Р е п у б л и к а б ъ л г а р и я министерство на здравеопазването наредба № …/ за определяне на подробни правила за представяне на информацията по чл. 19, пар. 4 на Регламент

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Течен хроматограф (ВЕТХ) с УВ детектор с променлива дължина на вълната и 10 µl дозаторна капиляра.

5.3. Аналитична колона: 250 mm x 4,6 mm, от неръждаема стомана, с пълнеж Spherisorb ODS 5 µm или еквивалентен.

5.4. Водна баня.

5.5. Ултразвукова вана.

5.6. Центрофуга.

5.7. Центрофужни епруветки с обем 15 сm³ (ml).

6.1. Приготвяне на пробата

6.1.1. В центрофужна епруветка (5.7) се претегля около 0,1 g (М) с точност 0,001 g от пробата и се прибавят 5 cm³ (ml) метанол (4.1).

6.1.2. Загрява се 10 min. на водна баня (5.4) при температура 50⁰С, след което епруветката се поставя в ултразвукова вана (5.5), където престоява до пълно диспергиране на пробата.

6.1.3. Охлажда се и след това се центрофугира при 3500 rрm в продължение на 5 min.

6.1.4. Бистрата течност се прехвърля в мерителна колба от 25 cm³ (ml).

6.1.5. Пробата се екстрахира повторно с 5 cm³ (ml) метанол (4.1). Екстрактите се обединяват в мерителната колба от 25 cm³ (ml).

6.1.6. В мерителната колба от 25 cm³ (ml) се прибавят с пипета 2,0 cm³ (ml) от основния разтвор на вътрешен стандарт (4.6). Долива се до марката с метанол (4.1) и се разбърква. Този разтвор се използва за определянето, описано в 6.4.

6.2. Хроматографиране

6.2.1. Течният хроматограф (5.2) се настройва по обичайния начин. Потокът на подвижната фаза се нагласява на 2,0 cm³ (ml)/min.

6.2.2. Дължината на вълната на УВ-детектора се нагласява на 210 nm.

6.3. Стандартна крива

6.3.1. Дозират се по 10 µl от всеки от стандартните разтвори на бензилов алкохол (4.7) и се измерват площите на пиковете на бензиловия алкохол и на 4-етоксифенола.

6.3.2. За всеки от стандартните разтвори на бензилов алкохол (4.7) се изчислява отношението на площта на пика на бензиловия алкохол към този на 4-етоксифенола. Построява се стандартна крива, като тези отношения се нанасят по ординатата, а съответните концентрации на бензилов алкохол в µg/сm³ (ml)–по абсцисата.

6.4. Определяне

6.4.1. Инжектират се 10 µl от разтвора на пробата (6.1.6) и се измерват площите на пиковете на бензиловия алкохол и на 4-етоксифенола. Изчислява се отношението между площите на пиковете на бензиловия алкохол и на 4-етоксифенола. Тази процедура се повтаря с нови 10 µl порции от разтвора на пробата докато се получат стабилни резултати.

6.4.2. От стандартната крива (6.3.2) се отчита концентрацията на бензиловия алкохол, съответстваща на полученото отношение на площите на бензиловия алкохол към 4-етоксифенола.

7. Изчисления

Съдържанието на бензилов алкохол в пробата, като % (M/M), се изчислява по следната формула:

където:

За съдържание на бензилов алкохол от 1% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10%.

(¹) виж ISO 5725

ХХХІV. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА ЦИРКОНИЙ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЦИРКОНИЙ, АЛУМИНИЙ И ХЛОР В НЕАЕРОЗОЛНИ АНТИПЕРСПИРАНТИ

Методът включва пет етапа:

Този метод се отнася за идентификацията на цирконий в неаeрoзолни антиперспиранти. Не е направен опит за описване на методи, подходящи за идентификация на алуминиево-циркониевия хлоридно-хидроксиден комплекс [Al_XZr(OH)_YCl_Z.nH₂O].

Цирконият се идентифицира по характерната червено-виолетова утайка, която се образува с ализариново червено S в силно кисела среда.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Солна киселина, концентрирана (d₂₀ = 1,18 g/cm³ (ml)).

3.2. Разтвор на ализариново червено S (CI 58005) : 2% (М/V) воден разтвор на натриев ализарин сулфонат.

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.1. Към около 1 g от пробата се прибавят 2 cm³ (ml) вода в епруветка. Епруветката се запушва и се разклаща.

5.2. Прибавят се три капки разтвор на ализариново червено S (3.2) и след това–2 cm³ (ml) концентрирана солна киселина (3.1). Епруветката се запушва и се разклаща.

5.3. Оставя се да престои около 2 min.

5.4. Червено-виолетовото оцветяване на разтвора и утайката показва присъствие на цирконий.

Б. Определяне на цирконий

1. Област на приложение

Този метод се отнася за определяне на цирконий в алуминиево-циркониеви хлоридно-хидроксидни комплекси до максимална концентрация 7,5% (M/M) цирконий в неаерозолни антиперспиранти.

Цирконият се екстрахира от продукта в силно кисела среда и се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата бидестилирана.

3.1. Солна киселина, концентрирана (d₂₀ = 1,18 g/cm³ (ml)).

3.2. Солна киселина, 10% (V/V): в стъклена чаша се наливат 500 cm³ (ml) вода и се прибавят 100 cm³ (ml) концентрирана солна киселина (3.1) при непрекъснато разбъркване. Този разтвор се прехвърля в мерителна колба от 1 dm³ (l) и се долива до марката с вода.

3.3. Основен стандартен разтвор на цирконий, 1000 µg/cm³ (ml) в 0,5 М разтвор на солна киселина (SpectrosoL или еквивалентен).

3.4. Разтвор на алуминиев хлорид (хидратиран) (AlCl₃.6H₂O) : 22,6 g алуминиев хлорид хексахидрат се разтварят в 250 cm³ (ml) 10% (V/V) разтвор на солна киселина (3.2).

3.5. Разтвор на амониев хлорид: 5,0 g амониев хлорид се разтварят в 250 cm³ (ml) 10% (V/V) разтвор на солна киселина (3.2).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Магнитна бъркалка с нагревател.

4.3. Филтърна хартия (Whatman № 41 или еквивалентна).

4.4. Атомно-абсорбционен спектрометър с циркониева лампа (кухокатодна)

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата.

5.1.1. Претегля се около 1,0 g (М) с точност 0,001g от хомогенизираната проба от продукта в стъклена чаша от 150 cm³ (ml). Прибавят се 40 cm³ (ml) вода и 10 cm³ (ml) концентрирана солна киселина (3.1).

5.1.2. Чашата се поставя на магнитната бъркалка (4.2) и започва разбъркване и нагряване до кипене. За да се избегне бързото изсушаване, чашата се покрива с часовниково стъкло. Кипи се 5 min., чашата се сваля от бъркалката и се охлажда до стайна температура.

5.1.3. Съдържанието на чашата се филтрува през филтърна хартия (4.3) в мерителна колба от 100 cm³ (ml). Чашата се промива два пъти с по 10 cm³ (ml) вода и промивните води, след филтруване, се прибавят в колбата. Долива се до марката с вода и се разбърква. Този разтвор се използва и за определяне на алуминий (част В).

5.1.4. 20,00 cm³ (ml) от разтвора на пробата (5.1.3) се прехвърлят с пипета в мерителна колба от 50 cm³ (ml). Прибавят се 5,00 cm³ (ml) разтвор на алуминиев хлорид (3.4) и 5,00 cm³ (ml) разтвор на амониев хлорид (3.5). Долива се до марката с 10% (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия

Пламък - азотен оксид / ацетилен

Дължина на вълната - 360,1 nm

Корекция на фона - не

Процеп - 0,2 nm

Условия на горене: редукционен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В серия мерителни колби от 50 cm³ (ml) се поставят с пипета 5,00; 10,00; 15,00; 20,00 и 25,00 cm³ (ml) от основния стандартен разтвор на цирконий (3.3). Във всяка колба с пипета се прибавят 5,0 cm³ (ml) разтвор на алуминиев хлорид (3.4) и 5,00 cm³ (ml) разтвор на амониев хлорид (3.5). Долива се до марката с 10% (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 100; 200; 300; 400 и 500 µg/cm³ (ml) цирконий.

По същия начин се приготвя празна проба, без да се прибавя стандартен разтвор на цирконий.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на празната проба (5.3.1) и получената стойност се използва като нулева концентрация на цирконий за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на цирконий (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на цирконий.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1.4). От стандартната крива се отчита концентрацията на цирконий, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

Съдържанието на цирконий в пробата се изчислява в % (M/M) по формулата:

където:

За съдържание на цирконий 1,00% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10% (M/M).

Като алтернативен метод на пламъковата атомно-абсорбционна спектрометрия се допуска атомно-емисионна спектрометрия с индуктивно свързана плазма (ICP-AES).

Този метод е подходящ за определяне на алуминий в алуминиево-циркониеви хлоридно-хидроксидни комплекси до максимална концентрация 12% (M/M) алуминий в неаерозолни антиперспиранти.

Алуминият се екстрахира от продукта в силно кисела среда и се определя чрез атомно-абсорбционна спектрометрия.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата бидестилирана.

3.1. Солна киселина, концентрирана (d₂₀ = 1,18 g/cm³ (ml).

3.2. Разтвор на солна киселина, 1% (V/V): в стъклена чаша се наливат 500 cm³ (ml) вода и се прибавят 10 cm³ (ml) концентрирана солна киселина (3.1) при непрекъснато разбъркване. Този разтвор се прехвърля в мерителна колба от един литър и се долива до марката с вода.

3.3. Основен стандартен разтвор на алуминий, 1000 µg/cm³ (ml) в 0,5 М разтвор на солна киселина (SpectrosoL или еквивалентен).

3.4. Реактив калиев хлорид: 10,0 g калиев хлорид се разтварят в

250 cm³ (ml) 1% (V/V) разтвор на солна киселина (3.2).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Атомно-абсорбционен спектрометър с алуминиева лампа (кухокатодна).

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

Разтворът, приготвен в В.5.1.3 се използва за определяне съдържанието на алуминий.

5.1.1. 5,00 cm³ (ml) от разтвора на пробата (В.5.1.3) се прехвърлят с пипета в мерителна колба от 100 cm³ (ml) и се прибавят се 10,00 cm³ (ml) реактив калиев хлорид (3.4). Долива се до марката с 1% (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква.

5.2. Условия за атомно-абсорбционна спектрометрия

Пламък - азотен оксид / ацетилен

Дължина на вълната - 309,3 nm

Процеп - 0,7 nm

Корекция на фона - не

Условия на горене - редукционен пламък; за максимална абсорбция е необходимо оптимизиране на височината на горелката и подаването на газовата смес.

5.3. Стандартна крива

5.3.1. В серия мерителни колби от 100 cm³ (ml) се поставят с пипета 1,00; 2,00; 3,00; 4,00 и 5,00 cm³ (ml) от основния стандартен разтвор на алуминий (3.3). Във всяка колба с пипета се прибавят по 10,00 cm³ (ml) реактив калиев хлорид (3.4), долива се до марката с 1% (V/V) разтвор на солна киселина (3.2) и се разбърква. Тези разтвори съдържат съответно 10; 20; 30; 40 и 50 µg/cm³ (ml) алуминий.

По същия начин се приготвя празна проба, без да се прибавя стандартен разтвор на алуминий.

5.3.2. Измерва се абсорбцията на празната проба (5.3.1) и получената стойност се използва като нулева концентрация на алуминий за стандартната крива. Измерва се абсорбцията на всеки стандартен разтвор на алуминий (5.3.1). Построява се стандартна крива, като се нанасят стойностите на абсорбцията спрямо концентрацията на алуминий.

5.4. Определяне.

Измерва се абсорбцията на пробата (5.1.1). От стандартната крива се отчита концентрацията на алуминий, съответстваща на абсорбцията, получена за разтвора на пробата.

Съдържанието на алуминий в пробата се изчислява в % (M/M) по формулата:

където:

За съдържание на алуминий 3,5% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10% (M/M).

Като алтернативен метод на пламъковата атомно-абсорбционна спектрометрия се допуска атомно-емисионна спектрометрия с индуктивно свързана плазма (ICP-AES).

Този метод се отнася за определяне на хлор, присъстващ като хлорен йон в алуминиево-циркониеви хлоридно-хидроксидни комплекси в неаерозолни антиперспиранти.

Хлорният йон в продукта се определя чрез потенциометрично титруване със стандартен разтвор на сребърен нитрат.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Азотна киселина, концентрирана (d₂₀ = 1,42 g/cm³ (ml).

3.2. Азотна киселина, 5% (V/V) : 25 cm³ (ml) концентрирана азотна киселина (3.1) се прибавят към 250 cm³ (ml) вода в стъклена чаша при непрекъснато разбъркване. Този разтвор се прехвърля в мерителна колба от 500 cm³ (ml) и се долива до марката с вода.

3.3. Ацетон.

3.4. Сребърен нитрат, 0,1 М стандартен разтвор (AnalaR или еквивалентен).

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Магнитна бъркалка с нагревател.

4.3. Сребърен електрод.

4.4. Каломелов сравнителен електрод.

4.5. рН-миливолтметър, подходящ за потенциометрично титруване.

5.1. Приготвяне на пробата

5.1.1. В стъклена чаша от 250 cm³ (ml) се претегля около 1,0 g (М) с точност 0,001 g от хомогенизираната проба на продукта. Прибавят се 80 cm³ (ml) вода и 20 cm³ (ml) 5% (V/V) разтвор на азотна киселина (3.2).

5.1.2. Чашата се поставя на магнитната бъркалка (4.2). Започва разбъркване и нагряване до кипене. За да се избегне бързото изсушаване, чашата се покрива с часовниково стъкло. Кипи се 5 min., чашата се сваля от бъркалката и се охлажда до стайна температура.

5.1.3. Прибавят се 10 cm³ (ml) ацетон (3.3), потапят се електродите (4.3 и 4.4) под повърхността и се започва разбъркване. Титрува се потенциометрично с 0,1 М разтвор на сребърен нитрат (3.4) и се построява диференциална крива за определяне на еквивалентния пункт (V cm³ (ml).

6. Изчисления

Съдържанието на хлор в пробата, в % (M/M) се изчислява по формулата:

където:

За съдържание на хлор 4% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10% (M/M).

Отношението Al : Zr се изчислява по формулата:

Отношението (Al + Zr) : Cl се изчислява по формулата:

Методът се отнася за качественото и количествено определяне на:

Концентрациите на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин и хлорхексидин, определени по този метод, се изразяват в % (M/M).

Идентифицикацията и определянето се извършва чрез обратно-фазова високо ефективна течна хроматография (ВЕТХ) c УВ детектор. Хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин и хлорхексидин, се идентифицират по техните времена на задържане в хроматографската колона.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за ВЕТХ”, а водата бидестилирана.

4.1. Метанол

4.2. 1-Хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат

4.3. Оцетна киселина, ледена (d₂₀ = 1,05 g/cm³ (ml))

4.4. Натриев хлорид

4.5. Подвижни фази

4.5.1. Разтворител І: 0,005 М разтвор на 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в метанол (4.1), доведен до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

4.5.2. Разтворител ІІ: 0,005 М разтвор на 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) във вода, доведен до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

Забележка: Ако е необходимо да се подобри формата на пиковете, подвижните фази могат да се модифицират и приготвят както следва:

- Разтворител І: разтварят се 5,84 g натриев хлорид (4.4) и 1,1013g 1-хептан-сулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в 100 cm³ (ml) вода. Прибавят се 900 cm³ (ml) метанол (4.1) и се довежда до рН 3,5 с ледена оцента киселина (4.3).

- Разтворител ІІ: разтварят се 5,84 g натриев хлорид (4.4) и 1,1013 g 1-хептан-сулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в 1 dm³ (l) вода и се довежда до рН-3,5 с ледена оцента киселина (4.3).

4.6. Хексамидин диизетионат [ C₂₀H₂₆N₄O₂.2C₂H₆O₄S ]

4.7. Дибромохексамидин диизетионат [ C₂₀H₂₆Br₂N₄O₂.2C₂H₆O₄S ]

4.8. Дибромопропамидин диизетионат [ C₁₇H₁₈Br₂N₄O₂.2C₂H₆O₄S ]

4.9. Хлорхексидин диацетат [ C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀.2C₂H₄O₂ ]

4.10. Стандартни разтвори: приготвят се 0,05% (М/V) разтвори на всеки от четирите консерванта ( 4.6 до 4.9) в разтворител І (4.5.1).

4.11. 3,4,4´-Трихлорокарбанилид (триклокарбан)

4.12. 4,4^´-Дихлоро-3-(трифлуорометил) карбанилид (халокарбан)

5.1. Стандартно лабораторно оборудване

5.2. Високо ефективен течен хроматограф с УВ детектор с варираща дължина на вълната

5.3. Аналитична колона: неръждаема стомана, дължина - 30 сm; вътрешен диаметър - 4 mm; напълнена с µ-Bondapack С₁₈, 10 µm или подобен.

5.4. Ултразвукова вана

6. Идентификация

6.1. Подготовка на пробата: Претеглят се около 0,5 g от пробата с точност 0,001 g в 10 cm³ (ml) мерителна колба и се долива до марката с разтворител І (4.5.1). Колбата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 10 min. Разтворът се филтрува или центрофугира. Филтратът се отделя за хроматографски анализ.

6.2. Хроматография

6.2.1. Градиент на подвижната фаза

6.2.2. Скорост на потока на подвижната фаза (6.2.1) до 1,5 cm³ (ml)/min и температура на колоната до 35⁰С.

6.2.3. Дължина на вълната на детектора - 264 nm.

6.2.4. Инжектират се 10 µl от всеки стандартен разтвор (4.10) и се записват хроматограмите им.

6.2.5. Инжектират се 10 µl от разтвора на пробата (6.1) и се записва хроматограмата.

6.3. Идентифицира се присъствието на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин или хлорхексидин, като се сравняват времената на задържане на записаните пикове в 6.2.5 с тези, получени от стандартните разтвори в 6.2.4.

7.1. Подготовка на стандартни разтвори. Използва се един от консервантите (4.6 до 4.9), който липсва в мострата, като вътрешен стандарт. Ако това не е възможно, препоръчва се да се използва триклокарбан (4.11) или халокарбан (4.12).

7.1.1. Изходен разтвор на консерванта, 0,05% (М/V), идентифициран в 6.3, в разтворител І (4.5.1).

7.1.2. Изходен разтвор на консерванта, 0.05% (М/V), избран като вътрешен стандарт, в разтворител І (4.5.1).

7.1.3. За всеки идентифициран консервант се приготвят 4 стандартни разтвора, като се отмерват в серия от 10 сm³ (ml) мерителни колби подходящи количества от изходния разтвор на идентифицирания консервант (7.1.1) и подходящи количества от изходния разтвор на вътрешния стандарт (7.1.2) според долната таблица. Всяка колба се долива до необходимия обем с разтворител І (4.5.1) и се разбърква.

(*) Тези стойности са дадени като индикация и отговарят на концентрациите на идентифицираните консерванти в приготвените стандартни разтвори, изхождайки от изходния разтвор, съдържащ точно 0,05% от идентифицирания консервант.

7.2. Подготовка на пробата.

7.2.1. Претегля се около 0,5 g (р) с точност 0,001 g от пробата в мерителна колба от 10 cm³ (ml), добавят се 1,0 cm³ (ml) от вътрешния стандартен разтвор (7.1.2) и 6 cm³ (ml) от разтворител І (4.5.1) и се разбърква.

7.2.2. Колбата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 10 min. Охлажда се. Долива се до необходимия обем с разтворител І и се разбърква. Центрофугира се или се филтрува през нагъната филтърна хартия. Събира се горната фаза или филтрата за хроматографиране.

7.3. Хроматография

7.3.1. Градиента на подвижната фаза, скоростта на потока, температурата на колоната и дължината на вълната на детектора на HPLC (5.2), са както е препоръчано при етап идентификация (6.2.1 до 6.2.3).

7.3.2. Инжектират се 10 µl от разтвора на пробата (7.2.2) и се измерват пиковите площи. Повтаря се процеса с инжектиране на 10 µl от разтвора на пробата, докато се получат постоянни резултати. Изчислява се съотношението на пиковата площ, получена от анализираната проба с пиковата площ, получена от вътрешния стандарт.

7.4. Калибриране

7.4.1. Инжектират се 10 µl от всички стандартни разтвори (7.1.3) и се измерват пиковите площи.

7.4.2. За всеки стандартен разтвор (7.1.3) се изчислява съотношението на пиковите площи на хексамидина, дибромохексамидина, дибромопропамидина или хлорхексидина спрямо пиковата площ на вътрешния стандарт. Начертава се стандартна крива, като на ордината се нанасят тези съотношения, а на абсцисата- съответните концентрации на идентифицираните консерванти в стандартните разтвори, в µg/cm³ (ml).

7.4.3. От стандартната крива (7.4.2) се отчитат концентрациите на идентифицираните консерванти, съответсващи на изчислените пикови площи в 7.3.2.

8
.1.1.Съдържанието на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин или хлорхексидин в пробата, като % (M/M) се изчислява по следната формула:

където:

р е масата на анализираната проба (7.2.1) в g;

с е концентрацията на консерванта в разтвора на пробата, отчетена от стандартната крива в µg/cm³ (ml);

МW₁ е молекулното тегло на основната форма присъстващ консервант;

МW₂ е молекулното тегло на съответната сол (виж т. 10).

9. Повторяемост (¹)

За концентрация 0,1% (М/М) на хексамидина, дибромохексамидина, дибромопропамидина или хлорхексидина, разликата в резултатите на две паралелно проведени определения на една и съща проба, не трябва да надвишава 0,005%.

(¹) виж ISO 5725

Методът се отнася за идентификация и определяне на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина в козметични продукти. Отделни процедури описват идентификацията на тези консерванти; определянето на пропионова киселина, 4-хидроксибензоена киселина, салицилова киселина, сорбинова киселина и бензоена киселина.

Количествата на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина, определени по този метод, се изразяват като % (M/M) на свободните киселини.

След киселинно-основна екстракция на консервантите, екстрактът се анализира чрез тънкослойна хроматография (ТСХ), използвайки непосредствена дериватизация. В зависимост от резултатите, идентификацията се потвърждава чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ) или за пропионовата киселина, чрез газова хроматография.

2.1. Общо изискване

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.2. Ацетон.

2.3. Диетилов етер.

2.4. Ацетонитрил.

2.5. Толуен.

2.6. n-Хексан.

2.7. Парафин, течен.

2.8. Солна киселина, 4 М.

2.9. Калиев хидроксид, 4 М.

2.10. Калциев хлорид, CaCl₂.2H₂O.

2.11. Литиев карбонат, Li₂CO₃.

2.12. 2-Бром-2´-ацетонафтон.

2.13. 4-Хидроксибензоена киселина.

2.14. Салицилова киселина.

2.15. Бензоена киселина.

2.16. Сорбинова киселина.

2.17. Пропионова киселина.

2.18. Сравнителни разтвори

Приготвят се 0,1% (M/V) разтвори (100 mg/100 cm³ (ml) от всеки от петте консерванта (2.13 до 2.17) в диетилов етер.

2.19. Реактив за дериватизация

0,5% (M/V) разтвор на 2-бром-2´ацетонафтон (2.12) в ацетонитрил (2.4) (50 mg/10 cm³ (ml). Този разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

2.20. Разтвор на катализатор

0,3% (M/V) разтвор на литиев карбонат (2.11) във вода (300 mg/100 cm³ (ml). Този разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

2.21. Подвижна фаза

Толуен (2.5) : ацетон (2.2) = 20 : 0,5 (V/V).

2.22. Течен парафин (2.7) : n-хексан (2.6) = 1 : 2 (V/V).

Стандартно лабораторно оборудване.

3.1. Водна баня, която може да поддържа температура 60⁰С.

3.2. Хроматографска вана.

3.3. Източник на УВ светлина, 254 и 366 nm.

3.4. Плаки за тънкослойна хроматография Kieselgel 60, без флуоресцентен индикатор, 20х20 cm, дебелина на слоя 0,25 mm, с концентрираща зона 2,5x20 cm (Merck 11845 или еквивалентни).

3.5. Микроспринцовка, 10 µl.

3.6. Микроспринцовка, 25 µl.

3.7. Сушилня, която може да поддържа температура 105⁰С.

3.8. Стъклени епруветки от 50 cm³ (ml) със запушалки на винт.

3.9. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.

3.10. Универсална рН-индикаторна хартия, рН 1-11.

3.11. Стъклени шишенца за проби от 5 cm³ (ml).

3.12. Ротационен изпарител (Rotavapor или еквивалентен).

3.13. Нагревателна плоча.

4. Процедура

4.1. Приготвяне на пробата

В стъклена епруветка от 50 cm³ (ml) (3.8) се претегля около 1 g от пробата. Прибавят се 4 капки 4 M солна киселина (2.8) и 40 cm³ (ml) ацетон (2.2). За силно алкални продукти, като тоалетни сапуни, е необходимо да се прибавят 20 капки 4 М солна киселина (2.8). Проверява се стойността на рН дали е около 2 с индикаторна хартия (3.10). Епруветката се запушва и се разклаща енергично в продължение на 1 min.

Ако е необходимо да се улесни екстрахирането на консервантите в ацетоновата фаза, сместа се нагрява леко до около 60⁰С за стопяване на течната фаза.

Разтворът се охлажда до стайна температура и се филтрува през филтърна хартия (3.9) в конична колба.

20 cm³ (ml) от филтрата се прехвърлят в конична колба от 200 cm³ (ml), прибавят се 20 cm³ (ml) вода и се разбърква. рН на сместа се довежда до около 10 с 4 М калиева основа (2.9), като за измерване на рН се използва индикаторна хартия (3.10).

Прибавя се 1 g калциев хлорид (2.10) и се разклаща енергично.

Филтрува се през филтърна хартия (3.9) в делителна фуния от 250 cm³ (ml), съдържаща 75 cm³ (ml) диетилов етер и се разклаща енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и водният слой се излива в конична колба от 250 cm³ (ml). Етерният слой се отстранява.

Като се използва индикаторна хартия (3.10), рН на водния слой се довежда до около 2 с помощта на 4 М солна киселина (2.8). Прибавят се 10 cm³ (ml) диетилов етер (2.3), колбата се запушва и се разбърква енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и етерният слой се прехвърля в ротационен изпарител (3.12). Водният слой се изхвърля.

Етерният слой се изпарява почти до сухо и остатъкът се разтваря в 1 cm³ (ml) диетилов етер (2.3). Разтворът се прехвърля в шишенце за проби (3.11).

4.2. Тънкослойна хроматография

За всички стандартни разтвори и от проби, които ще се хроматографират се нанасят със спринцовка (3.5) по около 3 µl от разтвора на литиев карбонат (2.20) на еднакви разстояния върху стартовата линия на концентриращата зона на плаката за ТСХ (3.4) и се изсушава в ток от студен въздух.

Плаката се поставя върху нагревателната плоча (3.13), загрята до 40⁰С, за да остават петната колкото е възможно по-малки. С микроспринцовка (3.5) се нанасят по 10 µl от стандартните разтвори (2.18) и от разтвора на пробата (4.1) върху стартовата линия на плаката, точно върху петната от литиев карбонат.

Накрая се нанасят по около 15 µl от реактива за дериватизация (2.19) (2-бром-2^′-ацетонафтон), отново точно върху петната, където са нанесени стандартните разтвори и разтвора на пробата, както и разтвора на литиев карбонат.

Плаката се нагрява в сушилня (3.7) при температура 80⁰С в продължение на 45 min. След охлаждане, плаката се поставя в хроматографската вана (3.2), която предварително е доведена до равновесие за 15 min (без да се прилага облицоване с филтърна хартия) с подвижната фаза (2.21). Плаката престоява, докато фронтът на елуента достигне разстояние 15 cm от стартовата линия (това може да отнеме приблизително 80 min).

Плаката се изсушава в ток от студен въздух и получените петна се разглеждат под УВ-светлина (3.3). За засилване на флуоресценцията на бледите петна, плаката може да се потопи в сместа течен парафин/n-хексан (2.22).

Изчислява се R_f-стойността на всяко петно.

Сравнява се R_f-стойността и поведението при УВ-облъчване на петната от пробата и петната от стандартните разтвори.

Прави се предварително заключение относно присъствието и идентичността на наличните консерванти. Провежда се ВЕТХ, описана в част Б или, ако се докаже пропионова киселина – газова хроматография, описана в част Б. Сравняват се получените времена на задържане с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ, ВЕТХ или ГХ и на тази база се определя окончателната идентификация на присъстващите в пробата консерванти.

Б. Определяне на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина и салицилова киселина

1. 
   Принцип
   

2.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а), а където е необходимо с чистота “за ВЕТХ”.

Използваната вода трябва да бъде бидестилирана или с еквивалентна чистота.

2.2. Етанол, абсолютен.

2.3. 4-хидроксибензоена киселина.

2.4. Салицилова киселина.

2.5. Бензоена киселина.

2.6. Сорбинова киселина.

2.7. Натриев ацетат (CH₃COONa.3H₂O).

2.8. Оцетна киселина (d₄²⁰ = 1,05 g/cm³ (ml).

2.9. Ацетонитрил.

2.10. Сярна киселина, 2 М.

2.11. Калиев хидроксид, 0,2 М.

2.12. 2-метоксибензоена киселина.

2.13. Смес етанол-вода : смесват се девет обема етанол (2.2) и един обем вода (2.1).

2.14. Разтвор на вътрешен стандарт

Приготвя се разтвор, който съдържа около 1g с точност 0,001 g 2-метоксибензоена киселина (2.12) в 500 cm³ (ml) смес етанол-вода (2.13).

2.15. Подвижна фаза за ВЕТХ.

2.15.1. Ацетатен буфер: към 1 dm³ (l) вода се прибавят 6,35 g натриев ацетат (2.7) и 20,0 cm³ (ml) оцетна киселина (2.8) и се разбърква.

2.15.2. Подвижната фаза се приготвя чрез смесване на 9 обема ацетатен буфер (2.15.1) и един обем ацетонитрил (2.9).

2.16. Основен разтвор на консервантите

Претеглят се с точност 0,001 g около 0,05 g 4-хидроксибензоена киселина (2.3), 0,2 g салицилова киселина (2.4), 0,2 g бензоена киселина (2.5) и 0,05 g сорбинова киселина (2.6) в мерителна колба от 50 cm³ (ml) и се долива се до марката със смес етанол-вода (2.13). Разтворът се съхранява в хладилник и е стабилен в продължение на една седмица.

2.17. Стандартни разтвори на консервантите

В серия от мерителни колби от 20 cm³ (ml) се поставят съответно 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 и 0,50 cm³ (ml) от основния разтвор (2.16). Във всяка колба се прибавят по 10,00 cm³ (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (2.14) и по 0,5 cm³ (ml) 2 М сярна киселина (2.10). Допълва се до марката със смес етанол-вода (2.13). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.

Стандартно лабораторно оборудване.

3.1. Водна баня, нагласена на 60⁰С.

3.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ-детектор с променлива дължина на вълната и 10 µl дозираща капиляра.

3.3. Аналитична колона

Неръждаема стомана, дължина – 12,5 до 25 cm, вътрешен диаметър – 4,6 mm, пълнеж – Nucleosil 5C18 или еквивалентен.

3.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.

3.5. Стъклени епруветки от 50 cm³ (ml) със запушалки на винт

3.6. Стъклени шишенца за проби от 5 cm³ (ml).

3.7. Парченца карборунд за кипене, размер 2 до 4 mm или еквивалентни.

4.1. Приготвяне на пробата

4.1.1. Приготвяне на проба без добавяне на вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (3.5) от 50 cm³ (ml) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm³ (ml) 2 М сярна киселина (2.10) и 40 cm³ (ml) смес етанол-вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 min, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване на екстракцията на консервантите в етанолната фаза, епруветката се поставя във водна баня (3.1), нагласена на 60⁰С точно за 5 min.

Епруветката се охлажда незабавно със студена вода и екстрактът престоява 1 h при температура 5⁰С и се филтрува през филтърна хартия (3.4). Около 2 cm³ (ml) от екстракта се прехвърля в шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5⁰С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 h от приготвянето.

4.1.2. Приготвяне на проба с добавяне на вътрешен стандарт

В стъклена епруветка от 50 cm³ (ml) (3.5) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm³ (ml) 2 М сярна киселина (2.10) и 30 cm³ (ml) смес етанол-вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7) и 10,00 cm³ (ml) разтвор на вътрешен стандарт (2.14), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 min., докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване на екстракцията на консервантите в етанолната фаза, епруветката се поставя във водна баня, при 60⁰С точно за 5 min.

Епруветката се охлажда незабавно със студена вода и екстрактът престоява 1 h при температура 5⁰С и се филтрува през филтърна хартия (3.4). Около 2 cm³ (ml) от екстракта се прехвърля във шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5⁰С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 h от приготвянето.

4.2. Високоефективна течна хроматография

Подвижна фаза: ацетонитрил/ацетатен буфер (2.15).

Скоростта на подвижната фаза през колоната се нагласява на 2,0±0,5 cm³ (ml)/min. Детекторът се настройва на 240 nm.

4.2.1. Стандартна крива

В течния хроматограф (3.2) се дозират по 10 µl от всеки от стандартните разтвори на консервантите (2.17). За всеки разтвор се определя отношението между височината на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт, получени от хроматограмите. Построява се графика за всеки консервант, като се нанасят отношенията на височините на пика спрямо съответните концентрации на всеки стандартен разтвор.

Проверява се дали получените зависимости за всеки стандартен разтвор са линейни.

4.2.2. Определяне

В течния хроматограф се дозират 10 µl от екстракта на пробата (4.1.1) и се записва хроматограмата. Дозират се 10 µl от стандартния разтвор на консерванти (2.17) и се записва хроматограмата. Сравняват се получените хроматограми. Ако в хроматограмата на екстракта на пробата (4.1.1) няма пик с приблизително същото време на задържане, както това на 2-метоксибензоената киселина (препоръчвания вътрешен стандарт), в течния хроматограф се дозират 10 µl от екстракта на пробата с добавен вътрешен стандарт (4.1.2) и се записва хроматограмата.

Ако на хроматограмата на екстракта от пробата (4.1.1) се наблюдава пречещ пик, който има време на задържане като на 2-метоксибезоената киселина, трябва да се избере друг подходящ вътрешен стандарт. (Ако един от изследваните консерванти отсъства от хроматограмата, този консервант може да бъде използван като вътрешен стандарт).

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

– Разделянето на пиковете в най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90 (за дефиниция на коефициента на разделяне виж фиг.1.)

Ако не е постигнато необходимото разделяне, трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза, чийто подбор продължава до задоволяване на изискванията.

– Коефициентът на асиметрия (A_S) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5 (за дефиниция на коефициента на асиметрия виж фиг. 2). Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.

– Базовата линия трябва да бъде стабилна.

За изчисляване на концентрацията на киселините-консерванти в разтвора на пробата се използват отношенията на височините на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт (2-метоксибензоена киселина) от стандартната крива.

Съдържанието на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина или салицилова киселина се изчислява в % (M/M) (x_i) по формулата:

където:

М^/ е концентрацията на консерванта в екстракта на пробата (4.1.2), получена от стандартната крива в µg/cm³ (ml).

За съдържание на 4-хидроксибензоена киселина 0,40%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

За съдържание на бензоена киселина 0,50 %, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,050 %.

За съдържание на салицилова киселина 0,50 %, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,045 %.

За съдържание на сорбинова киселина 0,60 %, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

7. Забележки

7.1. Резултатите от проведения тест за допустими отклонения от методиката показват, че количеството сярна киселина, която се добавя при екстракцията на киселините от пробата е критично и границите за количеството на обработваната проба трябва да се поддържат в посочения интервал.

7.2. По желание може да се използва подходяща предколона.

В. Определяне на пропионова киселина

1. Област на приложение

Този метод е подходящ за определяне на пропионова киселина с максимална концентрация 2% (M/M) в козметични продукти.

Концентрацията на пропионова киселина, измерена по този метод, се изразява като % (M/M) от масата на продукта.

След екстракция на пропионовата киселина от продукта, определянето се извършва чрез газова хроматография с използване на 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за газова хроматография”.

4.1. Етанол, 96% (V/V).

4.2. Пропионова киселина.

4.3. 2-Метилпропионова киселина.

4.4. Ортофосфорна киселина, 10% (M/V).

4.5. Стандартен разтвор на пропионова киселина

В мерителна колба от 50 cm³ (ml) се претегля около 1,00 g (p) с точност 0,001 g пропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

4.6. Разтвор на вътрешен стандарт

В мерителна колба от 50 cm³ (ml) се претегля около 1,00 g (М^/) с точност 0,001 g 2-метилпропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газов хроматограф с пламъчно-йонизационен детектор.

5.3. Стъклена епруветка (2х15 сm) със запушалка на винт.

5.4. Водна баня, нагласена на 60⁰С.

5.5. Стъклена спринцовка от 10 cm³ (ml) с мембранен филтър (диаметър на порите 0,45 µm).

6.1. Приготвяне на пробата

6.1.1. Приготвяне на проба без вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (5.3) се претегля около 1 g с точност 0,001 g от пробата (M). Прибавят се 0,5 cm³ (ml) фосфорна киселина (4.4) и 9.5 cm³ (ml) етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60⁰С (5.4) за 5 min за пълно разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

6.1.2. Приготвяне на проба с вътрешен стандарт

В стъклена епруветка (5.3) се претегля 1 g с точност 0,001 g от пробата (M). Прибавят се 0,5 cm³ (ml) фосфорна киселина (4.4), 0,50 cm³ (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.6) и 9.0 cm³ (ml) етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60⁰С (5.4) за 5 min за разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

6.2. Условия за газова хроматография

Препоръчват се следните работни условия:

Колона

Тип - неръждаема стомана

Диаметър - 1/8״

Пълнеж - 10% SP^TM 1000 (или еквивалентна) + 1% H₃PO₄ върху Chromosorb WAW 100 до 120 mesh.

Температура

Инжектор - 200⁰С

Колона - 120⁰С

Детектор - 200⁰С

Газ-носител - азот

Скорост на потока - 25 cm³ (ml)/min.

6.3. Хроматография

6.3.1. Стандартна крива

В серия мерителни колби от 20 cm³ (ml) се поставят съответно 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 и 4,00 cm³ (ml) разтвор на пропионова киселина (4.5). Във всяка колба се добавя с пипета 1,00 cm³ (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.6), доливат се до марката с етанол (4.1) и се разбъркват.

Приготвените по този начин разтвори съдържат М^/ mg/cm³ (ml) 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт (т.е. 1 mg/cm³ (ml) и р/4, р/2, р, 2р и 4р mg/cm³ (ml) пропионова киселина (т.е. 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 и 4,00 mg/cm³ (ml).

Инжектират се по 1 µl от всеки от тези разтвори и се построява стандартна крива, като на абсцисата се нанасят отношенията на масите на пропионовата киселина към 2-метилпропионовата киселина, а по ординатата - отношенията на съответните площи на пиковете им.

За всеки разтвор се правят по три инжектирания и се изчислява средната площ на пиковете.

6.3.2. Определяне

Инжектира се 1 µl от филтрата на пробата 6.1.1. Получената хроматограма се сравнява с тези на стандартните разтвори (6.3.1). Ако пикът има приблизително същото време на задържане както 2-метилпропионовата киселина, се сменя вътрешния стандарт. Ако не се наблюдава пречене, се инжектира 1 µl от филтрата на пробата 6.1.2 и се измерват площите на пика на пропионовата киселина и на пика на вътрешния стандарт.

Правят се три инжектирания за всеки разтвор и се изчислява средната площ на пиковете.

7.1. От стандартната крива, получена в 6.3.1 се отчита отношението на масите К, съответстващо на отношението на площите на пиковете, получени в 6.3.2.

7.2. От така полученото отношение на масите се изчислява съдържанието на пропионова киселина (x) в % (M/M), използвайки формулата:

където:

Резултатът се закръглява до втория знак.

За съдържание на пропионова киселина 2% (M/M), разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,12 %.

(¹) виж ISO 5725

ХХХVІІ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХИДРОХИНОН, ХИДРОХИНОН МОНОМЕТИЛОВ ЕТЕР, ХИДРОХИНОН МОНОЕТИЛОВ ЕТЕР И ХИДРОХИНОН МОНОБЕНЗИЛОВ ЕТЕР В КОЗМЕТИЧНИ ПРОДУКТИ

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за откриване и идентификация на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер (монобензон) в козметични продукти за осветляване на кожата.

Хидрохинонът и неговите етери се идентифицират чрез тънкослойна хроматография (ТСХ).

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Етанол, 96% (V/V).

3.2. Хлороформ.

3.3. Диетилов етер.

3.4. Подвижна фаза - хлороформ : диетилов етер = 66 : 33 (V/V).

3.5. Амоняк, 25% (M/M) (d₄²⁰ = 0,91 g/cm³ (ml).

3.6. Аскорбинова киселина.

3.7. Хидрохинон.

3.8. Хидрохинон монометилов етер.

3.9. Хидрохинон моноетилов етер.

3.10. Хидрохинон монобензилов етер (монобензон).

3.11. Стандартни разтвори

Стандартните разтвори трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба и са стабилни един ден.

3.11.1. В градуирана епруветка от 10 cm³ (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон (3.7) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm³ (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10 и се долива до обем 10 cm³ (ml) с етанол (3.1).

3.11.2. В градуирана епруветка от 10 cm³ (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон монометилов етер (3.8) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm³ (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10 и се долива до обем 10 cm³ (ml) с етанол (3.1).

3.11.3. В градуирана епруветка от 10 cm³ (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон моноетилов етер (3.9) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm³ (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10 и се долива до обем 10 cm³ (ml) с етанол (3.1).

3.11.4. В градуирана епруветка от 10 cm³ (ml) се претеглят 0,05 g хидрохинон монобензилов етер (3.10) с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm³ (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10 и се долива до обем 10 cm³ (ml) с етанол (3.1).

3.12. Сребърен нитрат.

3.13. 12-Молибденфосфорна киселина.

3.14. Калиев ферицианид хексахидрат.

3.15. Ферихлорид хексахидрат.

3.16. Реактиви за проявяване на петната:

3.16.1. Към 5% (M/V) воден разтвор на сребърен нитрат (3.12) се прибавя амоняк (3.5), докато образувалата се утайка се разтвори.

3.16.2. 10% (M/V) разтвор на 12-молибденфосфорна киселина (3.13) в етанол (3.1).

3.16.3. Приготвя се 1% (M/V) воден разтвор на калиев ферицианид (3.14) и 2% (M/V) воден разтвор на ферихлорид (3.15). Преди употреба се смесват равни части от двата разтвора.

4. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

4.1. Стандартно оборудване за ТСХ.

4.2. Готови плаки за ТСХ: силикагел GHR/UV₂₅₄; 20x20 cm (Machery, Nagel или еквивалентни); дебелина на слоя: 0,25 mm.

4.3. Ултразвукова вана.

4.4. Центрофуга

4.5. Ултравиолетова лампа, 254 nm.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

В градуирана епруветка от 10 cm³ (ml) се претеглят 3,0 g от пробата с точност 0,001 g. Прибавят се 0,250 g аскорбинова киселина (3.6) и 5 cm³ (ml) етанол (3.1). Прибавя се амоняк (3.5), докато рН стане 10 и се долива до обем 10 cm³ (ml) с етанол (3.1). Епруветката се затваря със запушалка и се хомогенизира в ултразвукова вана за 10 min. Филтрува се през филтърна хартия или се центрофугира при 3000 rpm.

5.2. Тънкослойна хроматография

5.2.1. Хроматографската вана се насища с подвижна фаза (3.4).

5.2.2. Върху плаката се нанасят по 2 µl от стандартните разтвори (3.11) и 2 µl от разтвора на пробата (5.1). Хроматограмата се развива на тъмно при стайна температура, докато фронтът на разтворителя достигне разстояние 15 cm от стартовата линия.

5.2.3. Плаката се изважда и се изсушава при стайна температура.

5.3. Проявяване на петната

5.3.1. Плаката се разглежда под УВ-светлина при 254 nm и се отбелязва разположението на петната.

5.3.2. Плаката се напръсква с един от следните реактиви:

– реактив сребърен нитрат (3.16.1);

– реактив 12-молибденфосфорна киселина (3.16.2); нагрява се до 120⁰С;

– разтвор на калиев ферицианид и разтвор на ферихлорид (3.16.3).

6. Отчитане на резултатите

Изчислява се R_f-стойността на всяко петно.

Сравняват се петната, получени от разтвора на пробата с петната на стандартните разтвори по отношение на: техните R_f-стойности, цветът на петната при УВ-облъчване и цветът на петната след оцветяване с реактивите за напръскване.

Прилага се ВЕТХ, описана в следващия раздел (Б) и се сравняват времената на задържане на пика (пиковете) на пробата с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ и ВЕТХ, за да се потвърди присъствието на хидрохинон и/или неговите етери.

7. Забележки

При описаните условия се наблюдават следните R_f-стойности:

Хидрохинон - 0,32

хидрохинон монометилов етер - 0,53

хидрохинон моноетилов етер - 0,55

хидрохинон монобензилов етер - 0,58

Методът се отнася за определяне на хидрохинон, хидрохинон монометилов етер, хидрохинон моноетилов етер и хидрохинон монобензилов етер в козметични продукти за осветляване на кожата.

Пробата се екстрахира със смес вода/метанол при слабо нагряване до стопяване на всички липидни материали. Определянето на всички търсени вещества се извършва посредством течна хроматография с обърнати фази и УВ детектор.

3.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация “за ВЕТХ”, а водата бидестилирана.

3.2. Метанол.

3.3. Хидрохинон.

3.4. Хидрохинон монометилов етер.

3.5. Хидрохинон моноетилов етер.

3.6. Хидрохинон монобензилов етер (монобензон).

3.7. Тетрахидрофуран, “ВЕТХ” чистота.

3.8. Смес вода : метанол = 1:1 (V/V). Смесват се един обем вода с един обем метанол (3.2).

3.9. Подвижна фаза–смес: тетрахидрофуран : вода = 45:55 (V/V). Смесват се 45 обема тетрахидрофуран (3.7) и 55 обема вода.

3.10. Стандартен разтвор

В мерителна колба от 50 cm³ (ml) се претеглят с точност 0,001 g 0,06 g хидрохинон (3.3), 0,08 g хидрохинон монометилов етер (3.4), 0,10 g хидрохинон моноетилов етер (3.5) и 0,12 g хидрохинон монобензилов етер (3.6). Разтварят се и се долива до марката с метанол (3.2).

Стандартният разтвор се приготвя чрез разреждане на 10,00 cm³ (ml) от този разтвор до 50,00 cm³ (ml) със смес вода : метанол (3.8). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.

4. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

4.1. Водна баня, поддържаща температура 60⁰С.

4.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ-детектор с променяща се дължина на вълната и дозатор с 10 µl капиляра.

4.3. Аналитична колона

Хроматографска колона от неръждаема стомана, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 4,6 mm, пълнеж Zorbax фенил (химически свързан фенетилсилан върху Zorbax SIL, допълнително дезактивиран (end-capped) с триметилхлорсилан), размер на частиците 6 µm или еквивалентна. Да не се използва предколона, различна от “phenyl guard” или еквивалентна.

4.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, бяла лента № 5892, или еквивалентна.

5. Процедура

5.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба от 50 cm³ (ml) се претегля 1 g от пробата (M) с точност 0,001 g. Пробата се диспергира в 25 cm³ (ml) смес вода/метанол (3.8). Колбата се запушва и се разклаща енергично до получаване на хомогенна суспензия. Разклаща се поне 1 min. Колбата се поставя във водна баня (4.1) при 60⁰С за улесняване на екстракцията. Колбата се охлажда и се долива до марката със смес вода/метанол (3.8). Екстрактът се филтрува с филтърна хартия (4.4). ВЕТХ-определянето трябва да се извърши в рамките на 24 h от приготвянето на екстракта.

5.2. Високоефективна течна хроматография

5.2.1. Скоростта на подвижната фаза (3.9) се нагласява на 1,0 cm³ (ml)/min, а детекторът се настройва на 295 nm.

5.2.2. Дозират се 10 µl от разтвора на пробата, получен както е описано в 5.1 и се записва хроматограмата. Измерва се площта на пиковете. Извършва се калибриране, както е описано в 5.2.3. Сравняват се хроматограмите, получени за пробата и за стандартния разтвор. Използват се площите на пиковете и коефициентите на детектора (RF), получени съгласно 5.2.3, за изчисляване на концентрациите на анализираните вещества в разтвора на пробата.

5.2.3. Стандартна крива

Инжектират се 10 µl от стандартния разтвор (3.10) и се записва хроматограмата. Инжектира се няколко пъти, докато се получи постоянна площ на пика.

Определя се коефициента на детектора RF_i:

където:

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

- Разделянето на пиковете в най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90. (за дефиниция на коефициента на разделяне виж фиг. 1.)

Ако не е постигнато необходимото разделяне, трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза до получаване на добро разделяне.

– Коефициентът на асиметрия (A_S) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5. (За дефиниция на коефициента на асиметрия виж фиг. 2.) Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.

– Базовата линия трябва да е стабилна.

За изчисляване на концентрацията (концентрациите) на анализираното вещество (вещества) в пробата се използват площите на пиковете на анализираните вещества. Концентрацията на анализираното вещество в пробата се изчислява като % (M/M) (x_i) по формулата:

където:

7.1. За съдържание на хидрохинон 2,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,13%.

7.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер 1,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,1%.

7.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер 1,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11%.

7.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер 1,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11%.

8.1. За съдържание на хидрохинон 2,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,37%.

8.2. За съдържание на хидрохинон монометилов етер 1,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,21%.

8.3. За съдържание на хидрохинон моноетилов етер 1,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,19%.

8.4. За съдържание на хидрохинон монобензилов етер 1,0%, разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба при различни условия (различни лаборатории, различни аналитици, различни апарати и/или различно време) не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,11%.

9. Забележки

9.1. Когато е установено съдържание на хидрохинон, значително по-голямо от 2% и се изисква по-точна оценка на съдържанието му, екстрактът от пробата (5.1) трябва да се разреди до концентрация, която би се получила от проба, съдържаща 2% хидрохинон и определянето се повтаря.

(При някои апарати абсорбцията може да бъде извън интервала на линейност на детектора при високи концентрации на хидрохинон.)

9.2. Пречещи фактори

Описаният по-горе метод дава възможност за определяне на хидрохинон и негови етери при единично изократично хроматографиране. Използването на “фенил” колона осигурява достатъчно време на за държане на хидрохинона, което не може да се гарантира, когато се използва С₁₈ колона с описаната подвижна фаза.

Освен това, този метод е податлив на влиянието на пречещи вещества, като редица парабени. В такива случаи определянето трябва да бъде повторено с използване на различни системи подвижна/неподвижна фаза. Подходящи методи могат да бъдат намерени в публикациите 1 и 2, а именно:

Колона: Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 сm, или еквивалентна:

Температура - 36⁰С

Скорост - 1,5 cm³ (ml)/min

Подвижна фаза:

за хидрохинон - метанол : вода = 5 : 95 (V/V)

за хидрохинон монометилов етер – метанол : вода = 30 : 70 (V/V)

за хидрохинон монобензилов етер – метанол : вода = 80 : 20 (V/V) (²).

Колона: Spherisorb S5-ODS, или еквивалентна:

Подвижна фаза - вода : метанол = 90 : 10 (V/V)

Скорост - 1,5 cm³ (ml)/min

Тези условия са подходящи за хидрохинон (³).
(¹) виж ISO 5725

(²) M.Herpol-Boremans et M.-O.Masse, Identification et dosage de l’hydroquinone et de ses ethers methylique et benzylique dans les produits cosmetiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986).

(³) J.Firth and I.Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.

ХХХVІІІ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА 2-ФЕНОКСИЕТАНОЛ, 1-ФЕНОКСИПРОПАН-2-ОЛ, МЕТИЛ, ЕТИЛ, ПРОПИЛ, БУТИЛ И БЕНЗИЛ 4-ХИДРОКСИБЕНЗОАТ В КОЗМЕТИЧНИТЕ ПРОДУКТИ.

А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Област на приложение

Методът се отнася до тънкослойно-хроматографска процедура, която в комбинация с методиката за определяне, описана в част Б, позволява идентификацията на 2-феноксиетанол, 1-феноксипропан-2-ол, метил, етил, пропил, бутил и бензил 4-хидроксибензоат в козметичните продукти.

Консервантите се извличат от подкислена козметична проба с ацетон. След филтруване, ацетоновият разтвор се смесва с вода и мастните киселини се утаяват в алкална среда, като техни калциеви соли. Алкалната смес (ацетон/вода) се обработва с диетилов етер за отстраняване на липофилните вещества. След подкисляване, консервантите се екстрахират с диетилов етер. Аликвотна част от диетилетерния екстракт се накапва върху плака покрита с тънък слой силикагел. След проявяване плаката се наблюдава под УВ-светлина и петната се оцветяват с реактива на Millon.

3.1. Общи положения

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.2. Ацетон

3.3. Диетилов етер

3.4. н -Пентан

3.5. Метанол

3.6. Оцетна киселина, ледена

3.7. Солна киселина (HCI), разтвор 4 mol/dm³ (mol/l)

3.8. Калиев хидроксид (КОН), разтвор 4 mol/dm³ (mol/l)

3.9. Калциев дихлорид дихидрат (CaCI₂.2H₂O)

3.10. Реактив за оцветяване на Millon. Реактивът на Millon (живачен ІІ нитрат) е в наличност в търговската мрежа (Fluka 69820).

3.11. 2-Феноксиетанол

3.12. 1-Феноксипропан-2-ол

3.13. Метил 4-хидроксибензоат (метилпарабен)

3.14. Етил 4-хидроксибензоат (етилпарабен)

3.15. н-Пропил 4-хидроксибензоат (пропилпарабен)

3.16. н-Бутил 4-хидроксибензоат (бутилпарабен)

3.17. Бензил 4-хидроксибензоат (бензилпарабен)

3.18. Стандартни разтвори

За всяко от стандартните вещества (3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 и 3.17) се приготвя 0,1% (М/V) разтвор в метанол.

3.19. Разтворител за проявяване на хроматограмата (подвижна фаза). Смесват се 88 обема n-пентан (3.4) и 12 обема ледена оцетна киселина (3.6).

Стандартно лабораторно оборудване и:

4.1. Водна баня с възможност за поддържане на температура 60⁰С.

4.2. Съд за проявяване на хроматограмата (хроматографска вана).

4.3. Източник на УВ светлина, 254 nm.

4.4. Плаки за тънкослойна хроматография, 20x20 cm, покрити с 0,25 mm силикагел 60F₂₅₄ с концентрирана зона (Merck № 11798, Darmstadt или еквивалентни).

4.5. Пещ с възможност за поддържане на температура 105⁰С.

4.6. Сешоар за коса със сух въздух.

4.7. Ролка за нанасяне на реактива на Millon с дължина около 10 cm, външен диаметър около 3,5 cm и дебелина на вълнения пласт 2 до 3 mm (виж забележката под т.5.2).

4.8. Колби стъклени със запушалки и обем 50 cm³ (ml).

4.9. Електрическа плоча с терморегулатор и настройка на температурата около 80⁰С. За получаване на равномерно разпределение на температурата плочата се покрива с алуминиева пластина с размери 20х20 cm и дебелина около 6 mm.

5. Процедура

5.1. Подготовка на пробата

В колба (4.8) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. Прибавят се четири капки разтвор на солна киселина (3.7) и 40 cm³ (ml) ацетон. За силно алкалните козметични продукти, като тоалетен сапун, се добавят 20 капки разтвор на солна киселина. Колбата се запушва и съдържанието и се нагрява внимателно до около 60⁰С, с което се улеснява екстракцията на консервантите в ацетоновата фаза. Разклаща се в продължение на 1 min., рН на разтвора се измерва с индикаторна хартия, коригира се до рН  3 със солна киселина (3.7), повторно се разклаща 1 min. и след охлаждане до стайна температура се филтрува през книжен филтър. От филтрата се отпипетират 20 cm³ (ml) и се разреждат с 60 cm³ (ml) вода в конусна колба от 200 cm³ (ml). Разтворът се алкализира с калиев хидроксид (3.8) до рН 10 (по индикаторна хартия), добавя се 1 g калциев дихлорид дихидрат (3.9) и се разклаща енергично. Филтрува се през книжен филтър в делителна фуния от 250 cm³ (ml) съдържаща 75 cm³ (ml) диетилов етер. Фунията се разклаща силно 1 min. и след отделяне на фазите водният слой се събира в конусна колба от 200 cm³ (ml). Разтворът се подкислява до рН около 2 с разтвор на солна киселина (3.7) (по индикаторна хартия), добавят се 10 cm³ (ml) диетилов етер и отново се разклаща енергично 1 min. Изчаква се двете фази да се разделят и 2 cm³ (ml) от етерния слой се прехвърлят в епруветка от 5 cm³ (ml) със запушалка.

5.2. Тънкослойна хроматография

Хроматографската плака (4.4) се поставя върху загрятата плоча (4.9) и на стартовата линия в концентрационната зона се нанасят по 10 µl от стандартните разтвори (3.18) и 100 µl от пробата (5.1). Изпаряването на разтворителя се ускорява с въздушна струя. Изсушената хроматографска плака се оставя да се охлади до стайна температура, след което се поставя в хроматографска вана (4.2) със 100 cm³ (ml) подвижна фаза. Хроматографският процес се провежда при стайна температура и продължава докато фронтът на разтворителя стигне на 15 cm от стартовата линия. Плаката се изважда от ваната, суши се с горещ въздух от сешоар (4.6) и се наблюдава под ултравиолетова светлина (4.3). Местата на петната се отбелязват. За отстраняване на излишната оцетна киселина плаката се нагрява 30 min. в сушилня (4.5) при 100⁰С. Петната на консервантите се оцветяват с реактива на Millon (3.10), който се нанася с ролка (4.7), докато плаката се навлажни равномерно.

Забележка