Научни резултати постигнати при разработването на изследователски проекти, финансирани от му – София

ЗАЧИСЛЕН ЗА РЕДОВЕН ДОКТОРАНТ СЪС ЗАПОВЕД НА РЕКТОРА № Р-883../..26,11,03. г., КАТЕДРА ПО ХИМИЯ И БИОХИМИЯ, МЕДИЦИНСКИ УНИВЕРСИТЕТ, СОФИЯ - 1431

Epstein-Barr вирус негативната Burkitt-ова лимфомна B-клетъчна линия Ramos се ползва широко като клетъчен модел за изучаване на процесите на селекция на В-клетките в герминалните центрове на периферните лимфни тъкани, поради морфологичните и функционални прилики с GC центробластите. Ние наамираме: 1) че относителната ниска експресия на ИгД от тези клетки е причина за резистентността им към растежен арест и апоптоза след стимулиране с анти-ИгД. 2) Подобно на GC центробласти, Ramos-BL B клетките експресират ниски базални нива на PTP1B и PTP1C (SHP1) в сравнение с фоликуларните B клетки, което отдаваме на регулираната експресия на тези тирозин фосфатази по време на диференцирането и силекцията на В клетките в герминалните центрове.

***

ВОДЕЩ ИЗСЛЕДОВАТЕЛ (ДОКТОРАНТ): Людмила Владимирова Матева

От проведените експерименти и обработката на данните недвусмислено бе доказано посредством инкорпориране на [³H] тимидин в ДНК на клетките, инхибиращото влияние на екстракта от Tribulus terrestris върху клетъчната пролиферация. Това е свързано и с ясно изразена промяна във формата на клетките и достигане на пълно разграждане при концентрации над 10 микро грама /мл от екстракта. От друга страна се наблюдава и спадане във виталността, доказано чрез МТТ тест.

Подтискането на пролиферацията намалява активността на ЕRK1/2 и експресията на с-Мyc, което е свързано и със занижение в клетъчната концентрация на полиамините. Друг важен извод от направените Western-blots e увеличената активност на прокаспаза-3, свързана с индуцирането на апоптоза.

Научният отчет е приет по скалата на Съвета по медицинска наука със следните оценки:

- ВИСОКА оценка за извършената научноизследователска дейност,

- ВИСОКА оценка за приноса на получените резултати за оформяне на дисертационния труд;

- ВИСОКА оценка за приноса на реализираната разработка върху процеса на подготовката на докторанта.

***

ЗАЧИСЛЕН ЗА РЕДОВЕН ДОКТОРАНТ СЪС ЗАПОВЕД НА РЕКТОРА №.Р-27/15.012003г.

(адрес на базата на обучение :Факултет, Катедра, Университетска болница, Клиника, лаборатория, секция и др.): МФ, кат. Химия и Биохимия, МУ-София

НАУЧЕН РЪКОВОДИТЕЛ НА ВОДЕЩИЯ ИЗСЛЕДОВАТЕЛ (ДОКТОРАНТ): Ваньо Иванов Митев, доктор на биологическите науки, професор по биохимия, ръководител на кат. „Химия и Биохимия”, МФ, МУ, ул. Здраве 2, 1431 София, ръководител на докторанта.

АДРЕС ЗА КОНТАКТИ НА ВОДЕЩИЯ ИЗСЛЕДОВАТЕЛ (ДОКТОРАНТ): кат. „Химия и Биохимия”, МФ, МУ, ул. Здраве 2, 1431 София, служебен тел. 9172 586

БАЗОВА ОРГАНИЗАЦИЯ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ПРОЕКТА: Деканат на МФ, МУ-София, кат. „Химия и Биохимия”

РЕЗУЛТАТИ:

Данните от изследванията до момента говорят за участие на малките Rho белтъци в контрола на цитоскелетните реорганизации. Ключовата роля на актиновия цитоскелет в контрола на придвижването и фузията на транспортните везикули е основния мотив в настоящата разработка да се изследва ролята на някои конкретни членове от фамилията на Rho като косвени регулатори на вътреклетъчните мембранни динамики. Експериментите ни се базираха на пилагането на съвременнени техники за изледване – трансфекции, инхибиране със siRNAs, интернализация на белязан трансферин. Получените от нас резултати доказаха регулаторни функции на TCL, TC10, RhoD, Rab5 и Rab11 в процеса на клатрин-медиирана интернализация на трансферин. Инхибирането на експресията на TCL, TC10, RhoD, Rab5 и Rab11 възпрепятсва дистрибутирането на интерна.лизирания трансферин в компартмента на перинуклеарните рециклиращи ендозоми. Установихме контролни функции на Rab5 в процеса на интернализация и регулаторни функции на RhoD, TC10, TCL и Rab11 в процеса на транспортиране на ендоцитозните везикули. Резултати от wester blot анализите на сукрозните и перколовите градиенти, показаха, че нормалното функциониране на TCL и ТC10 зависи напълно от тяхната правилна локализация в клетките. Установена беше връзка на TC10 с кавеолин съдържащите липидни рафтове и със секреторните мембранни системи на клетките. В активно състояние двата белтъка TCL и TC10 инициират различни изменения в клетъчната морфология и в дистрибутирането на ендоцитирания трансферин.

***

Основните пролиферативни стимули в култури от нормални кератиноцити се предават чрез семейството на Human EGF Receptor (HER). Двата лиганда за рецепторите от това семейство – Епидермалния растежен фактор (EGF) и Heregulin имат различна роля в регулацията на деленето и диференцията на епидермалните клетки, която се определя от разликите в пострецепторните трансдукционни механизми. Бе показано, че Heregulin- селективно фосфорилира ЕRК1/2 в конфлуентни култури, а EGF както в конфлуентни, така и в субконфлуентни култури. Настоящето изследване показа кинетиката в активирането на ЕRК1/2 при стимулиране на културите ЕGF или HRGβ. В субконфлуентни кератиноцити активността на киназата се увеличава значително още след 15’ стимулиране с EGF и достига максимум при 30’, който се запазва до 2ч, след което се наблюдава спад във фосфорилирането на ЕRК1/2. В конфлуентни култури бе наблюдавана подобна кинетика на активиране на ЕRК1/2 от EGF, а HRGβ предизвиква максимално фосфорилиране на киназите при 15’стимулиране. Чрез набор от РКС инхибитори установихме взаимовръзката между двата сигнално-трансдукционни пътя. Активирането на ЕRК1/2 от ЕGF става по РКС-независим път. В същото време вероятно ЕGF активира специфични МАР фосфатази: МКР1, МКР2 или МКР3 по РКD-зависим път, което се подкрепя от увеличената активност на тази МАР киназа при инхибиране с РКD инхибитора Go6976. Резултатите с инхибиране на РКС и РКD показват, че активирането на МАРК от НRGβ става по РКD –зависим път.

***

ЗАЧИСЛЕН ЗА РЕДОВЕН ДОКТОРАНТ СЪС ЗАПОВЕД НА РЕКТОРА:

№.Р 855/18.11.2003г., Медицински Факултет, Клиничен център по Алергология, Лаборатория по Имунология, УМБАЛ”Александровска”

НАУЧЕН РЪКОВОДИТЕЛ НА ВОДЕЩИЯ ИЗСЛЕДОВАТЕЛ (ДОКТОРАНТ): Марта Петрова Балева, дмн, професор, Клиничен център по Алергология, Лаборатория по Имунология, УМБАЛ”Александровска”.

АДРЕС ЗА КОНТАКТИ НА ВОДЕЩИЯ ИЗСЛЕДОВАТЕЛ (ДОКТОРАНТ): Клиничен център по Алергология, Лаборатория по Имунология, УМБАЛ”Александровска”, GSM: 088 780 42 17, служ. тел. 92 30 543, e-mail: vikentieva@hotmail.bg

БАЗОВА ОРГАНИЗАЦИЯ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ПРОЕКТА: Медицински Факултет, Клиничен център по Алергология, Лаборатория по Имунология, УМБАЛ”Александровска”

РЕЗУЛТАТИ:

Белодробните прояви свързани с антифосфолипидния синдром (АФЛС) са по-редки в сравнение с другите клинични характеристики наблюдавани при него. Въпреки това, навременната диагноза е задължително изискване поради тежеста на клиничните прояви и високата смъртност. След миокардния инфаркт и мозъчния инсулт, белодробния тромбемболизъм (БТЕ) е третата по честота причина за внезапна смърт. Спектърът на белодробните прояви при пациентите с АФЛС включва-тромбоемболизъм на белодробните артерии, белодробна хипертония, респираторен дистрес синдром при възрастни, интраалвеоларни хеморагии, postpartum syndrome и др.

В нашето проучване бяха включени 36 пациенти с БТЕ от 25 до 70 годишна възраст (средна възраст 44,7) и 32 здрави лица. При 20 от пациентите бяха установени данни за дълбока венозна тромбоза (ДВТ), при 10 системен лупус еритематозус (СЛЕ), при 4 хронична обструктивна белодробна болест (ХОББ) и при 2 postpartum syndrome. Придружаващи заболявания имаха 5 от пациентите с БТЕ (диабет, Хашимото и др.). Белодробен микротромбемболизъм беше диагностициран при 4 от пациентите, като при 2 от тях беше комбиниран с белодробна хипертония.

Диагнозата БТЕ включваше клинични и функционални параметри, рентгенография, сцинтиграфия, компютърна томография (СТ), електрокардиограма (ЕКГ).

Антифосфолипидните антитела (антикардиолипинови и анти-β2 гликопротеин І) бяха орпеделени чрез ензим-свързан-имуносорбентен метод (ELISA), лупусния антикоагулант (ЛА), чрез определянето на активираното парциално тромбопластиново време (аРТТ), протеин С и АТ ІІІ чрез хромогенен метод. Молекулярни методи бяха приложени за диагностицирането на три наследствени тромбофилни мутации-мутация на фактор V, на протромбиновия ген G20210A, на метилен-тетрахидрофолат редуктазата (MTHFR).

Тромбоцитните активационни маркери бяха определени чрез флоуцитометрия.

Антитела към кардиолипин и β2-гликопротеин І бяха намерени повишени съответно при 16,66 % и 38,70 % от пациентите с БТЕ.

Статистически значимо (p=0,008) е увеличението на антителата срещу β2-гликопротеин І от клас IgM. Антителата срещу кардиолипин бяха повишени при 6 от пациентите с БТЕ като при 5 от тях те са от клас IgM, а при 2 от двата класа IgG и IgM. Статистическа значимост обаче не се установява. В изследваната група пациенти с БТЕ, аРТТ е удължено при 4 (23,5%). При шестима от пациентите с БТЕ (31,6%) се установи дефицит на протеин С. Дефицит на АТ ІІІ беше установен при 3 от пациентите с БТЕ (15,78%). Честотата на Лайденовата мутация сред изследваната група пациенти беше 11,43 %. Генотип С677ТТ на MTHFR беше установен при 4 пациенти, 2 от които с анамнеза за рецидивиращи ДВТ и БТЕ, 1 със СЛЕ и БТЕ и 1 с първичен БТЕ.

Пациентите с АФЛС могат да се представят с широко разнообразие от белодробни прояви, формиращи т.нар. “белодробен антифосфолипиден синдром”. Само по-нататъшни и допълнителни проучвания биха могли да установят кои от генетичните полиморфизми и типове антифосфолипидни антитела са значимо сварзани с тези клинични прояви. Познаването им е предпоставка за адекватна и коректна терапия.

НАУЧНИ ПУБЛИКАЦИИ:

Предстои оформяне на статия със заглавие “Диагностична стойност на определянето на някои прокоагулационни фактори при болни с БТЕ.”

***

Организация-съизпълнител: Централна лаборатория по Биомедицинско инженерство – БАН (без финансиране).

В хода на проекта осъществихме синтез на ВКГ образи и бримки от високочестотни 12-канални електрокардиографски записи при пациенти с ОМИ (19 ОМИ с долно-диафрагмална локализация, 12 – с долно-латерална, 10 – с предна локализация) и контрола от здрави лица (n=10) от предоставена база данни. ВКГ образите бяха синтезирани на базата на стандартните 12-канални отвеждания и чрез инверсия на отвеждане aVR. В хода на проекта апробирахме възможността за телеметрично мониториране на електрофизиологичните промени чрез безжичен Bloototh интерфейс и портативна компютърна система, с много добри резултати. На базата на получените определихме онези електрофизиологични променливи в синтезираните ВКГ отвеждания , търпящи максимална динамика при съответната локализация на ОМИ (с възможност за количествен анализ): при долен ОМИ - амплитуда на Q-зъбеца в Z1, Z2, Y1, Y2, R в Y1 и Y2; при долно латерален - амплитуда на Q в Y1,Y2, Z1, Z2; R в Y1,Y2; при преден ОМИ - амплитуда на Q в Y1,Y2, Z1, Z2; R в Y1,Y2; На базата на тези резултати бе определена степена на корелация между електрофизиологичните променливи и серумната активност на КФК и КФК-МВ при пациенти с ОМИ постъпили в клиниката за периода на проекта (промяната в ензимната активност е отчететена за амплитудна промяна с 1 mm).

1. С. Найденов, Т. Донова. Корелация между ЕКГ промените и кумулираното освобождаване на креатин фосфокиназата и нейната МВ-фракция при пациенти с остър миокарден инфаркт с ST-елевация. Българска Кардиология.

1. Matveev M., S. Naydenov, N. Mudrov. Method for digitization and extracting features from paper recordings of physiological signals. Electronics ET’2004. Sozopol, Bulgaria 22-24 September. Abstr. 89.

***

НАУЧНО НАПРАВЛЕНИЕ: Ендокринни жлези, Нови методи

ТЕМА НА ИЗСЛЕДОВАТЕЛСКИЯ ПРОЕКТ: Изследване на слюнчен кортизол в полунощ като метод за поставяне на диагноза синдром на Кушинг

ПЕРИОД НА ФИНАНСОВА ПОДРКЕПА: 2004 г

ВОДЕЩ ИЗСЛЕДОВАТЕЛ/ДОКТОРАНТ/: д-р Мария Костадинова Янева

ЗАЧИСЛЕН ЗА РЕДОВЕН ДОКТОРАНТ СЪС ЗАПОВЕД НА РЕКТОРА № Р-41/2002. Медицински факултет, Клиничен център по Ендокринология и геронтология, СБАЛЕНГ “Акад. Иван Пенчев”, Клиника по хипоталамо-хипофизарно-надбъбречни и гонадни заболявания

СБАЛЕНГ “Акад. Иван Пенчев”, адрес: гр. София 1303, ул. “Дамян Груев” №6, Клиника по хипоталамо-хипофизарно-надбъбречни и гонадни заболявания, служебен телефон: 987 72 01/288, мобилен телефон: 0899 51 54 66, e-mail: yaneva_m@yahoo.com

Средната стойност на слюнчения кортизол в полунощ при здравите доброволци, обезните и болните със синдром на Кушинг са сътветно 8.7 ± 0.9; 9.2 ± 0.9 и 34.4 ± 4.5 nmol/l. Между стойностите на групите на здравите контроли и болните със затлъстяване не се установяват статистически значими разлики (P>0.05). За разлика от тях, стойностите на пациентите със синдром на Кушинг се различават значително (P<0.001). Бе определен cut-off за слюнчения кортизол в полунощ - 13.65 nmol/l. При тази стойност чувствителността на метода е 100%, а специфичността - 95%. Свободният уринен кортизол при пациентите със затлъстяване бе 112.3 ± 11.4 nmol/24h, срещу 891.6 ± 190.8 nmol/24h при групата на болните със синдром на Кушинг (P<0.001). При пациентите със синдром на Кушинг се установи статистически значима положителна корелация между свободния уринен кортизол и слюнчения кортизол в полунощ (r=0.612, P<0.005).

Нашите резултати потвърждават работната хипотеза, че изследването на слюнчен кортизол в полунощ е надежден метод за диагноситциране на синдрома на Кушинг. Поради изключителните удобства на метода препоръчваме то да се използва като рутинно средство на първи избор при тази патология.

Настоящото проучване е първото в България. То въвежда една нова за страната методика. Нещо повече - това е първото клинично проучване в световен мащаб, използващо дозирането на слюнчен кортизол чрез ECLIA.

1. “Midnight salivary cortisol, measured by highly sensitive electrochemiluminescence immunoassay, for the diagnosis of Cushing’s syndrome” by Maria Yaneva, Georgi Kirilov and Sabina Zacharieva. Публикацията е предложена за печат в списанието European Journal of Endocrinology. Изчаква се отговор на рецензентите.

***

При 36 от общо 42 пациенти хистологичните и имунохистологичните изследвания потвърдиха диагнозата МАЛТ лимфом на стомаха с ниска степен на малигменост, а при останалите 6 – преход към Неходжикинов лимфом с висока степен на малигненост. Данни за инфекцията с Helicobacter pylori от поне един от използваните методи имаше при 40 (95%) от 42 болни. Случаите с МАЛТ лимфом на стомаха с ниска степен на малигненост и наличие на инфекция получиха стандартна ерадикационна терапия на първи и на втори избор. Периодът на проследяване беше от 2 до 96 месеца (средно 40,2 месеца). Ерадикацията на Helicobacter pylori беше успешна в 90%. Пълна клинична и хистологична ремисия бе постигната при 28 пациенти, частичен отговор с резидуална лезия при шестима и липса на ефект в два случая, усложнени с кървене от горния гастроинтестинален тракт, наложило хирургична намеса. Трима пациенти с Неходжкинов лимфом с висока степен на малигненост бяха подложени на оперативно лечение с проследяваща химиотерапия, а други трима бяха третирани само с химиотерапия. Липса на терапевтичен отговор имаше при един пациент от групата, лекувана с оперативна намеса и химиотерапия.

1. Marinov A.A. et al. “Gastric B-Cell Lymphoma-Diagnostis, Treatment Modalities and Follow Up in 42 Patients” Postgraduate Course “Update in Gastroenterology” and East-West Bridge Meeting, Sofia, Bulgaria, 11-12.06.2005, page 6

2. Терзиев И.Г. и др. “Екстранодални неходжкинови лимфоми-МАЛТ лимфоми на стомаха – диагностика, имунна фенотипизация, ефект от ерадикационно лечение за Хеликобактер пилори.” Национален конгрес по патоанатомия (извънреден), Слънчев бряг, България, 3-5.04.2005 г., стр. 5

3. Терзиев И.Г., А.А. Маринов и Б.Г. Владимиров “Екстранодални неходжкинови лимфоми- МАЛТ лимфом на стомаха- ретроспективмно проучване на 40 случая”, Бояна, България 22-23.04.2005 г.

***