от следните условия

Резултатите от изследването дават информация за потенциала на активното вещество да предизвиква дразнене на кожата, в това число, където е приложимо, за възможната обратимост на наблюдаваното въздействие.

Преди да се предприемат изследвания на активното вещество in vivo за оценка на неговото корозивно/дразнещо действие се извършва анализ на съществуващите данни за химичното вещество, които имат отношение към това действие, чрез подхода „значимост на доказателствата“. Когато липсват достатъчно данни, те могат да се получат чрез извършване на последователно изпитване.

Използва се многоетапен подход на изпитване:

1. 
   оценка на оказваното върху кожата корозивно действие, като се използва метод за изпитване in vitro с доказана достоверност;
   
2. 
   оценка на оказваното върху кожата дразнещо действие, като се използва метод за изпитване in vitro с доказана достоверност (напр. модели на възстановена човешка кожа);
   
3. 
   първоначално изследване за дразнещо действие върху кожата in vivo с използване на едно животно, при което изследване не се наблюдава неблагоприятно въздействие;
   
4. 
   изпитване за потвърждаване върху едно или две допълнителни животни.
   

Дразнещото действие на активното вещество върху кожата се отчита винаги. Когато е налично, изследване на токсичността при проникване през кожата, при което е доказано, че при равнище на граничната изпитвателна доза от 2000 mg/kg телесно тегло не се получава дразнене на кожата, се използва за освобождаване от задължението да се извършват изследвания за токсичност при проникване през кожата.

Резултатите от изследването дават информация за потенциала на активното вещество да предизвиква дразнене на очите, в това число, където е приложимо, за възможната обратимост на наблюдаваното въздействие.

Преди да се предприемат изследвания на активното вещество in vivo за оценка на неговото корозивно/дразнещо действие върху очите, извършва се анализ на съществуващите данни за химичното вещество, които имат отношение към това действие, чрез подхода „значимост на доказателствата“. Когато се прецени, че наличните данни не са достатъчни, те могат да се получат чрез извършване на последователно изпитване.

Използва се многоетапен подход на изпитване:

1. 
   извършва се изпитване in vitro за дразнещо/корозивно действие, за да се предскаже дразнещото/корозивното действие върху очите;
   
2. 
   извършва се утвърдено или прието изпитване in vitro за дразнене на очите с цел да се открият вещества със силно дразнещо/корозивно действие (напр. изпитване на непрозрачност и пропускливост на говеждата роговица (НПГР), изпитване с изолирани птичи очи (ИПО), изпитване с изолирани заешки очи (ИЗО), изпитване с кокоши яйца — изпитване с хорионово-алантоисна мембрана (ИКЯ—ХАМ), а при получаване на отрицателни резултати — оценка на дразненето на очите с използване на метод на изпитване in vitro за откриване на недразнещи и дразнещи вещества, а когато не е налично такова изпитване,
   
3. 
   първоначално изследване за дразнене на окото in vivo с използване на едно животно, при което изследване не се наблюдава неблагоприятно въздействие,
   
4. 
   изпитване за потвърждаване върху едно или две допълнителни животни.
   

Способността на активното вещество да предизвиква дразнене на очите се подлага винаги на изпитване, освен ако въз основа на включените в методите за изпитване критерии не се преценява, че е вероятно да има сериозно засягане на очите.

С изпитването се предоставя достатъчно информация, за да се оцени потенциалът на активното вещество да предизвиква реакции на сенсибилизация на кожата.

Изпитването се извършва винаги, освен ако активното вещество е известно със сенсибилизиращото си действие. Използва се изследване на локалните лимфни възли (ИЛЛВ), включително, където е подходящо, съкратен вариант на изследването. Ако не може да се извърши ИЛЛВ, се представя обосновка и се извършва максимизиращ тест с морски свинчета. Ако е налично изпитване (максимизиращо или по Buehler), което удовлетворява насоките на ОИСР и дава ясен резултат, не се извършват по-нататъшни изпитвания по съображения за хуманно отношение към животните.

Тъй като активно вещество, което е идентифицирано като сенсибилизиращо, може да предизвика реакция на свръхчувствителност, се взема предвид потенциалната респираторна сенсибилизация, когато са налице подходящи изпитвания или когато има сведения за поява на респираторна сенсибилизация.

5.2.7. Фототоксичност

С изследването се предоставя информация за способността на някои активни вещества да предизвикват цитотоксичност в съчетание със светлина, например активни вещества, които са фототоксични in vivo след системна експозиция и разпределение върху кожата, както и активни вещества, които имат дразнещо действие в съчетание със светлина след прилагане върху кожата. Положителният резултат се взема предвид при разглеждане на вероятността за експозиция на човека.

Изследване in vitro се изисква, когато активното вещество поглъща електромагнитно лъчение в обхвата 290—700 nm и е вероятно да достигне до очите или до изложени на светлина области на кожата както чрез пряк контакт, така и чрез системно разпределение.

Ако коефициентът на молекулярна екстинкция/абсорбция в ултравиолетовия/видимия обхват на активното вещество е по-нисък от 10 L × mol^-1 × cm^-1, не се изисква извършване на изпитване за токсичност.

5.3. Краткосрочна токсичност

Изследванията за краткосрочна токсичност се разработват така, че да предоставят информация за количеството активно вещество, което може да се понася, без да се предизвиква неблагоприятно въздействие при условията на изследването, и да разкриват опасностите за здравето при по-високи дози. Този род изследвания предоставят полезни данни за рисковете за лицата, които манипулират или използват продукти за растителна защита, съдържащи активното вещество, както и за други потенциално изложени групи. По-специално, изследванията за краткосрочна токсичност дават ценни сведения за възможността за натрупващо се въздействие на активното вещество и за рисковете за лицата, които могат да бъдат изложени на него. Освен това, изследванията за краткосрочна токсичност осигуряват полезна информация за разработването на изследвания за хронична токсичност.

Изследванията, данните и информацията, които се предоставят и оценяват, са достатъчни, за да позволят да се идентифицира въздействието при многократна експозиция на активното вещество, и по-специално да се установят или посочат:

а) връзката между дозата и неблагоприятното въздействие;

б) токсичността на активното вещество, включително, ако е възможно, равнището без наблюдавано неблагоприятно въздействие (NOAEL);

в) прицелни органи, където е приложимо (в това число имунна, нервна и ендокринна система);

г) еволюцията във времето и характеристиките на неблагоприятното въздействие с изчерпателно описание на измененията в поведението и възможни патологични констатации при преглед post mortem;

д) предизвиканите специфично неблагоприятно въздействие и патологични промени;

е) когато е приложимо — запазването и обратимостта след прекратяване на приема на някои констатирани прояви на неблагоприятно въздействие;

ж) ако е възможно, начинът на токсично действие;

з) относителната опасност, която съответства на различните начини на експозиция;

и) при необходимост, значимите съществени крайни точки в подходящите моменти за определяне на референтни стойности.

В изследванията за краткосрочна токсичност се включват токсикокинетичните данни (т.е. данните за концентрацията в кръвта). За да се избегне увеличаването на използването на животни, данните могат да се извличат от изследвания за определяне на обхвата.

Ако нервната, имунната или ендокринната система са обект на специфично проучване в рамките на изследвания на краткосрочната токсичност при равнище на дозите, при което не се предизвиква явна токсична реакция, извършват се допълнителни изследвания, в това число функционални изпитвания (вж. точка 5.8.2).

Отчитат се 28-дневни изследвания, когато такива са налични.

Винаги се отчита краткосрочната токсичност при приемане през устата на активното вещество както за гризачи (обикновено плъхове — използването на други видове гризачи се обосновава), така и за различни от гризачи животни (90-дневно изпитване върху кучета).

В рамките на 90-дневното изследване внимателно се следи възможната проява на невротоксично и имунотоксично въздействие, на генотоксичност, изразена чрез образуване на микроядра, както и на въздействие, което потенциално може да бъде свързано с изменения в хормоналната система.

5.3.3. Други начини на приемане

Обстоятелства, при които е необходимо изпитване

Извършването на допълнителни дерматологични изследвания за оценка на риска при човека се разглежда за всеки конкретен случай, освен ако активното вещество има силно дразнещо действие.

За летливите активни вещества (налягане на парите >10^–2 Pa) се изисква експертна преценка (напр. въз основа на специфични за начина на приемане данни за кинетиката), за да се вземе решение дали да се извършат изследвания за краткосрочна токсичност чрез експозиция при вдишване.

5.4. Изследване за генотоксичност

Изпитването за генотоксичност се извършва с цел:

• 
  да се предскаже потенциалът за генотоксичност;
  
• 
  да се идентифицират на ранен етап генотоксични канцерогенни вещества;
  
• 
  да се изясни механизмът на действие на някои канцерогенни вещества.
  

Възможно е структурата на молекулата да наложи специални изисквания за изпитванията във връзка с фотомутагенността. Ако коефициентът на молекулярна екстинкция/абсорбция в ултравиолетовия/видимия обхват на активното вещество и основните му метаболити е по-нисък от 1000 L × mol^-1 × cm^-1, не се изисква извършване на изпитване за фотомутагенност.

Винаги се извършват следните in vitro изпитвания за мутагенност: изпитване върху бактерии за генна мутация, съчетано изпитване за структурни и бройни хромозомни аберации в клетки от бозайници, и изпитване за генна мутация в клетки от бозайници.

Ако обаче в група изпитвания, състоящи се от тест на Еймс и изпитване in vitro за наличие на микроядра (ИВНМ), бъдат открити генна мутация и кластогенност/анеуплоидия, не е необходимо да се извършват допълнителни изпитвания in vitro.

Ако при изпитване in vitro за наличие на микроядра има признаци на образуване на такива, извършват се допълнителни изпитвания с подходящи процедури за оцветяване, за да изясни дали има анеугенна или кластогенна реакция. Може да се разгледа възможността за по-нататъшни изследвания, с които се цели да определи дали има достатъчно доказателства за наличието на прагов механизъм и прагова концентрация за анеугенната реакция (по-специално за неразделяне на хромозомите).

Активни вещества, които имат силно бактериостатично действие, доказано при изпитване за определяне на обхвата, се подлагат на две различни изпитвания in vitro върху клетки от бозайници за определяне на способността им да предизвикват генни мутации. Предоставя се обосновка, ако не се извърши тест на Еймс.

За съдържащи структурни признаци на токсичност активни вещества, които са показали отрицателни резултати при стандартната група изпитвания, може да се наложи извършването на допълнителни изпитвания, ако стандартните изпитвания не са били оптимизирани за посочените признаци. Изборът на допълнително изследване или на изменения на плана за изследването зависи от химичното естество, известната реакционна способност и данните за метаболизма на съдържащото структурни признаци на токсичност активно вещество.

Ако всички резултати от изследванията in vitro са отрицателни, извършва се най-малко едно изследване in vivo, при което се доказва експозиция на изпитваната тъкан (напр. цитотоксичност или токсикокинетични данни), освен ако са получени потвърдени данни за микроядра от изпитване in vivo при изследване с многократна доза и ако изпитването in vivo за микроядра е подходящото изпитване за удовлетворяване на това изискване за информация.

Отрицателният резултат в първото изпитване in vivo върху соматични клетки предоставя достатъчно сигурност по отношение на активни вещества, за които са получени отрицателни резултати в трите изпитвания in vitro.

За активни вещества, за които при някое от изпитванията in vitro са получени нееднозначни или положителни резултати, естеството на необходимите допълнителни изпитвания се разглежда за всеки конкретен случай, като се взема предвид цялата съществена информация и се използва същата крайна точка, както при изпитването in vitro.

Ако изпитването in vitro за хромозомни аберации при бозайници или изпитването in vitro за микроядра дава положителен резултат за кластогенност, се извършва изпитване in vivo за кластогенност в соматични клетки, напр. анализ на метафазата в костен мозък от гризачи или изпитване за микроядра у гризачи.

Ако е получен положителен резултат при изпитването in vitro за микроядра за откриване на бройни хромозомни аберации в клетки от бозайници или ако изпитването in vitro с хромозоми от бозайници дава положителен резултат за изменения в броя на хромозомите, се извършва изпитване in vivo за наличие на микроядра. При положителен резултат от изпитването in vivo за наличие на микроядра се използва подходяща процедура за оцветяване, напр. флуоресцентна in-situ хибридизация (FISH) за идентификация на анеугенна или кластогенна реакция.

Ако и двете in vitro изпитвания дават положителен резултат, се извършва изпитване in vivo за проучване на индуцирането на генна мутация, напр. изпитване за генни мутации в соматични и зародишни клетки у трансгенни гризачи.

При извършването на изпитвания in vivo за генотоксичност се използват само подходящи пътища и методи на експозиция (напр. смесване с храната, с водата за пиене, прилагане върху кожата, вдишване и хранене със сонда). Необходими са убедителни доказателства, че съответните тъкани ще бъдат достигнати с помощта на избрания път за експозиция и метод на прилагане. Използването на други техники за експозиция (напр. интраперитонеална или подкожна инжекция), които могат да доведат до необичайна кинетика, разпределение и метаболизъм, се обосновава.

Обръща се внимание на извършването на изпитване in vivo като част от едно от изследванията на краткосрочната токсичност, описани в точка 5.3.

5.4.3. Изследвания in vivo върху зародишни клетки

Обстоятелства, при които е необходимо изпитване

Необходимостта от извършване на тези изпитвания се разглежда за всеки отделен случай, като се вземе предвид информацията относно токсикокинетиката, употребата и вероятната експозиция.

За повечето признати за мутагенни за соматичните клетки in vivo активни вещества не са необходими по-нататъшни изпитвания за генотоксичност, тъй като те ще бъдат разглеждани като потенциално генотоксични и канцерогенни и потенциално мутагенни за зародишните клетки.

При някои специфични случаи обаче могат да се предприемат изследвания със зародишни клетки, за да покаже дали вещество, което има мутагенно действие върху соматичните клетки, има такова действие и върху зародишните клетки.

Типът на предизвиканите при по-ранните изследвания мутации, а именно — бройни и структурни изменения на хромозомите, се взема предвид при избора на подходящото изпитване.

Може също да се разгледа възможността за извършване на изследване за наличието на ДНК адукти в гонадни клетки.

Резултатите от извършените и отчетени изследвания за дългосрочна токсичност, които се вземат предвид заедно с други важни данни и сведения за активното вещество, са достатъчни за определяне на въздействието на многократната експозиция на активното вещество, и по–специално са достатъчни, за да се:

• 
  идентифицират случаите на неблагоприятното въздействие от дългосрочна експозиция на активното вещество;
  
• 
  идентифицират прицелните органи, когато е приложимо;
  
• 
  установи зависимостта доза-реакция;
  
• 
  установи NOAEL и, ако е необходимо, други подходящи референтни стойности.
  

а) идентифицира канцерогенното въздействие на дългосрочната експозиция на активното вещество;

б) определи спецификата на предизвиканите тумори с оглед на вида, пола и засегнатия орган;

в) установи зависимостта доза-реакция;

г) установи, когато е възможно, максималната доза без канцерогенно въздействие;

д) определи, когато е възможно, начинът на действие и значимостта за човека на всяка установена канцерогенна реакция.

Определят се дългосрочната токсичност и канцерогенността на всяко активно вещество. Ако при извънредни обстоятелства тези изследвания се обявят за излишни, за това твърдение се предоставя изчерпателна обосновка.

Изследванията за дългосрочна токсичност при приемане през устата и изследванията за дългосрочна канцерогенност (две години) на активното вещество се извършват, като за опитни животни се използват плъхове; когато е възможно, двата вида изследвания се съчетават.

Извършва се второ изследване за канцерогенност на активното вещество, като за опитни животни се използват мишки, освен ако може да бъде научно обосновано, че това не е необходимо. В подобни случаи вместо второ изследване за канцерогенност могат да се използват научно утвърдени алтернативни модели на канцерогенност.

Ако сравнителни данни за метаболизма показват, че плъховете или мишките не са подходящи модели за оценка на риска от рак у човека, се разглежда възможността за използване на други видове.

Предоставят се данните от изпитванията, в това число изясняването на задействания възможен начин на действие и приложимостта към човека, ако се смята, че начинът на канцерогенно действие не е свързан с генотоксичност.

Когато се представят контролни данни за минали периоди, те се отнасят до един и същ вид и една и съща порода животни, които са се намирали при сходни условия в една и съща лаборатория и са получени от изследвания, извършени по едно и също време. Като допълнителна информация могат да се отчитат отделно и други контролни данни за минали периоди от други лаборатории.

Информацията по отношение на предоставените контролни данни за минали периоди съдържа:

а) идентификация на вида и породата, името на доставчика и идентификация на конкретната колония, ако доставчикът работи в няколко географски ареала;

б) името на лабораторията и датите, на които е направено изследването;

в) описание на общите условия, при които са били държани животните, включително вида или марката на храната и, ако е възможно, консумираните количества;

г) приблизителната възраст, изразена в дни, и теглото на животните от контролната група в началото на изследването и на датата на умъртвяване на животните или на тяхната смърт;

д) описание на схемата на смъртност на контролната група, констатирана по време на изследването или в края му, както и други важни наблюдения (например болести, инфекции);

е) името на лабораторията и на научните работници, натоварени със събирането и тълкуването на патологоанатомичните данни от изследването;

ж) становище за естеството на туморите, които са могли да се комбинират и да доведат до някои от данните за последиците.

Контролните данни за минали периоди се представят за всяко конкретно изследване, като се посочват абсолютни стойности, както и процентни и относителни или преработени стойности, ако те са от полза за изготвянето на оценката. Ако се представят комбинирани или обобщени данни, те съдържат информация за обхвата на стойностите, средната стойност, медианата и, ако е приложимо, стандартното отклонение.

Изпитваните дози, включително най-високата изпитана доза, се подбират въз основа на резултатите от изпитванията за краткосрочна токсичност и въз основа на данните за метаболизма и тези от токсикокинетиката, ако такива са налични към момента на планиране на съответните изследвания. При избора на доза се вземат предвид данните за токсикокинетиката, напр. насищане на абсорбцията, измерено чрез системната наличност на активното вещество и/или метаболитите.

Дози, които предизвикват прекалена токсичност, не се смятат за подходящи за оценките, които следва да се извършат. При изследванията на дългосрочната токсичност се разглежда възможността за определяне на концентрацията на активното вещество в кръвта (напр. около T_max).

При събирането на данни и съставянето на доклади данните за заболеваемостта съответно от доброкачествени и от злокачествени тумори не се обединяват. Освен това, разнородните тумори, несвързани помежду си, независимо дали са доброкачествени или злокачествени, които се проявяват в един и същи орган, не се обединяват за целите на отчитането.

За да се избегне объркване, при класифицирането и отчитането на туморите се прибягва до установената хистопатологична терминология, която обичайно се използва при извършване на изследвания, както е публикувана от Международната агенция за изследване на рака. Посочва се използваната система.

Биологичният материал, избран за хистопатологично изследване, съдържа материал, подбран с цел да дава и допълнителни сведения за констатираните при макропатологичния преглед лезии. В случаите, когато спомагат да се изясни механизмът на действие и са на разположение, могат да бъдат ценни и някои специфични хистологични (за оцветяване) и хистохимични техники и изследвания с електронен микроскоп, които се отчитат, ако бъдат използвани.

Проучва се и се отчита възможното въздействие върху физиологията на репродуктивната система и върху поколението по отношение на следните аспекти:

• 
  Нарушаване на мъжката и женската репродуктивна функция или способност, напр. поради въздействие върху половия цикъл, сексуалното поведение, върху всякакви аспекти на сперматогенезата или оогенезата, хормоналната активност или физиологичната реакция, които могат да повлияят върху оплодителната способност, самото оплождане или развитието на оплодената яйцеклетка, включително имплантацията.
  
• 
  Вредно въздействие върху поколението, напр. въздействие, което нарушава нормалното развитие както преди раждането, така и след него. Тук се включват морфологични малформации, напр. аногенитално разстояние, запазване на зърната на млечните жлези и функционални разстройства (напр. репродуктивни и неврологични нарушения).
  

Измерва се количество на активното вещество и неговите съществени метаболити в млякото като втори етап на изследването, ако у потомството се наблюдават някакви прояви или се очаква такива да бъдат наблюдавани (напр. при изследване за определяне на обхвата).

Внимателно се следи за възможната проява на невротоксично и имунотоксично въздействие, както и на въздействие, което може да е свързано с изменения в хормоналната система, и такива видове въздействие се отчитат.

При проучванията се вземат предвид всички налични и съществени данни, в това число резултатите от изследванията на токсичността като цяло, ако са включени съответните показатели (напр. анализ на семенна течност, цикличност на половите цикли, хистопатология на репродуктивните органи), както и сведения за структурните аналози на активното вещество.

Ако стандартните референтни стойности за реакциите по отношение на третирането са данни от паралелен контрол, то контролните данни за минали периоди могат да бъдат полезни при тълкуването на някои конкретни изследвания на репродуктивната функция. Когато се представят контролни данни за минали периоди, те се отнасят до един и същ вид и една и съща порода животни, които са се намирали при сходни условия в една и съща лаборатория, и са получени от изследвания, извършени по едно и също време.

Информацията по отношение на предоставените контролни данни за минали периоди съдържа:

а) идентификация на вида и породата, името на доставчика и идентификация на конкретната колония, ако доставчикът работи в няколко географски ареала;

б) името на лабораторията и датите, на които е направено изследването,

в) описание на общите условия, при които са били държани животните, включително вида или марката на храната и, ако е възможно, консумираните количества;

г) приблизителната възраст, изразена в дни, и теглото на животните от контролната група в началото на изследването и на датата на умъртвяване на животните или на тяхната смърт,

д) описание на схемата за смъртност на контролната група, констатирана по време на изследването или в края му, както и други важни наблюдения (например болести, инфекции);

е) името на лабораторията и на научните работници, натоварени със събирането и тълкуването на патологоанатомичните данни от изследването.

Контролните данни за минали периоди се представят за всяко конкретно изследване, като се посочват абсолютни стойности, както и процентни и относителни или преработени стойности, ако те са от полза за изготвянето на оценката. Ако се представят комбинирани или обобщени данни, те съдържат информация за обхвата на стойностите, средната стойност, медианата и ако е приложимо, стандартното отклонение.

За да се осигури полезна информация за проектирането и тълкуването на изследвания на токсичността при развитието, в по-висшите етапи на изследванията може да се включи и отчете информация за концентрацията на активното вещество в кръвта у родителите и плода/потомството.