Молекулярна биология и наследствени болести при домашните животни проф дсн Лилян Сотиров

• 
  Прокариотни клетки – най-често използваната бактерия при ДНК клонирането е E. coli. Тъй като бактерията е нормален обитател на тънкочревният тракт на бозайниците се използват определени щамове на бактерията не способни да се развиват при нормални условия на средата. Ако оптималната температура за една бактерия, нормален обитател на бозайническият стомашно-чревен тракт е 37°С, то бактериите използвани при ДНК клонирането се развиват при 28°С.
  
• 
  Клетки на низши еукариоти – обикновено се използват приемни клетки на дрожди. Техният геном е сравнително голям, което дава възможност за клонирането на фрагменти с големина до 1000 кило бази.
  
• 
  Растителни клетки – при ДНК клонирането в растителни клетки най-често се използва векторът Agrobacterium tumеfaciens. Характерно за този бактериален вид е, че предизвиква развитието на тумори в инфектираните клетки. Тумор индуциращият ефект се дължи на специфичен плазмид в бактерията (Ti плазмид). След инфектирането на еукариотната клетка определен участък от този плазмид се интегрира в генома на еукариота и я принуждава да синтезира специфични белтъчини. Векторите, които се използват в генното инженерство са модифицирани и тумор индуциращият фактор е отстранен. На негово място е изграден рестрикционен сайт, който позволява интегрирането на чужд ДНК фрагмент. Така след инфектирането на клетката в нейният геном се трансферира чуждият ген внесен при лабораторни условия.
  
• 
  Бозайнически клетки – най-често трансгенозата при тях се извършва посредством процеса ендоцитоза. Първоначално специфичните ДНК фрагменти се прехвърлят в изкуствени липозоми, чиито фосфолипидни мембрани в последствие се сливат с клетъчните мембрани на бозайническите клетки. Така чуждовидовата ДНК молекула се прехвърля в бозайническата клетка. Инкорпорирането на ДНК фрагмент в бозайническите клетки може да се извърши и посредством вектори базирани на ретровируси. Тези вируси използват за матрица иРНК от която синтезират двойноверижна ДНК молекула. В последствие тази молекула се интегрира в еукариотният геном и се реплицира при всяко делене на клетката. Друг метод за пренасяне на ДНК фрагменти в клетките на бозайници е посредством създаването на изкуствени хромозоми (YAC), в които се интегрират желаните чуждовидови ДНК вериги.
  

Генното инженерство е едно от най-иновативните открития на човечеството. То дава нова посока за развитие на гентиката, молекулната биология и не на последно място биоетиката. Рекомбинантните ДНК технологии се превърнаха в широко използван похват за производство на различни протеини необходими на човека, в това число хормоните соматотропин, инсулин, интерферон и др.

Най-нови експерименти показват възможност за конструиране на генетично модифицирани микроорганизми (E. coli) способни да разграждат различни замърсители в природата, да усвояват азота от атмосферата и др. Генетичното модифициране на растенията ни позволява да създаваме растения устойчиви на засушаване, замръзване, насекоми, вируси, бактерии и др. Навлизането на тези похвати в селското стопанство спомагат за намаляване използването на различни инсектициди, пестициди и др. с доказан токсичен и мутагенен ефект върху човека. Генното инженерство позволява прекрачването на видовите бариери и рекомбинирането на генетичната информация между видовете. Експериментално е показана трансгеноза между риба и домат, като ген придаващ устойчивост към замръзване от риба бил прехвърлен в домат. Полученото растение придобива устойчивост към замръзване, което го прави приспособимо в климатични пояси, при които преди това не е могло да бъде отглеждано. Не на последно място трябва да споменем и перспективите, които генното инженерство ни дава в борбата с инфекциозните и наследствените заболявания по хората и животните.
XVII. МОЛЕКУЛЯРНА ФИЛОГЕНЕТИКА

Молекулярната филогенетика е наука за анализ на наследствените молекулни различия (предимно на ДНК секвенции), която цели получаването на информация показваща еволюционните връзки между организмите. Информацията получена при обработката на молекулните данни се представя в дендрограма (филогенетично дърво).

Както вече многократно описахме всички живи организми носят наследствената си информация в молекули ДНК, РНК или протеини. Еволюционно близките организми имат големи сходства в молекулната структура на тези вещества, докато отдалечените през еволюцията организми показват различия в наследствените структури. В началното развитие на тази наука са се сравнявали хромозомите на организмите, пространствената структура на белтъчините, но експериментите потвърждават, че най-точни резултати се получават при сравняване структурата на нуклеиновите киселини. В едни от първите опити е бил използван методът на ДНК хибридизацията. При този метод двойноверижни ДНК молекули принадлежащи на различни видове се денатурират, след което получените едноверижни матрици се подлагат на хибридизация по между им. Наблюдват се частично двойноверижни молекули при които отделни участъци се свързват на принципа на комплементарността (т.е. това са участъци еднакви при двата изследвани вида), а други не се комплементират при което се получават подобнни на мехур структури – гепове (тези участъци са различни при двата изследвани вида). Така базирайки се на комплементарността бихме могли да покажем по-близките или по-далечни генетични връзки между изследваните организми. В наши дни се използва компютърен софтуер, който сравнява нуклеотидните секвенции, произхождащи от един или няколко вида като на базата на идентичността по между им се съди за тяхното сходство. Бихме могли да дадем за пример мутациите в ДНК митохондриите. Мутациите в митохондриалната ДНК са сравнително редки, като за акумулирането на определени мутации се изискват различни по големина периоди от време. Именно тези периоди от време могат да ни послужат като своеобразен молекулен часовник, показващ ни приблизителното време на обособяването на два отделни вида от общият им предшественик. Един от най-надеждните в това отношение методи е сравняването на две секвенции (последователности), като степента на сходство между двете може да послужи за критерии за степента на тяхното родство.

Методите използвани в молекулярната филогенетика позволяват изчислението на времето на дивергенция между два организма, при което се предвижда преди колко време е живял последният общ предшественик на изследваните видове. В сравнение с морфологичните и физиологичните методи изследването на еволюционните промени посредством методите на молекулярната биология ни дават значителни предимства.

• 
  Молекулните изменения се извършват закономерно под въздействието на различни екологични фактори.
  
• 
  Структурните изменения в молекулите на ДНК се натрупват с по-голяма скорост в сравнение с морфологичните белези.
  
• 
  Нуклеотидните последователности се предават много по-точно в сравнение с морфологичните белези.
  
• 
  Данните получени при молекулярни изследвания лесно се подлагат на статистически анализ.
  
• 
  Еднаквата структура на ДНК ни позволява да сравняваме секвенции принадлежащи на морфологично коренно различни организми – например жаба и човек.
  

Филогенетичните дървета могат да бъдат с или без корен.

• 
  При филогенетичното дърво с корен се открива специфичен възел (корен), от който се разклонява цялото дърво. Коренът представлява еволюционно най-близкият общ предшественик между изследваните видове. Дървото с корен олицетворява стрелата на времето, т.е. чрез него бихме могли да предположим посоката на еволюцията на организмите. Проследявайки отделните възли в посока от корена към короната на дървото бихме могли да определим предшествениците и потомците на отделните организми.
  
• 
  Филогенетичното дърво без корен показва единствено степента на сходство между отделните организми без да показва еволюцията в тяхното развитие.
  

Основен компонент в механизма на РНК интерференцията е ензимът:

1. 
   Slicer
   
2. 
   Dicer
   
3. 
   Racier
   
4. 
   Spacer
   

1. 
   Рак
   
2. 
   HIV
   
3. 
   Генетични заболявания
   
4. 
   Всички посочени
   
5. 
   Нито едно от посочените
   

1. 
   Процесът на интеграция на участъци от ДНК произхождащи от един организъм (донор) в ДНК верига принадлежаща на друг организъм (акцептор).
   
2. 
   Асексуално възпроизводство на индивиди, генетично еднакви с организма от който са били клонирани.
   
3. 
   Нито едно от посочените
   
4. 
   Всички са верни
   

1. 
   Да могат да самореплицират всички включени в тях участъци.
   
2. 
   Да съдържат специфични участъци, служещи за тяхното разпознаване.
   
3. 
   Да сърържат специфичен рестрикционен сайт (или няколко) позволяващи даден рестриктазен ензим да среже тяхната верига.
   
4. 
   Да съдържат в себе си селективни маркерни гени (най често за устойчивост към антибиотици).
   
5. 
   Всички изброени
   
6. 
   Нито едно от посочените
   

1. 
   Плазмидни, Фагови, Изкуствени
   
2. 
   Хромозомни, Нуклеозомни, митохондриални
   
3. 
   Бактериални, вирусни и произхождащи от приони
   
4. 
   Нито едно от посочените
   
5. 
   Всички са верни
   

1. 
   С корен
   
2. 
   Без корен
   
3. 
   С разклонения
   
4. 
   Без разклонения
   
5. 
   Всички са верни
   
6. 
   Нито едно от посочените
   

Както вече разбрахте молекулярната биология изучава вида и функциите на всички макромолекули, откриващи се в клетката. Тази наука допринася за откриването на връзките между отдалечените през еволюцията организми като за разлика от обичайно използваните морфологични белези молекулярната биология позволява сравняването на геномите на индивидите. Така можем много по-точно да дадем отговор на въпроса касаещ произхода на видовете.

Бъдещето на молекулярната биология се свързва с развитието на две основни направления – геномиката и протеомиката. Начало на геномиката бе дадено с проекта „Човешки геном“, който целеше секвенирането на пълната последователност на човешката наследствена програма. Установи се, че човешкият геном е съставен от три милиарда базови двойки, кодиращи около 70000 белтъчни молекули. Предполага се, че през идните години ще бъдат секвенирани и геномите на по-голямата част от предствителите на животинското и растително царство, населяващи нашата планета. Това познание ще допринесе за опознаване функциите и структурата на отделните гени. Именно геномиката би могла да даде ясен отговор за начина на възникване на наследствените и туморни заболявания при хората и животните. Протеомиката изучава различните форми и функции на белтъчините. Предполага се, че детайлното опознаване на третичната и четвъртична структура на всички белтъчини ще допринесе за разгадаване механизмите на възникване на различни имунодефицитни заболявания.

Безспорно една от сферите с най-голям прогрес в нашият свят са компютърните технологии. Постиженията при компютрите доведоха до развитието на една нова наука – биоинформатиката, съчетаваща в себе си науките биология, химия, математика, статистика и др. Благодарение на биоинформатиката, събирането и анализирането на белтъчните и нуклеотидни секвенции стана много достъпно, като във всеки момент можем да сравним определена секвенция със секвенциите на почти всички организми населяващи земята.

Един от най-ярките примери за огромният скок в развитието на молекулярната биология са ДНК чиповете. Тази технология ни позволява за изключително кратки периоди от време да установим над 50 000 полиморфни участъци в ДНК молекулите на даден организмъм. Получената информация би могла да ни послужи за установяване на предразположение към дадено наследствено заболяване, за което пациента дори не подозира.

Количественият PCR даде нова насока в разглеждането на редица заболявания, тъй като посредством него можем да определим количеството на експресия на определен ген. Този метод позволи да разделим заболяванията на засягащи транскрипцията и засягащи транслацията. Безспорно този похват допринесе много за опознаване механизмите на генната експресия при различните организми.

Едни от най-новаторските и същевременно най-обругавани похвати на молекулярната биология са рекомбинантните ДНК технологии. Посредством тези методи стана възможно да се трансферират гени от отдаличени през еволюцията организми. В наши дни е възможно създаването на растения устойчиви на топлинен и студов стрес, на бактериални, вирусни и насекомни инвазии и т.н. Това допринесе за все по-малката употреба на различни химически вещества използвани в борбата с тези вредители. Стана възможно био-производството на ценни за човека белтъчини в бактерии – инсулин, интерферон и др. Генетичното модифициране позволи удължаването на срока на годност на селскостопанската продукция.

Изброените до тук примери едва ли изчерпват необятността на съвременната молекулярна биология и тенденциите за нейното развитие. Независимо от това дали сме привърженици или противници на похватите на молекулярната биология, трябва да признаем, че след откритията направени от тази наука, светът никога няма да бъде същият…

1. 
   Баранов, В., В. Горбунова, Г. Ефремов, Т. Иващенко, Т. Кашеева, И. Кременски, Т. Кузнецова, С. Лалчев, Д. Тончева, 1999. Медицинска генетика. Сиела.
   
2. 
   Василева, Й., Ц. Яблански, Г. Николов, 1993. Генетика на селскостопанските животни. Земиздат.
   
3. 
   Ватев, И., В. Ишев, Ц. Маринова, Г. Николов, С. Станилова, 2005. Биология. С., Реко.
   
4. 
   Йотова, И., С. Йоцов, К. Атанасов, 1998. Ветеринарномедицинска генетика, наследствена патология и развъждане на домашните животни. Наука и техника.
   
5. 
   Минков, Ив., 1992. Молекулярна биология. УИ "Климент Охридски".
   
6. 
   Минков, Ив., Е. Даскалова, 2013. Молекулярна еволюция. УИ "Паисий Хилендарски".
   
7. 
   Николов, Х. И., Д. Черноземски, Д. Бенова, 1988. Мутагени и канцерогени, генетичен и канцерогенен риск. С., Наука и изкуство.
   
8. 
   Попов, Б., Ц. Яблански, С. Георгиева, 2011. Генетичен мониторинг. Наръчник по приложна екология. Алфамаркет.
   
9. 
   Попов, Б., 2012. Антимутагенен потенциал на тотален екстракт от Haberlea Rhodopensis. Докторска дисертация.
   
10. 
    Попов, П., Т. Ирикова, 2003. Обща генетика, Пловдив, Университетско издателство.
    
11. 
    Танчев, С., Ц. Яблански, А. Атанасов, С. Георгиева, 2012. Генетика. Академично издателство Тракийски Университет.
    
12. 
    Уотсън, Дж., А. Бери, 2004. ДНК тайната на живота. ИнфоДар.
    
13. 
    Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, 2007. Molecular Biology of the Cell. Garland Science.
    
14. 
    Craig N., O. Cohen-Fix, R. Green, C. Greider, G. Storz, C. Wolberger, 2010. Molecular Biology: Principles of Genome Function. Oxford University Press.
    
15. 
    Eisen, J.A., 2007. Environmental Shotgun Sequencing: Its Potential and Challenges for Studying the Hidden World of Microbes. PLoS Biology, 5, 82.
    
16. 
    Ellis, D.I., Dunn, W.B., Griffin, J.L., Allwood, J.W. and Goodacre, R., 2007. Metabolic Fingerprinting as a Diagnostic Tool. Pharmacogenomics, 8, 1243–1266.
    
17. 
    Gardner, E. J., 1975. Principles of genetics. John Wiley & Sons.
    
18. 
    International Human Genome Sequencing Consortium, 2004. Finisching the euchromatic sequence of the human genome. Nature, 431, 7011.
    
19. 
    Kaiser, D., 2001. Building a multicellular organism. Annu. Rev. Genet., 35, 103–123.
    
20. 
    Klug, W. S., M. R. Cummings, 1991. Concepts of genetics. Macmillan Publishing Company.
    
21. 
    Klug, W. S., M. R. Cummings, C. A. Spencer, 2006. Concepts of genetics. Pearson Prentice Hall.
    
22. 
    Lodish, H., A. Berk, C. A. Kaiser, M. Krieger, A. Bretscher, H. Ploegh, A. Amon, M. P. Scott, 2012. Molecular Cell Biology. Freeman.
    
23. 
    Nei, M., 2005. Selectionism and neutralism in molecular evolution. Mol. Biol. Evol., 22, 2318–1242.
    
24. 
    Sniegowski, P., Gerrish, P., Johnson, T., Shaver, A., 2000. The evolution of mutation rates: separating causes from consequences. Bioessays, 22, 1057–1066.
    
25. 
    Tropp, B. E. 2011. Molecular Biology. Jones & Bartlett Learning.
    
26. 
    Watson, J.D., T. Baker, S.P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick, 2013. Molecular Biology of the Gene. Benjamin Cummings.
    
27. 
    Weaver, R., 2011. Molecular Biology. McGraw-Hill Science.
    

Проф. дсн Лилян Сотиров

1. 
   НАСЛЕДСТВЕНИ БОЛЕСТИ ПРИ ГОВЕДОТО
   

Освен в Австралия заболяването е установено в САЩ и други държави. Предприети са и превантивни мерки чрез генотипизация на Червения Ангус в посочените държави.

ДНК теста се базира на PCR, който е разработен за две породо-специфични мутации отговорни за автозомно-рецесивно наследяващото се заболяване МА (Berg et al., 1997). Тестът включва отделна амплификация на два екзона на гена за лизозомна алфа-манозидаза последвана от рестрикционна дигестия на ампликоните. По този начин се показва, че една от мутациите (662G-->A заместване) е отговорна за МА при Глоуейското говедо. Друга мутация (961T-->C) заместване е уникално свързана с МА при породите Ангус, Мъри грей и Брангус в Австралия. Тази мутация е открита и при Червения Ангус внесен от Канада в Австралия под формата на ембриони. Допълнителни изследвания показват, че двете породо-специфични мутации може да увеличат честотата си на разпространение в Шотландия, а чрез износ на животни и замразена сперма в Америка, Нова Зеландия и Австралия.

Няма лечение за това заболяване. Единственият начин за борба е генотипизирането на одобрените за разплод бици, майките бикопроизводителки и елитната част от кравите в породата.

Литература.

1.Berg T., Healy P.J., Tollersrud O.K., Nilssen O. Molecular heterogeneity for bovine alpha-mannosidosis: PCR based assays for detection of breed-specific mutations. Res. Vet. Sci. 1997, 63(3):279-82.

2. Healy P.J., Babidge P.J., Embury D.H., Harrison M.A., Judson G.J., Mason R.W., Petterson D.S., Sinclair A.J. Control of alpha-mannosidosis in Angus cattle. Aust Vet J. 1983 May;60(5):135-7.
Наследствен дефицит в активността на ензима Бета - манозидaза (Beta-Mannosidоsis). Много наследствени дефицити на лизозомните ензими и свързаното с това натрупване на непреработени субстрати са добре характеризирани при човека и животните. Дефицитът на бета - манозидазата води до нарушение в преработката на специфичен полизахарид и това най-напред е установено при Нубийската коза и по-късно при човека и говедото (породата Салерс). При посочената порода говеда има заместваща мутация на G с A в позиция 2574 на комплементарната ДНК, която кодира последователности на незрелия стоп кодон близо до 3' края на протеин кодиращата част. За да се помогне на фермерите, отглеждащи говеда от породата Салерс е разработен PCR тест за откриване на носителите на тази мутация в гена, кодиращ ензима бета-манозидаза. Използването на този тест посочи наличието на два псевдо гена за бета-манозидаза Части от псевдогените са амплифицирани с алел-специфични праймери и след това секвенирани.

Бета-манозидозата се наблюдава при новородените телета от породата Салерс в Северна Америка и Нова Зеландия, но тази порода произхожда от Франция и е много вероятно това заболяване да съществува и там. Болните телета не растат нормално и показват клатещи движения на главата и тремор на други телесни части. Лицевите деформации включват прогнатизъм (издаване на горната или долната челюст), тесни цепки на клепачите и насочени назад уши. Установява се дисмиелинизация на централната нервна система, церебрални вентрикуларни разширения, намалено количество на плазмата, лимфоцитите, намалена активност на тъканната бета-манозидаза, отлагане на олигозахариди в тъканите и намалена концентрация на тироидния хормон в кръвния серум. Болните телета реагират на силен шум, имат запазен слухов потенциал и малки малки ушни и очни лезии. Тиромегалията и реномегалията са особено драматични при болните телета. Най-силно са засегнати проксималния бъбречен тубуларен епител (P2 сегмент), тироидния фоликуларен епител, много невронни субтипове и ретикулоендотелни клетки. На ултарструкторно ниво увеличените лизозоми са изпълнени с блестящи и тънки мембрани или мътно съдържание. Бялата материя в церебралната хемисфера е по-силно засегната от дисмиелинизацията отколкото клетките на главния и гръбначния мозък. Умереното и силно вентрикуларно разширение в главния мозък е по-скоро свързано със загуба на бяла материя отколкото с някакви обструкции. Аксоновите сфероидни изменения са добре изразени в оптичния нерв, бялото вещество в главния и малкия мозък, крайните участъци на триделния нерв и се дължат на отлагане на неразградени въглехидрати в изграждащите ги клетки. Основно това са олигозахариди като дизахарида ManP1-4GlcNAc и тризахарида Man,B1-4GlcNAc,B1-4GlcNAc. За да се улесни диагнозата на заболяването се използва тънкослойна хроматография на тъканни и уринарни олигозахариди. Диагнозата се поставя окончателно след определяне активността на бета-манозидазата в пламата или лимфоцитите. Понастоящем за борба с това наследствено заболяване се използва ДНК теста разработен от Leipprandt et al. (1999).

Литература

1. Margaret Z. Jones and Bruce Abbittt. Bovine beta-Mannosidosis.American journal of Pathology, Vol. 142, No. 3, March 1993