Р е п у б л и к а б ъ л г а р и я министерство на здравеопазването наредба № …/ за определяне на подробни правила за представяне на информацията по чл. 19, пар. 4 на Регламент

Идентификацията се извършва по R_f- стойностите на петната от пробите с тези на стандартите, както и чрез сравняване на поведението им под ултравиолетова светлина и на цвета им след нанасяне на реактива на Millon. Тези данни дават предварителна информация за идентичността на консервантите. Ако се появят парабени трябва да се проведе разделяне с високоефективна течна хроматография (ВЕТХ), описана в раздел Б. Получените резултати се комбинират с тези от тънкослойната хроматография за потвърждаване на присъствието на 2-феноксиетанол, 1-феноскипропан-2-ол и парабените.

7.1. Реактивът на Millon е токсичен, поради което се прилага чрез една от описаните процедури. Не се препоръчва пръскането.

7.2. Други съединения, съдържащи хидроксилни групи могат също да се оцветят с реактива на Millon. Таблица с цветовете и R_f-стойностите, получени за някои консерванти използвайки тънкослойнохроматографската процедура, е публикувана в N. De Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato - Soetardhi и А. Schouten (1987): Определяне на консерванти в козметични продукти. Тънкослойно хроматографска процедура за идентификацията на консерванти в козметични продукти (J. Chromatography 410, 395-411).

7.3. В следващата таблица са посочени R_f-стойностите за някои консерванти. Същите могат да се използват ориентировъчно при идентифициране на изследваните проби.

Съединение	100 х Rf	Цвят
4-хидроксибензоена киселина	11	червен
Метилпарабен	12	червен
Етилпарабен	17	червен
Пропилпарабен	21	червен
Бутилпарабен	26	червен
Бензилпарабен	16	червен
2-феноксиетанол	29	жълт
1-феноксипорпан-2-ол	50	жълт

7.4. Не се разделят 4-хидроксибензоената киселина и метилпарабена. Идентификацията на тези съединения трябва да се потвърди чрез метода на високо-ефективна течна хроматография (ВЕТХ), описан в част Б и сравняване на времената на задържане, получени от пробата с тези на стандартите.

Методът се отнася за определяне на 2-феноксиетанол, 1-феноскипропан-2-ол, метил 4-хидроксибензоат, етил 4-хидроксибензоат, пропил 4-хидроксибензоат, бутил 4-хидроксибензоат и бензил 4-хидроксибензоат в козметични продукти.

Количествата на консервантите, определени с този метод се изразяват като % (M/M).

Пробата се подкислява чрез добавяне на сярна киселина и суспендира в смес от етанол и вода. След леко загряване на сместа за втечняване на липидната фаза и подобряване на количествената екстракция, сместа се филтрува. Консервантите във филтрата се определят чрез обратно фазова ВЕТХ. Като вътрешен стандарт се използва 4-хидроксибензоат.

4.1. Основни положения

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за ВЕТХ”, а водата бидестилирана.

4.2. Етанол, абсолютен

4.3. 2-Феноксиетанол

4.4. 1-Феноксипропан-2-ол

4.5. Метил 4-хидроксибензоат (метилпарабен)

4.6. Етил 4-хидроксибензоат (етилпарабен)

4.7. н-Пропил 4-хидроксибензоат (пропилпарабен)

4.8. Изопропил 4-хидроксибензоат (изопропилпарабен)

4.9. н -Бутил 4-хидроксибензоат (бутилпарабен)

4.10. Бензил 4-хидроксибензоат (бензилпарабен)

4.11. Тетрахидрофуран

4.12. Метанол

4.13. Ацетонитрил

4.14. Сярна киселина (Н₂SO₄) разтвор 2 mol/dm³ (mol/l)

4.15. Смес етанол/вода. Смесват се 9 обема етанол (4.2) и 1 обем вода.

4.16. Разтвор на вътрешен стандарт. Претеглят се около 0,25 g с точност 0,001 g изопропилпарабен (4.8), прехвърлят се в мерителна колба от 500 cm³ (ml) и след разтваряне се долива до марката със смес етанол/вода (4.15)

4.17. Подвижна фаза: тетрахидрофуран/вода/метанол/ацетонитрил.

Смесват се 5 обема тетрахидрофуран, 60 обема вода, 10 обема метанол и 25 обема ацетонитрил.

4.18. Изходни стандартни разтвори на консервантите. Претеглят с точност 0,001 g 0,2 g 2-феноксиетанол, 0,2 g 1-феноксипропан-2-ол, 0,05 g метилпарабен, 0,05 g етилпарабен, 0,05 g бутилпарабен и 0,025 g бензилпарабен в мерителни колби от 100 cm³ (ml) и разтворите се доливат до марката със смес етанол/вода (4.15).

Разтворите са стабилни до една седмица при съхраняване в хладилник.

4.19. Стандартни разтвори на консервантите. От изходните стандартни разтвори (4.18) се прехвърлят съответно 20,00 cm³ (ml), 10 cm³ (ml) 5,00 cm³ (ml), 2,00 cm³ (ml) и 1,00 cm³ (ml) в мерителни колби от 50 cm³ (ml). Във всяка колба се прибавят по 10 cm³ (ml) разтвор на вътрешния стандарт (4.16) и 1,0 cm³ (ml) разтвор на сярна киселина (4.14) и се долива до марката със смес етанол/вода (4.15). Разтворите трябва да са приготвени непосредствено преди употреба.

5. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване и:

5.1. Водна баня с възможност за поддържане на температура 60⁰С  1⁰С

5.2. Хроматограф за високоефективна течна хроматография с УВ детектор, дължина на вълната 280 nm.

5.3. Аналитична колона от неръждаема стомана 25 cm х 4,6 mm (или 12,5 cm х 4,6 mm) съдържаща Nucleosil 5С18 или еквивалент (виж 10.1).

5.4. Стъклени колби от 100 cm³(ml) със запушалки.

5.5. Пемза с размери на зърната от 2 mm до 4 mm.
6. Процедура

6.1. Подготовка на пробата

6.1.1. Подготовка на пробата без добавяне на вътрешен стандарт.

Претегля се около 1,0 g от пробата с точност 0,001 g в стъклена колба от 100 cm³ (ml) със запушалка (5.4). Добавят се 1,0 cm³ (ml) разтвор на сярна киселина (4.14), 50,0 cm³ (ml) етанол/водна смес (4.15) и около 1,0 g пемза (5.5). Колбата се запушва и се разклаща силно, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване екстракцията на консервантите в етаноловата фаза, колбата се нагрява 5 min. на водна баня (5.1) при температура 60⁰С  1⁰С. След това се охлажда бързо на течаща студена вода и престоява в хладилник 1 h. Филтрува се през книжен филтър и около 2 cm³ (ml) от филтрата се прехвърлят в епруветка от 5 сm³ (ml) със запушалка. Екстрактът се съхранява в хладилник. ВЕТХ определянето трябва да се извърши до 24 h.

6.1.2. Подготовка на пробата с добавяне на вътрешен стандарт

Претегля се около 1,0 g  0,1 от пробата с точност 0,001 g и се прехвърля в колба от 100 cm³ (ml). Добавят се 1,0 cm³ (ml) разтвор на сярна киселина (4.14) и 40 cm³ (ml) смес етанол/вода (4.15), около 1,0 g пемза (5.5) и точно 10,0 cm³ (ml) разтвор на вътрешен стандарт (4.16). Колбата се запушва и се разклаща силно най-малко 1 min, докато се получи хомогенна емулсия. За улесняване екстракцията на консервантите в етаноловата фаза, колбата се загрява 5 min на водна баня при температура 60⁰С  1⁰С, след което се охлажда бързо на течаща студена вода и престоява в хладилник 1 h. Филтрува се през книжен филтър. Около 2 cm³ (ml) от филтрата се прехвърлят в епруветка от 5 cm³ (ml) със запушалка. Съхранява се в хладилник до провеждане на ВЕТХ определянето.

6.2. Високо-ефективна течна хроматография (ВЕТХ)

6.2.1. Хроматографски условия:

Подвижна фаза - тетрахидрофуран/вода/метанол/ацетонитрил (4.17)

Скорост на потока - 1,5 cm³/min (ml/min)

Дължина на вълната - 280 nm

6.2.2. Стандартна крива

Инжектират се по 10 µl от стандартните разтвори на консервантите (4.19). От получените хроматограми се определят съотношенията на височината на пиковете на стандартните разтвори на консервантите към височината на пика на вътрешния стандарт. Построява се крива за всеки консервант, свързваща тези съотношения с концентрацията на стандартните разтвори.

6.2.3. Определяне

Инжектират се последователно по 10 µl от разтвора на пробата без вътрешен стандарт (6.1.1.) и на един от стандартните разтвори на консерванта (4.19) и получените хроматограми се сравняват. Ако в хроматограмата на пробата (6.1.1.) не се появи пик с приблизително същото време на задържане като това на изопропилпарабена (препоръчан като вътрешен стандарт) се инжектират 10 µl разтвор на пробата с вътрешен стандарт (6.1.2). Хроматограмата се изписва и се измерват височините на пиковете. Ако в хроматограмата на пробата се появи пречещ пик, с приблизително същото време на задържане като това на изопропилпарабена, трябва да се избере друг вътрешен стандарт.

Когато пикът на някои от изследваните консерванти не присъства в хроматограмата на пробата, този консервант може да се използва като алтернативен вътрешен стандарт.

Изчисляват се съотношенията на височината на пика на изследваните консерванти към тези на вътрешния стандарт и се проверява дали за стандартните разтвори, използвани в процедурата за калибриране се получава линейна зависимост.

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

- Разделянето на пиковете (р) на най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90 (за дефиниция на пиково разделяне виж фиг. 1).

Ако не е постигнато необходимото разделяне трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза.

- Коефициентът на асиметрия (As) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5 (за дефиницията на коефициент на асиметрия виж фиг.2).

Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.

- Базовата линия трябва да е стабилна.

7. Изчисление

Изчисляването на концентрациите на консервантите в разтвора на пробата се извършва по стандартната крива (6.2.2) и съотношенията на височините на пиковете на изследваните консерванти към тази на вътрешния стандарт. Съдържанието на 2-феноксиетанол, 1-феноксипропан-2-ол, метил 4-хидроксибензоат, етил 4-хидроксибензоат, пропил 4-хидроксибензоат, бутил 4-хидроксибензоат и бензил 4-хидроксибензоат (W_i) се изчисляват като % (М/М) по формулата:

където:

Виж 10.5

Виж 10.5.

10.1. Стационарна фаза

При ВЕТХ определянето на задържането на веществата от пробата зависи в голяма степен от вида, марката и предварителната подготовка на неподвижната фаза. Изборът на колоната, която ще се използва за разделяне на изследваните консерванти се решава от получените резултати за стандартните разтвори (виж 6.2.3). Други подходящи неподвижни фази за пълнеж на колоната са Hypersil ODS и Zorbax ODS. Препоръчаният състав на подвижната фаза също може да се оптимизира, за да се получи необходимото разделяне.

10.2. Дължина на вълната, при която се извършва определянето.

Проверката за годността на описаната методика показва, че известна промяна в дължината на вълната на определяне може да окаже значителен ефект върху резултата, поради което този параметър трябва да бъде внимателно контролиран при провеждане на анализа.

10.3. Пречещи влияния

При посочените условия от пробата се елуират и много други съединения, като консерванти и козметични добавки. Времената на задържане на голям брой консерванти, описани в Приложение № 4 са цитирани в N.de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A.Pranato-Soetardhi и A. Schouten. Определяне на консерванти в козметични продукти. ІІ Високоефективна течнохроматографска процедура за идентифициране на консерванти в козметични продукти (J.Chromatography 1989, 469, 317-318).

10.4. За да се избере подходяща аналитична колона може да се използва подходяща колона гард.

10.5. Методът е изпитан от девет лаборатории - участници, всяка от които е анализирала по три проби. Средните стойности от всички лаборатории в % М/М (m) повторяемост (r) и възпроизводимост (R) за трите проби са посочени в таблицата:

Проба	2-фенокси-етанол		1-фенокси-пропан-2-ол	Метил-парабен	Етил-парабен	Пропил-парабен	Бутил-парабен	Бензил-парабен
Вита- минов крем	m	1,124		0,250	0,0628	0,031	0,0906
	r	0,016		0,018	0,0035	0,0028	0,0044
	R	0,176		0,030	0,0068	0,0111	0,0034
Бързо-почистващ крем	m	1,196		0,266	0,076
	r	0,040		0,003	0,002
	R	0,147		0,022	0,004
Маса- жен крем	m		0,806			0,180	0,148	0,152
	r		0,067			0,034	0,013	0,015
	R		0,112			0,078	0,012	0,016

(¹) виж ISO 5725