Молекулярна биология и наследствени болести при домашните животни проф дсн Лилян Сотиров

• 
  Първична структура – представлява нуклеотидната последователност, от която е изградена дадената РНК молекула. Тази нуклеотидна последователност служи за временен преносител на наследствената програма на клетката. Пример за първична структура можем да дадем с РНК на един вирус по картофите:
  

CGGAACTAAACTCGTGGTTCCTGTGGTTCACACCTGACCTCCTGACAAGAAAAGAAAAAAGAAGGCGGCT

CGGAGGAGCGCTTCAGGGATCCCCGGGGAAACCTGGAGCGAACTGGCAAAAAAGGACGGTGGGGAGTGCC

CAGCGGCCGACAGGAGTAATTCCCGCCGAAACAGGGTTTTCACCCTTCCTTTCTTCGGGTGTCCTTCCTC

GCGCCCGCAGGACCACCCCTCGCCCCCTTTGCGCTGTCGCTTCGGCTACTACCCGGTGGAAACAACTGAA

GCTCCCGAGAACCGCTTTTTCTCTATCTAACTTGTTCCGGGGCGAGGGTGTTTAGCCCTTGGAACCGCAG

TTGGTTCCT

• 
  Вторична структура – представлява свързването на определени участъци от едноверижната РНК молекула на принципа на комплементарността. При РНК молекулите комплементарни са базите Г-Ц и А-У (Уотсън Крикови двойки), но понякога се откриват сдвоявания между Г и У. Характерно за тази двойка е нейната нестабилност, поради което тя е по-малко известна. Свързването на отделни участъци (от по няколко нуклеотида) води до образуването на различни по големина и форма примки във вторичната структура на РНК молекулата. Описани са следните видове вторични структури – фуркет, вътрешна примка, полупримка, поликлонална примка, стъбло и единична верига. Пример за вторична структура на РНК:
  

• 
  Третична структура – възниква в следствие на взаимодействията между отделни участъци във вторичната структура. Предвиждането на третичната структура на РНК може да се открие посредством точен (ко-)вариантен анализ.
  

Основната догма на молекулярната биология гласи, че информацията в клетката тече в следната посока:

1. 
   ДНК > Белтък > иРНК
   
2. 
   иРНК > ДНК > Белтък
   
3. 
   ДНК > РНК > Белтък
   

1. 
   Допълнителна сулфидна група
   
2. 
   Допълнителна хидроксилна група
   
3. 
   Допълнителна оксалатна група
   
4. 
   Всички са верни
   
5. 
   Нито едно от посочените
   

1. 
   Рибозомната РНК
   
2. 
   Информационната РНК
   
3. 
   Транспортната РНК
   
4. 
   Ензимът ДНК полимераза I
   

1. 
   Първична, вторична и третична структура
   
2. 
   Проста, компенсаторна и специфична
   
3. 
   Единична, двоична и сложна
   
4. 
   Права, обратна и разклонена
   

Характерните белези за всеки вид се дължат на специфичните белтъчини синтезирани в неговите клетки. Генната експресия се състои в преносът на наследствената информация кодирана от гените разположени в ДНК до рибозомите (органелите отговорни за белтъчната синтеза). Гените се делят на две основни групи в зависимост от природата на крайния продукт:

• 
  Рибозомни гени и гени кодиращи тРНК – кодират синтезата на рРНК и тРНК
  
• 
  Структурни гени – кодират всички белтъчни молекули в клетката. За превеждането на наследствената информация от тези гени до езика на белтъчините информацията преминава през молекула посредник – иРНК.
  

Както се вижда при експресията на всички гени (независимо от по-горе представеното разделение) се синтезират РНК молекули. Процесът на презаписване на наследствената информация от гените разположени в ДНК в молекули РНК (иРНК, рРНК и тРНК) се нарича транскрипция. По подобие на репликацията транскрипцията също е матричен процес (протичащ в посока от 5‘>3‘), който условно може да бъде разделен на три основни етапа:

1. 
   Инициация на транскрипцията. Синтезата на иРНК се осъществява от специфичен ензим – РНК полимераза (наричан до скоро ДНК зависима РНК полимераза). РНК полимеразата се състои от 5 субединици – (α2ββ)σ. Заградената в скобите част се означава като кор ензим. Ролята на σ-субединицата се състои в разпознаването на точките на инициация на транскрипцията във всеки определен ген. При отсъствие на σ-субединицата кор ензима стартира синтезата на РНК в случайни места от веригата на ДНК, поради което се допускат грешки в презаписването на информацията. Това означава, че σ –субединицата придава на ензима способността да разпознава и да се свързва специфично с области (промотори) пред гена, от които зависи точността на неговото презаписване. При изследвания върху бактерията E. coli е установено, че повечето нейни гени съдържат промоторни области от шест нуклеотидни последователности разположени на разстояние между 35 и 10 базови двойки пред точката на инициация. Тези шест нуклеотидни последователности в гените се означават като боксове и в повечето случаи тяхната последователност е TATAAT (-10) и TTГAЦA (-35). При мутация в някой от двата бокса настъпват сериозни отклонения в инициацията на транскрипцията. Всички процеси от намирането на промотора от РНК полимеразата до започването на самата синтеза на РНК се означават като инициация на транскрипцията. След като полимеразата открие промотора тя се свързва с него в шест нуклеотидната последователност при позиция -35. В този момент двойната спирала на ДНК не е разделена и заедно с полимеразата образуват „затворен“ комплекс. След това този затворен комплекс преминава в “отворен”, при което се разплита (локална денатурация) участък в ДНК от около 17 базови двойки с начало в шест-нуклеотидната област от позиция –10. При преминаването от затворен в отворен комплекс полимеразата се свързва много силно с веригата на ДНК, което гарантира протичането на процеса. Участъкът от промотора в позиция -10 попада в разплетената зона, което обяснява наличието на нуклеотидите аденин и тимин. Както описахме в разделът за структурата на ДНК връзките между аденин и тимин са двойни, а между гуанин и цитозин - тройни. За преминаването на ДНК от двуверижно в едноверижно състояние е необходимо връзките между двете вериги да бъдат разкъсани. Поради по-малкият брой връзки между аденин и тимин ДНК веригите се разединяват именно в тези области. При образуването на отворения комплекс първият нуклеотид от гена (+1) попада в едноверижната област, т. е. матрицата нужна за синтезата на РНК вече е отворена и готова за протичане на процеса. При повечето бактериални РНК първият нуклеотид от веригата е аденин или гуанин с три фосфатни групи в началото (фффА или фффГ). Началото на синтезата не е строго фиксирано и се предполага, че РНК полимеразата сканира областта пред себе си до намирането на пуринов нуклеотид (аденин или гуанин). Характерно за РНК молекулите е, че те не запазват първоначалният си 5‘ краен нуклеотид, което ги предпазва от атака на нуклеазите в клетката.
   
2. 
   Елонгация на транскрипцията (прибавяне на рибонуклеотидфосфатите). Както вече описахме, при отвореният комплекс връзката между РНК полимеразата и едноверижната молекула ДНК е много силна, което пречи на придвижването на ензима. Затова през този етап σ-субединицата на РНК-полимеразата се отделя от сърцевината на ензима, което спомага по-лесното преминаване на ензима по ДНК матрицата. При придвижването на РНК-полимеразата по ДНК-матрицата отвореният комплекс се премества по посока синтезата на РНК, а дължината му от около 17 базови двойки се запазва. Около 5 от нуклеотидите остават свободни, а останалите 12 преминават в хибридно състояние с новосинтезиращата се иРНК. Частта от ДНК веригата, при която процесът вече е протекъл възстановява двойноверижната си структура. Удължаването на полинуклеотидната РНК молекула се извършва посредством присъединяване на нови нуклеотиди в посока към 3‘ края на матрицата.
   

3. 
   Терминация на транскрипцията. Завършването на транскрипцията се характеризира с отделянето на синтезираната иРНК от ДНК матрицата. Доказано е, че ДНК веригата съдържа специфични последователности, които оказват прекратяването на процеса. Обикновено тези участъци се характеризират с палиндрома и наличието на определен брой аденилови остатъци. При достигане на такъв участък полимеразата рязко намалява скоростта на придвижването си и постепенно се отделя от ДНК веригата.
   

Както вече описахме РНК полимеразите могат да започнат синтеза на ДНК в отсъствието на праймер (РНК олигонуклеотид). Обикновено първият разпознат от тях нуклеотид от ДНК матрицата е под формата на 5’-трифосфат. При прокариотите този 5‘ край на иРНК е атакуван от рибонуклеазите в клетката, поради което при тях се открива 5‘ монофосфат. Характерно за иРНК при еукариотите е изграждането на кеп структура на техният 5‘ край, катализиран ензим, разпознаващ за субстрат 5‘ три или дифосфат. Този факт потвърждава, че мястото на започване синтезата на иРНК съвпада 5‘ кеп края на иРНК(изграден от РНК полимераза II).

Ензимът РНК полимераза II е отговорен за транскрипцията, както на гените кодиращи структурните белтъци, така и за гените кодиращи малките ядрени иРНК. В повечето случаи промоторните зони на този ензим се намират извън областта, която ще подлежи на транскрипция. Определени участъци в промоторните последователности са строго специфични за различните организми, което показва липса на коеволюция при тези структури. Съществуват и участъци в промоторите, които са хомоложни при различните видове. Пример за такъв участък е така нареченият ТАТА-бокс, разположен на позиция -25. Този бокс (аналогично с бокс -10 при бактериите) има значение за точното разпознаване на първият нуклеотид за транскрибиране (+1). Също както описахме при бактериите така и тук, в повечето случаи първият включен нуклеотид от РНК полимераза II е с пуринова база, след което на 5‘края се синтезира кеп структурата. При някои еукариоти вместо ТАТА бокс се открива наличие на цитозин на позиция -1 и аденин на позиция +1. Тази особеност формира алтернативен промоторен елемент. Нуклеотидните последователности в близост до тези структури имат съществено влияние за правилното функциониране на този тип промотори. При гените, при които се откриват ТАТА бокс или горепосоченият инициаторен елемент транскрипцията стартира от точно определен нуклеотид. При други гени обаче процесът може да стартира от различни участъци. В промоторните области на такива гени са открити така наречените ЦГ-островчета (участъци от нуклеотиди съдържащи само цитозин и гуанин).

Описаните три вида промотори отговарят за точното разпознаване на първият нуклеотид (+1), от който да стартира транскрипцията, но пред тях (на растояние до 200 базови двойки) се откриват допълнителни регулатори на транскрипцията. Разположението на тези регулатори (проксимални елементи) не е строго специфично, както бе описано за бокс -35 при прокариотите. Пример за такава последователност е ЦЦAATТ. Такъв участък, разположен пред ТАТА бокса е установен при много видове и може да бъде разположен и в двете вериги на ДНК матрицата.

Формиране на пре-инициационен комплекс (ПИК)

ПИК е съставен от РНК полимераза II и следните щест транскрипционни фактора (TF) - TFIIA, TFIIB, TFIID,TFIIE, TFIIF и TFIIH. През първият етап от формирането на ПИК, TFIID се свързва с TFIIA. Транскрипционният фактор IIB е изграден от 12 субединици, една от които е белтъкът, който се свързва с ТАТА бокса. Именно този белтък открива ТАТА бокса и инициира формирането на ПИК. В следващият етап към комплекса се присъединява и мономерният белтък TFIIB като неговият С-край създава връзка с ДНК матрицата. Малко по-късно към комплекса се включват TFIIF и Pol II. Завършването на инициаторният комплекс се постига с присъединяването на TFIIE и TFIIН.

Както при прокариотите така и тук първоначално е необходимо двете вериги на ДНК да бъдат разделени една от друга в място близко до транскрипционното начало. В последствие полимеразата се отделя от ПИК като на тази стъпка TFIIВ, TFIIЕ и TFIIН се отделят от комплека. Това допринася за по-лесното придвижване на ензима по ДНК веригата.

За разлика от прокариотите, при еукариотите ДНК е под формата на хроматин, което допълнително усложнява придвижването на полимеразата по матрицата. Сложният строеж на ПИК има значение за регулацията на инициацията, но повечето от компонентите му нямат каталитична функция. Характерно за еукариотите е, че след като полимеразата напусне ПИК, на нейно място може да постъпи нова полимераза, която да влезе в контакт с инициатора. По тази причина всеки следващ цикъл на транскрипцията се извършва по-бързо отколкото първият. При прокариотите описахме случаи, при които полимеразата „засяда“ по време на транскрипцията и процеса се блокира. Подобен феномен е наблюдаван и при еукариотите. В еукариотните организми съществуват специфични протеини отговорни за високотемпературен стрес, които се обозначават като топлинно-шокови протеини. Бързата експресия на гените отговорни за тяхната синтеза е жизненоважно при рязко повишаване на температурата на околната среда. При тези гени е наблюдавано засядане на полимеразата след като са синтезирани около 25 базови двойки от гена. При бързо покачване на температурата обаче възникват сложни каскади от събития, които освобождават заседналата полимераза. Този механизъм позволява изключително бърза транскрипция и последваща транслация на тези важни гени.

Транскрипция под контрола на РНК-полимераза І

Ядрена локализация на рибозомната биогенеза

Рибозомите на еукариотните клетки се образуват в ядърцата. Ядърцата представляват немембранни ядрени субструктури формирани от дисталните участъци на някои хромозоми. В ядърцата са разполижени специфични ензими, отговарящи за синтезата и зреенето на предшествениците на рРНК до 18S, 5,8S и 28S рРНК. Рибозомните белтъчини се синтезират върху по-ранни поколения рибозоми (в цитоплазмата), след което се транспортират до ядърцето. Характерно за процеса на образуване на рибозомите е, че участват много белтъчини, които не се откриват в завършените рибозоми, защото те остават в ядрото за да катализират следващите цикли на рибозомната синтеза. Когато са почти завършени 40S и 60S рибозомните субединици се експортират в цитоплазмата, където към тях се присъединяват още няколко белтъка, което ги трансформира във функционални рибозоми. Транскрибирането на рибозомните гени се извършва от РНК полимераза I. Нуклеотидните последователности кодиращи 18S, 5,8S и 28S рРНК се транскрибират заедно в една обща молекула предшественик. Това позволява да се синтезират еквимоларни количества от горепосочените три рРНК молекули.

РНК полимераза III синтезира рибозомната 5S РНК, транспортните РНК и някои малки РНК молекули. Както знаем вирусите използват молекулните механизми на клетката хазяйн за синтез на собствените си белтъчини, като в повечето случаи вирусните гени се транскрибират от РНК полимераза III. Транскриптите на този ензим обикновено съдържат около 300 нуклеотида и никога не кодират някакъв белтък. Те изпълняват предимно структурна роля в белтък-синтезния комплекс на клетката. Характерно за тази полимераза е, че промоторните области са разположени не преди, а в самите кодиращи региони. Такива нуклеотидни последователности се означават като вътрешен промотор. Установено е, че гените отговорни за тРНК са разположени в два големи блока (блок А и Б), които са силно консервативни както при еукариотите, така и при прокариотите. Терминацията на транскрипцията от РНК полимераза III също се кодира от нуклеотиди разположени в транскрибиращата област. Обикновено това са последователности със съдържание на три или повече тимина предшествани от многократно повтарящи се двойки гуанин и цитозин.

При прокариотите факторите отговорни за транслацията имат мигновен достъп то транскриптите, докато при еукариотите транскриптите се подлагат на процесинг (зреене) и едва когато се превърнат зрели иРНК молекули се транспортират в цитоплазмата. Накратко разликите в транскрипцията при еукариоти и прокариоти се свеждат до:

• 
  В транскрипцията при еукариотите участват три РНК полимерази.
  
• 
  Разпознаването на промотора при еукариотите се осъщества от различни транскрипционни фактори (TF), докато при прокариотите участие взема само σ-фактора.
  
• 
  Кондензацията на хроматина при еукариотите затруднява процеса многократно повече в сравнение с прокариотите.
  

След транскрипцията копието РНК е идентично с последователностите, намиращи се в ДНК матрицата. В него са открити последователности, които кодират специфични белтъчини – екзони и групи нуклеотиди, които не кодират полипептидни вериги – интрони. По тази причина този първоначален транскрипт е прието да се нарича пре-информационна РНК. Процесът на отстраняване на интроните и снаждане на екзоните в зряла иРНК се означава като зреене или сплайсинг. Характерно за процеса е изключително високата прецизност, тъй като евентуални грешки при съединяването на интроните биха довели до сериозни нарушения в рамката на транслацията и сформирането на крайният белтък. До скоро се смяташе, че един ген отговаря за синтезата на една полипептидна верига и това правило битуваше в продължение на десетки години. В наши дни е установено, че при процесинга на пре-информационната РНК е възможно в едни случаи да се изрежат едни интрони, а в други случаи същите интрони да бъдат запазени. Така един и същ участък от ДНК може да резултира в синтезата на различни белтъчини. Тези различия в зреенето на пре-иРНК се означават като алтернативен сплайсинг. Доказано е, че почти 60% от човешките гени се подлагат на алтернативен сплайсинг, което от своя страна означава, че вариантите на един ген могат да са един, два или дори хиляди. По дължината на пре-иРНК са разпоожени специфични участъци, които оказват границата между екзоните и интроните. Границата между 5‘края на един интрон и предходният екзон се означава като 5‘ място за сплайсинг, а между 3‘ края на интрона и следващият го екзон – 3‘място за сплайсинг.

При сплайсингът първоначално се разкъсват фосфодиестерните връзки между екзон и интрон, а след отстраняването на интрона връзките между двата доближени екзона се образуват отново. При двете реакции на трансестерификация не настъпва промяна в броят на фосфодиестерните връзки, а се променя тяхното местоположение. Разкъсването и сформирането на връзките не изисква енергия, но за сформирането и действието на апарата за сплайсинг са необходими големи количества АТФ. При обикновеният сплайсинг на границата между 5‘края на един интрон и 3‘ края на предходният екзон се разкъсват. На другият край на същият интрон се разкъсва връзката между неговият 3‘ край и 5‘ края на следващият екзон. На следващият етап, след отделянето на интрона от веригата, 3‘края на първият екзон се свързва с 5‘края на следващият екзон. При алтернативния сплайсинг обаче същата реакция може да доведе до свързване на 5’-екзона с отстоящи на по-далечно разстояние от него (несъседни) 3’-екзони. По този начин е възможно определен екзон да бъде прескочен, което да доведе до липса на определени аминокиселини в полипептидната верига. Съществува и една много рядка форма на сплайсинг – транс-сплайсинг. При нея е възможно свързването на два екзона, принадлежащи към различни пре-иРНК молекули. По този начин се получават хибридни иРНК, които кодират синтезата на несвойствени белтъчини за клетката.

Сплайсингът се извършва с помощта на молекулни комплекси наречени спайсозоми. Сплайсозомите са съставени от около 150 белтъка и 5 РНК молекули. РНК молекулите които участват в тази структура се означават като малки ядрени рибонуклеобелтъчни комплекси (snRNPs). През различните етапи от сплайсинга в комплекса постъпват или излизат различни snRNPs, което показва различната функция на всяка една от тях. Основните им функции са свързани с разпознаване 5‘мястото на сплайсинга, доближаване на тези места и катализация на процесите на разкъсване и свързване на фосфодиестерните връзки.

Освен сплайсингът с участието на сплайсозомите, съществува и т. нар. автокаталитичен сплайсинг (self-splicing), извършван с участието на автокаталитични интрони от група I и II. При този тип сплайсинг интроните придобиват специфична пространствена конформация и катализират своето изрязване от молекулата на пре-иРНК. В зависимост от структурата си и механизмът на сплайсинт автокаталитичните интрони се разделят на две основни групи. Автокаталитичните РНКи се означават като рибозими, което показва тяхното каталитично действие. Автокаталитичните интрони от група II осъществяват сплайсинга по механизмите на сплайсозомите. В процесите на сплайсинга участва различни видове белтъчини, които неутрализират отрицателните заряди на фосфатните групи (между два съседни екзона) и така спомагат сближаването им.

Избягването на грешките в сплайсинга се извършват основно по два начина:

• 
  Както вече описахме в раздел транскрипция, основна роля в транскрипцията заема ензимът РНК полимераза II. Този ензим носи със себе си редица белтъчини, имащи отношение към сплайсинга. След като 5‘мястото на сплайсинга се транскрибира, CDT-опашката на РНК полимеразата натоварва върху него специфични компоненти, които след появата на 3‘ мястото на сплайсинг извършват процеса. Това показва, че сплайсингът се извършва преди да са се транскрибирали други 3‘места за сплайсинг във веригата. Характерно за сплайсинга е, че при него не се наблюдава последователност, както при репликацията и транскрипцията.
  
• 
  Вторият основен механизъм дава предимство в разпознаването на места за сплайсинг на най-близко разположените места. Съществуват специфични SR белтъчини, които се свързват с екзонните инхенсери на сплайсинга. В последствие тези белтъчини взаимодействат с апарата на сплайсинга и го насочват към най-близко разположените места за сплайсинг. Извършвайки се между най-близко разположените места за сплайсинг, допуснатите грешки в процеса (прескачането на екзони) се свеждат до минимум.
  

Крйният етап от експресията на даден ген се заключава в синтезата на специфичните белтъчини кодирани в нуклеотидната му последователност. Белтъчната синтеза е матричен процес, извършващ се в специфични клетъчни органели – рибозоми. Тъй като нуклеиновите киселини са изградени от нуклеотиди, а мономери на белтъчините са аминокиселините, то наследствената информация трябва да се „преведе“ на езика на белтъчините. Процесът се отличава с изключителна сложност като основна роля в него вземат иРНК и транспортните РНК, които пренасят различните аминокиселини до белтък синтетазният комплекс. От една страна ДНК е носител на наследствената информация, но тази информация кодира производството на белтъчини, изпълняващи различни функции в клетката. В същото време всички генетични процеси в клетката (репликация, репарация, транскрипция и др.) са под контрола на различни белтъчини. Това означава, че процесите между нуклеиновите киселини и белтъците са взаимно свързани и без активната роля на белтъците, наследствената информация би била неизползваема.