Молекулярна биология и наследствени болести при домашните животни проф дсн Лилян Сотиров

1. 
   РНК полимераза
   
2. 
   РНК зависима ДНК полимераза
   
3. 
   Хеликаза
   
4. 
   Метилаза
   

1. 
   Повърхностно информационен комплекс
   
2. 
   Пре-инициационен комплекс
   
3. 
   Първично – имитиращ комплекс
   
4. 
   Първично изискуем комплекс
   

1. 
   Белтъци и РНК
   
2. 
   Белтъци и ДНК
   
3. 
   Белтъци, Въглехидрати и ДНК
   
4. 
   Ензими и ДНК
   

1. 
   Дадена аминокиселина и съответният за нея антикодон разположен в тРНК
   
2. 
   Зрели вирусни частици, като така предотвратяват инфекциозният процес
   
3. 
   Различни соли и витамини
   
4. 
   Чужди ДНК молекули
   

1. 
   А място, Р място и Е място
   
2. 
   Място Уотсън, Място на Крик и място на Льовенхук
   
3. 
   Място на привличане, място на улавяне и място на синтез на ППВ
   
4. 
   Нито един от посочените отговори
   

1. 
   EF-Tu
   
2. 
   EF-G
   
3. 
   EF-Ts
   
4. 
   Нито един от посочените
   
5. 
   Всички посочени
   

1. 
   УАУ
   
2. 
   УГГ
   
3. 
   УУГ
   
4. 
   Нито един от посочените
   
5. 
   Всички посочени
   

Както вече описахме потокът на наследствената информация тече от молекулите на ДНК към РНК, а от там към белтъчините. Този генетичен закон е валиден за цялото биологично царство населяващо нашата планета. Макар срещащи се изключително рядко, възможни са и отклонения от това правило:

• 
  Репликация на РНК
  

• 
  Обратно презаписване
  

Естествен „враг“ на бактериите са една група вируси наречени бактериофаги. След като попаднат в бактериалната клетка те интегрират част от генома си в бактериалната хромозома, като така принуждават клетката да транскрибира и транслира специфични за фага белтъчини. В бозайническият организъм основна роля при защитата от чужди в генетично отношение агенти се базира на имунната система. При бактериите такива сложни имунни взаимодействия не са известни. Те са изградили специфични механизми на разпознаване на чуждите ДНК последователности и тяхното отстраняване от бактериалният геном. Всяка бактерия има специфичен набор от ензими (в зависимост от най-честите „нападатели“), които са способни да разпознаят чуждите ДНК фрагменти. Тези ензими разпознават нуклеотидни последователности от 4 до 8 нуклеотида и могат да разкъсват двойноверижна ДНК. В последствие изрязаните последователности се отстраняват и кръговата хромозома на бактерията отново се затваря. Ензимите извършващи тези манипулации се означават като рестрикционни ензими или рестриктази. Бактериалният геном е предпазен от въздействието на рестриктазите посредством специфичното метилиране на определени участъци от ДНК веригата.

Названията на тези ензими са трибуквени и са свързани с бактериите, от които са изолирани. Първата главна буква съвпада с родовото име, а втората и третата малки букви са първите две букви на вида - например AluI идва от Arthrobacter luteus. Римските цифри са в зависимост от реда на откриването. Често след първите три букви и преди римската цифра има друга буква, показваща щама - например EcoRI, EcoRII са първите две изолирани рестриктази от Escherichia coli. До момента са известни приблизително 3500 вида рестриктазни ензима, всеки от които има различна секвенция на разкъсване.

Съществуват три класа рестриктази:

• 
  I клас – те разпознават определена нуклеотидна последователност и разкъсват двойноверижната ДНК верига без значение при кои нуклеотиди ще стане разкъсването.
  
• 
  II клас – те разпознават определена нуклеотидна последователност и разкъсват ДНК веригата в определен нейн участък
  
• 
  III клас – те разпознават определена нуклеотидна последователност и разкъсват двойноверижната ДНК верига на разстояние от няколко нуклеотида от разпознатото място.
  

• 
  Рестриктази образуващи крайща от едноверижни участъци – лепливи крайща
  
• 
  Рестриктази образуващи двойноверижни крайща – тъпи крайща.
  

За образуването на тъпи крайща можем да дадем пример с рестриктаза EcoRV:

Както при прокариотите, така и при еукариотите наследствената информация на клетката е концентрирана в хромозомите и намиращата се в тях ДНК молекула. Интересен факт е, че наследствена информация се съхранява и в цитоплазмата и по-точно в някои цитоплазмени органели и включения. Въпреки, че гените разположени в цитоплазмените структури са сравнително малко, трябва да отбележим тяхното участието във формирането на генотипа на клетката. Прието е гените, които се намират в хаплоидният хромозомен набор да се означават като геном на клетката, а гените разположени в цитоплазмените структури (плазмогените) формират плазмона на клетката. Цитоплазмени гени се откриват в пластидите, митохондриите, блефаробластите и в центрозомата на клетките, като гените откриващи се в тях се бележат като – пластогени, хондриогени, блефарогени и центриогени.

Към тази група се отнасят гените разположени в плазмидите, вирусите и епизомите. Пример може да бъде даден с половият фактор F при някои бактерии. Този фактор представлява епизом и се предава по време на конюгацията на бактериите. Пример за плазмидна наследственост можем да дадем с R факторите които придават на бактериите специфична устойчивост към определени антибиотици. Те представляват пръстеновидни, двойноверижни ДНК молекули, способни да се реплицират самостоятелно. В нуклеотидната им последователност присъстват гени отговорни за синтезата на различни белтъчини, правещи бактериите резистентни към антибиотици. Пример за такива белтъчини можем да дадем с β-лактамазите. Тази група ензими има свойството да разгражда β-лактамните антибиотици – пеницилини, цефалоспорини др. Установени са плазмиди, носещи гени за устойчивост към високи концентрации от други антибиотици, тежки метали и др. Характерното за тях е, че при деленето на клетката R факторите се предават и на дъщерните клетки. Така е възможно да съществуват огромни колонии от бактерии, които не се повлияват от лечението на пациента. Тъй като те придават устойчивост към цели групи антибиотици, лекарят внимателно трябва да следи здравословното състояние на пациента и при незадоволителни резултати от лечението трябва да назначи антибиотик от друга терапевтична група. Характерна особеност на пластидите е тяхната автономна репликация, независеща от етапа на развитие на клетката в която се намират. Повечето познати плазмиди имат способността да се самореплицират много бързо като за времето на една репликация на бактериалната хромозома те се реплицират около 30 пъти. По време на репликацията е възможна рекомбинация между различните плазмиди в клетката като така се образуват нови комбинации от плазмидни гени. Съществуват плазмиди които могат да включат в себе си цялата бактериална хромозома, като при преминаването от клетка в клетка, те пренасят и бактериалната хромозома. Този тип плазмиди се използват в генното инженерство при секвенирането на непознати хромозоми. Друга тяхна особеност е способността им да се интегрират в бактериалният геном, а в последствие и да се реплицират заедно с него. Тези две техни свойства се използват в методите на генното инженерство.

• 
  Пластиди - те са самовъзпроизвеждащи се клетъчни органели, които при клетъчното делене се разпределят равномерно в дъщерните клетки. За първи път тяхното действие върху организма било наблюдавано при растението нощна красавица. При него се установяват два вида пластиди – нормални и неспособни да образуват хлорофил пластиди. Така някои индивиди притежават само нормалният вид пластиди и листата им имат зелен цвят. Други придежават и двата вида пластиди и при тях отделни участъци са зелени (наличие на хлорофил), а други остават бели. Установено е, че в пластидите се намира голямо количество ДНК, която от една страна е автономна, но понякога влиза във взаимоотношения с ядрените гени.
  
• 
  Митохондрии - те са жизененоважни клетъчни органели отговорни за дишането на клетката. Както бе описано по-горе те притежават собствена ДНК, РНК и специфични белтъци. Тяхната автономност е толкова голяма, че дори генетичният код, който е идентичен за всички живи организми на Земята, при тях е различен. Митохондриалната ДНК е концентрирана в кръгови молекули не съдържащи хистони и кодира собствени иРНК, рРНК и тРНК. Характерно за митохонтриалната ДНК е нейната консервативност и изключително слаба изменчивост. Характерно за рибозомите е, че те се самовъзпроизвеждат чрез делене независимо от ядрените гени. При разделянето на клетката във всяка дъщерна клетка попадат приблизително равни количества рибозоми. Изследването на рибозомалната ДНК е един от най-точните методи за доказване на майчинство, тъй като в процеса на оплождането яйцеклетката представлява „пълна“ клетка с всички клетъчни органели, включително и рибозоми. При оплождането от сперматозоида навлиза само неговото ядро, което в последствие се обединява с това на яйцеклетката и се образува зигота. Това означава, че в зиготата, а и във всички клетки на растящият организъм ще се открива рибозомална ДНК идентична с тази на майката. При съответствие между рибозомалната ДНК на майка и предполагаемо нейно дете, достоверността за родственост е приблизително 100%. Базирайки се на този феномен, скоро бе започнат международен проект на ООН със заглавие „В търсене на биологичната Ева“.
  

Репликацията на РНК молекули се среща в растителни и животински клетки в случаи на:

1. 
   Заразяване с ДНК вируси
   
2. 
   Заразяване с РНК вируси
   
3. 
   Заразяване с приони
   
4. 
   Заразяване с бактериофаги
   

1. 
   Ензими от I, II и III клас
   
2. 
   Ензими за синтез на РНК
   
3. 
   Ензими за синтез на ДНК
   
4. 
   Ензими за превръщане на ДНК в РНК
   

1. 
   Пластиди и митохондрии
   
2. 
   Плазмиди и нуклеозоми
   
3. 
   Рибозоми и микротръбички
   
4. 
   Нито един от посочените
   

При опити да създадат петунии с по-интензивен цвят екип от холандски и американски учени добавили допълнителни копия на кодиращата цвят секвенция в генома на растението. След разцъфването на растението било устновено, че повечето петунии били чисто или частично бели, вместо червени, както било очаквано. При направеният анализ било установено, че както нормалните, така и изкуствените ДНК копия били изключени. По късно било установено, че причината за това явление е РНК интерференцията (RNAi). По същество RNAi е механизъм, при който в присъствието на двойноверижна РНК молекула, хомоложна на определена иРНК (от нормален ген), експресията на втората се преустановява. Поради блокирането на даден ген механизмът бил означен като пост транскрипционно генно заглушшаване. Този механизъм се използва доста сполучливо при някои растения, при които се цели намаляване на експресията на даден ген или група от гени. За целта в клетките се интродуцират антисенс РНК, които в последствие се свързват комплементарно с клетъчните сенс РНК. Първоначално се е смятало, че по този начин двойноверижната РНК не може да се транслира, но в наши дни е известно че това се дължи на интерференцията. РНК интерференцията е много специфичен и високоефективен процес извършван от сложен организационен апарат. Установено е, че след като в апарата попадне двойноверижна РНК молекула той я нарязва посредством специфичен ензим наречен Dicer. След това ензима се насочва и започва да унищожава всички едноверижни РНК молекули комплементарни на една от първоначалните две. Двойноверижните РНК спомагат образуването на малки интерфериращи РНК (siRNAs), които са компонент на РНК разграждащи ензимни комплекси (RNA-induced silencing complex) и от своя страна водят до разрушаването на комплементарните на тях едноверижни РНК. Предполага се, че РНК интерференцията е възникнала като защитен механизъм към някои вируси, които на определен етап от инфектирането са представени под двойноверижна РНК молекула. РНК интерференцията е клетъчен механизъм, чрез който се контролира генната експресия. Установено е, че части от генома се транскрибират в микро РНК молекули (miRNAs), образуващи двойноверижна фуркетна структура. При откриването на такива структури, РНК интерфериращата конструкция се активира и унищожава, както miRNA, така и всички нормални иРНК комплементарни на нея. По този начин клетката осъществява посттранскрипционен контрол на някои гени. Наличие на микро РНК молекули е открито при бактерии, растения и бозайници.

Описаните малки РНК молекули (miRNAs и siRNAs) се различават по своята биогенеза. Микро РНК молекулите произлизат от дълги едноверижни РНК (ssRNA), способни да се навиват около оста си и да формират несъвършенни двойноверижни РНК (dsRNA). Те от своя страна се процесират от РНКаза III ензимите Drosha и Dicer. Малките интерфериращи РНК молекули (siRNAs) са процесирани само от ензими от групата Dicer, като изходните молекули са перфектни (без празни пространства) двойноверижни РНК молекули. Интересен е факта, че miRNAs подтискат експресията на гените на посттранскрипционно ниво, докато siRNAs могат да осъществяват репресия както на транскрипционно, така и на посттранскрипционно ниво. Смята се, че при животните микро РНКите контролират експресията на приблизително 35% от гените. При растенията броят на miRNAs е по-малък, но там те притежават по-широк спектър на действие.

https://www.youtube.com/watch?v=cK-OGB1_ELE

РНК интерференция и HIV

HIV инфекцията е един от най-големите проблеми на съвременнта медицина. Антивирусната терапия включва използването на множество антивирусни агенти, но при продължителното им използване се установява развитие на резистентни линии на вируса. Наследствената информация на този вирус е базирана на РНК като след инфекцита на клетката РНК геномът се освобождава в цитоплазмата. В последствие провирусът се интегрира в генома на клетката като синтезира кДНК посредством ензима обратна транскриптаза. Така клетката се принуждава да произвежда аминокиселинни последователности специфични за вируса. При експериментални условия е установено, че трансфектирани клетки с наличие на siRNAs целящи HIV-1 секвенциите, блокират развитието на вируса. Проблемът е доставянето на тези siRNAs постоянно в клетките на организма. Една от работните хипотези в момента е базирана на използването на интегриращ се вирусен вектор (лентивирус), който да експресира постоянни нива на малки интерфериращи РНК целящи HIV-1 вируса. Така вирусната репликация би могло да бъде подтисната. Проблем при развитието на тази процедура е изборът на подходящ вектор, както и високата специфичност на РНК интерференцията. Малките интерфериращи РНК молекули са високо специфични към нуклеотидната последователност. Така една единствена точкова мутация във вирусният геном, би направила манипулацията не ефективна.

Също както СПИН така и развитието на рак е глобален бич и разгадаването на механизмите за възникването и контролирането му не представлява просто научен интерес, а е въпрос от първостепенно значение за всички раково болни хора. Предполага се, че РНК интерференцията може да бъде впрегната в лечението на онкобоните хора. За целта е създадена малка интерферираща РНК молекула, чиято цел е анти-апоптозният ген BCL 2. Експериментите показват, че при комбинирането на химиотерапия с РНК интерференция се постигат сравнително високи резултати. Важно е да отбележим, че ефективността на РНК интерференцията при борбата с метастазните тумори зависи от откриването на подходящи клетъчни мишени и от методите за доставяне на siRNAs до клетките. Към момента за най-подходящ начин за доставка на siRNAs до клетката се смята включването на двойноверижните малки РНК в липозомни капсули, които се сливат с цитоплазмените мембрани на туморните клетки. Така малките интерфериращи РНКи се пренасят в цитоплазмата на раковата клетка.

Високата специфичност на RNAi гарантира разграждането на РНК секвенции със строго специфичен нуклеотиден състав. Повечето генетични заполявания се базират на точкови мутации, т.е. замяна само на един нуклеотид с друг. Към момента големи световни лаборатории се опитват да разработят механизми, чрез които да интродуцират в клетките siRNA специфични за увреденият алел. Така РНК интерферентната машина унищожава само засегантите транскрипти и оставя нормалните транскрипти интактни.

Под терминът генно инженерство се разбира методология за получаване и комбиниране на ДНК молекули в клетъчна среда. Генното инженерство се занимава с извличане на гени от един организъм и пренасянето им в друг. За извършването на това вмешателство в генома на даден организъм е необходимо да се преодолеят редица биологични бариери. В нашето ежедневие все по-често се споменава терминът клониране? Клонирането е похват използван в генното инженерство, който бихме могли да разделим на два основни вида:

• 
  Клониране на организми – асексуално възпроизводство на индивиди, генетично еднакви с организма от който са били клонирани. Поради изключителната опасност и нарушаване на биоетичните норми, този тип клониране е строго забранен в по-голямата част от света. Механизмите, които са били използвани за получаване на клонинги се базират на отстраняването на ядрото на яйцеклетката и пренасянето на ядро от соматична клетка на друг индивид. Повечето автори прилагат електрически шок върху получената клетка, в следствие на което тя започва да се дели и образува зигота. Пример за такъв клонинг е световно известната овца Доли. На практика клонирането на цели организми е почти невъзможен процес (базирано на знанията на биолозите към момента), поради факта, че някои от гените в пренесеното ядро вече са супресирани, тъй като те са кодирали продукти за ембриогенезата в организма. Веднъж „изключени“ тези гени не се експресират, поради което огромна част от клонираните клетки загиват още през първите часове от развитието си. Отклонения са описвани и в строежа на органите при абортирали плодове. Установява се, че огромна част от клетките в жизненоважни органи – черен дроб, бъбреци и др. липсват или са с нехарактерен строеж, поради което плодовете се абортират или умират малко след раждането. Клонирането на цели организми доведе и до задаването на много въпроси свързани с биоетиката и развитието на човечеството като цяло.
  
• 
  Клониране на гени – пренасяне на гени от един организъм в друг, при което акцептора придобива нови свойства. Посредством клонирането на гени се създават така известните в нашето ежедневие Генно модифицирани организми – ГМО. По този начин са получени редица бактерии, в които са били пренесени гени кодиращи важни за човека белтъчини. Пример за такива белтъчини е хормонът инсулин, чиито ген от десетилетия е пренесен в бактерията E. coli. Така бактериите синтезират този важен продукт за инсулинзависимите диабетно болни хора. По този механизъм са получени и редица растения, които са придобили възможността да се развиват на по-студена или по-топла среда, устойчивост към насекоми, бактерии, вируси, високи концентрации на тежки метали и др.
  

• 
  Получаване на желаният фрагмент от ДНК на организма донор.
  
• 
  Обединяване на таргетната секвенция с определен вектор.
  
• 
  Внасяне на вектора в акцепторната клетка.
  

Пренасянето на даден ДНК фрагмент не е възможно да бъде извършено пряко. Винаги се използва определен посредник – вектор. За пренасянето на фрагментите от една ДНК верига на друга важно участие вземат описаните по-горе рестрикционни ензими. Обикновено се използват един или два рестрикционни ензима, които изрязват желаният участък от веригата донор. Знаейки нуклеотидната последователност на таргетният участък (особено в неговите крайща), се подбира ензим който срязва така веригата, че в двата и края да остане едноверижен участък, изграден от един или няколко нуклеотида. Тези едноверижни участъци се означават като лепливи краища на веригата. Обикновено същите ензими се използват за рестрикция и на дестинейшън веригата, като при нейното срязване също остават лепливи крайща, комплементарни на крайщата на пренасяният фрагмент. При смесването на двете молекули по принципа на комплементарността едноверижните участъци се съединяват и изграждат химични връзки по между си. Така фрагмент от ДНК (съдържащ определен ген) от един организъм може да бъде прехвърлен в генома на друг като вторият ще произвежда специфичните за първият организъм белтъчини. Макар и рядко се използват рестриктазни ензими, които срязват веригите тъпо (без едноверижни крайща). В такива случаи след смесването на изрязаният фрагмент и акцепторната молекула в реакционната смес се добавят специфични ензими способни да съединяват тъпи крайща.

За да се завърши процеса е необходимо получените фаги или плазмиди носители на рекомбинантна ДНК да бъдат интрудоцирани в клетката реципиент. Механизмите, които най-често се използват са трансдукция или трансфекция. Така рекомбинантният плазмид попада в клетката реципиент и започва да експресира както собствената си генетична програма, така и пренесеният фрагмент. Получената бактерийна популация се означава като клон, а методът на нейното получаване – молекулно клониране. Една от най-трудните задачи пред генно-инженерните методи е пренасянето на целият набор от регулиращи фрагменти за съответният ген – промотор, регулатор и терминатор. При пренос единствено на кодиращата секвенция (без регулаторните области), генът не би могъл да се експресира. Всички описани до момента похвати се използват при трансгенозата в бактерии. Поради далеч по-сложният строеж на ДНК при еукариотите клонирането на ДНК при тези организми е далеч по-трудоемко.

Векторите които се използват при клонирането на ДНК, трябва да отговарят на няколко условия:

• 
  Да могат да самореплицират всички включени в тях участъци.
  
• 
  Да съдържат специфични участъци, служещи за тяхното разпознаване.
  
• 
  Да сърържат специфичен рестрикционен сайт (или няколко) позволяващи даден рестриктазен ензим да среже тяхната верига.
  
• 
  Да съдържат в себе си селективни маркерни гени (най често за устойчивост към антибиотици).
  

• 
  Плазмидни вектори – използват се при ДНК клониране в бактерии. Тези вектори представляват генетично модифицирани плазмиди, съдържащи специфични нуклеотидни последователности, позволяващи лесно интегриране на чужди ДНК фрагменти. Почти винаги те съдържат един или няколко рестрикционни сайта, което позволява избор между няколко рестрикционни ензима в зависимост от ДНК фрагмента, който бихме желали да пренесем. Почти всички комерсиално разпространени вектори съдържат един или два гена за устойчивост към определени антибиотици, което ни позволява да отдиферинцираме колониите носители на плазмида от свободните от него. В повечето случаи са малки молекули съставени от около 10 000 базови двойки невъзможни да се предават при конюгация. Липсата на конюгативна активност е от особено значение за блокирането на предаването им от една на друга бактерия. Това им свойство има предимно предпазен характер, тъй като бактериите, в които те се установяват са и нормални обитатели на бозайническият организъм (E. coli). Така дори при изнасяне на такава бактерия извън лабораторията тя не би могла да пренесе трансгенният плазмид.
  
• 
  Фагови вектори – обикновено представляват генетичномодифицирани щамове на фаг ламбда (λ). Харктерно за тях е, че при нормални усложия след инфектирането на бактериалната клетка, те инкорпорират своята ДНК молекула в тази на клетката. Така при реплицирането на бактериалната ДНК клетката реплицира и ДНК на фага. Модифицираните щамове използвани в генното инженерство позволяват една част от тяхната ДНК да бъде заменена с чужда. Така при инфектирането на бактерията, наред с участък от фаговият геном, се интегрира и избрана чужда молекула. Фагите използвани като вектори могат да пренасят молекули до 20 000 базови двойки, което дава възможност за клониране на доста големи ДНК фрагменти.
  
• 
  Изкуствени вектори – космиди, BAC и YAC. В повечето случаи те са продукт на генното инженерство като една част от техният геном е съставена от хромозома на фаг ламбда, а друга е изградена от плазмидна ДНК. Това, което ги отличава от предходните два вида е, че те могат да пренасят фрагменти от 50 000 до 300 000 базови двойки.
  
• 
  Изкуствени бактериални хромозоми – обикновено това са вектори вградени в F фактора на бактериата. Те имат възможността да пренасят ДНК фрагменти до 1000 кило бази.