Р е п у б л и к а б ъ л г а р и я министерство на здравеопазването наредба № …/ за определяне на подробни правила за представяне на информацията по чл. 19, пар. 4 на Регламент

При съдържание на амоняк около 6%, разликата между резултатите на две паралелно извършени определения на една и съща проба, не трябва да надвишават абсолютната стойност от 0,6 %.

(¹) виж ISO 5725


ХVІІ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НИТРОМЕТАН

1. Област на приложение

Този метод се отнася за идентификация и определяне на нитрометан до около 0,3% в козметични продукти в аерозолни опаковки.

Съдържанието на нитрометан, определено по този метод, се изразява в % (M/M) нитрометан в цялото съдържание на аерозолната опаковка.

Нитрометанът се идентифицира чрез цветна реакция. Нитрометанът се определя газхроматографски след добавяне на вътрешен стандарт.

4.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1.1. Натриев хидроксид, 0,5 М разтвор.

4.1.2. Реактив на Folin

Разтварят се 0,1 g натриев 3,4-дихидро-3,4-диоксонафтален-1-сулфонат във вода и се разрежда до 100 сm³ (ml).

4.2. Процедура

Към 1 сm³ (ml) от пробата се прибавят 10 сm³ (ml) от 4.1.1 и 1 сm³ (ml) от 4.1.2. Виолетово оцветяване показва наличието на нитрометан.

5.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за газова хроматография”.

5.1.1. Хлороформ (вътрешен стандарт 1).

5.1.2. 2,4-диметилхептан (вътрешен стандарт 2).

5.1.3. Етанол, 95%.

5.1.4. Нитрометан.

5.1.5. Разтвор на хлороформ (вътрешен стандарт).

В тарирана мерителна колба от 25 сm³ (ml) се претеглят около 0,65 g хлороформ с точност 0,001 g (5.1.1). Долива се до 25 сm³ (ml) с 95% етанол (5.1.3). Претегля се и се изчислява съдържанието на хлороформ в този разтвор в % (M/M).

5.1.6. Разтвор на 2,4-диметилхептан (вътрешен стандарт).

Приготвя се по същия начин, както разтвора на хлороформ, като се претеглят 0,27 mg 2,4-диметилхептан с точност 0,001 g (5.1.2) в мерителна колба от 25 сm³ (ml).

5.2. Апаратура

5.2.1. Газхроматограф с пламъчно-йонизационен детектор.

5.2.2. Апаратура за вземане на проби от аерозолни опаковки (бутилка за прехвърляне, микроспринцовки и др.), съгласно т. ІІ. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване.

5.2.3. Стандартно лабораторно оборудване.

5.3. Процедура

5.3.1. Приготвяне на пробата

В тарирана 100 сm³ (ml) бутилка за прехвърляне, почистена и вакумирана съгласно начина, описан в т. ІІ. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване (5.3), се поставят около 5 сm³ (ml) от разтворите на вътрешен стандарт (5.1.5 или 5.1.6). Използва се стъклена спринцовка от 10 или 20 сm³ (ml) без игла, приспособена към бутилката за прехвърляне, следвайки процедурата, описана в т. ІІ. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване (5). Претегля се отново, за да се определи поставеното количество. Използвайки същата процедура, в бутилката се прехвърлят около 50 g от съдържанието на пробата в аерозолната опаковка. Отново се претегля, за да се определи количеството на прехвърлената проба. Разбърква се добре.

Инжектират се около 10 µl с посочената микроспринцовка (5.2.2). Правят се 5 инжектирания.

5.3.2. Приготвяне на стандарта

В мерителна колба от 50 сm³ (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 0,5 g нитрометан (5.1.4), 0,5 g хлороформ (5.1.1) или 0,21 g 2,4-диметилхептан (5.1.2). Долива се до марката с 95% етанол (5.1.3). Разбърква се добре. В мерителна колба от 20 сm³ (ml) се поставят 5 сm³ (ml) от този разтвор. Долива се до марката с 95% етанол (5.1.3).

Инжектират се около 10 µl с посочената микроспринцовка (5.2.2). Правят се 5 инжектирания.

5.3.3. Газхроматографски условия

5.3.3.1. Колона

Състои се от две части: първата - с пълнеж от дидецилфталат върху Gas Chrom Q, а втората – Ucon 50 HB 280X върху Gas Chrom Q. Приготвената комбинирана колона трябва да дава разделяне R, равно или по-добро от 1,5, като:

където:

Като пример, следните две части дават желаното разделяне:

Материал - неръждаема стомана.

Дължина - 1,5 m.

Диаметър - 3 mm.

Пълнеж - 20% дидецилфталат върху Gas Chrom Q (100 – 120 mesh).

Колона Б:

Материал: неръждаема стомана.

Дължина - 1,5 m.

Диаметър - 3 mm.

Пълнеж - 20% Ucon 50 HB 280X върху Gas Chrom Q (100 – 120 mesh).

5.3.3.2. Детектор

Подходяща чувствителност за електрометъра на пламъчно-йонизационния детектор е 8  10-10А.

5.3.3.3. Температурни условия

Подходящи са следните условия:

Инжектор: 150⁰С.

Детектор: 150⁰С.

Колона: между 50 и 80⁰С в зависимост от използваните колони и апарата.

5.3.4. Подаване на газове

Газ-носител: азот.

Налягане: 2,1 bar.

Дебит на потока: 40 сm³ (ml)/min.

Захранване на детектора: както е посочено от производителя на детектора.

6. Изчисления

6.1. Корекционен коефициент на нитрометан, изчислен спрямо използвания вътрешен стандарт

Ако с “n” се означи нитрометана:

нека:

Ако с “с” се означи вътрешния стандарт, хлороформ или 2,4 диметилхептан:

нека:

М/c е неговата маса в сместа в g;

S/c е площта на неговия пик

тогава:

(kn е функция от апарата).

6.2. Концентрация на нитрометан в пробата

Ако с “n” се означи нитрометана:

нека:

kn е неговият корекционен коефициент;

Sn е площта на неговия пик.

Ако с “с” се означи вътрешния стандарт, хлороформ или 2,4-диметилхептан:

нека:

Мc е неговата маса в сместа в g;

Sc е площта на неговия пик;

М е масата на прехвърления аерозол в g,

тогава % (M/M) на нитрометана в пробата е:

За съдържание на нитрометан от около 0,3% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,03% (M/M).

(¹) виж ISO 5725

Методът се отнася за идентификация и определяне на меркаптооцетна киселина в продукти за къдрене и изправяне на косата и депилатоари, в които могат да присъстват и други редуциращи агенти.

Съдържанието на меркаптооцетна киселина в пробата, определено съгласно този метод, се изразява в % (М/М) меркаптооцетна киселина.

Меркаптооцетната киселина се идентифицира чрез капков анализ и тънкослойна хроматография и се определя чрез йодометрия или газхроматография.

4.1. Идентификация чрез капков анализ

4.1.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1.1.1. Индикаторна хартия с оловен диацетат.

4.1.1.2. Разтвор на солна киселина 1:1 (V/V).

4.1.2. Процедура

4.1.2.1. Идентификация на меркаптооцетна киселина чрез цветна реакция с индикаторна хартия с оловен диацетат.

Една капка от пробата за анализ се поставя върху индикаторна хартия с оловен диацетат (4.1.1.1). Ако се появи интензивно жълто оцветяване, вероятно присъства меркаптооцетна киселина.

Чувствителност: 0,5%.

4.1.2.2. Характеризиране на неорганични сулфиди чрез образуване на сероводород при подкисляване.

В епруветка се поставят няколко mg от пробата за анализ. Прибавят се 2 сm³ (ml) дестилирана вода и 1 сm³ (ml) солна киселина (4.1.1.2). Отделеният сяроводород, който се познава по миризмата, образува черна утайка от оловен сулфид върху индикаторна хартия с оловен диацетат (4.1.1.1).

Чувствителност: 50 ppm.

4.1.2.3. Характеризиране на сулфити чрез образуване на серен диоксид при подкисляване.

Постъпва се, както е описано в 4.1.2.2. Довежда се до кипене. Серният диоксид се разпознава по неговия мирис и чрез редукционните му свойства, например по отношение към перманганатни йони.

4.2. Идентификация с тънкослойна хроматография

4.2.1. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.2.1.1. Меркаптооцетна киселина (тиогликолова киселина), 98% минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.2. 2,2´-дитиоди (оцетна) киселина, 99% минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.3. 2-меркаптопропионова киселина (тиомлечна киселина), 95% минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.4. 3-меркаптопропионова киселина, 98% минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.5. 3-меркаптопропан-1,2-диол (1-тиоглицерол), 98% минимална чистота, определена йодометрично.

4.2.1.6. Готови плаки за тънкослойна хроматография със силикагел, дебелина на слоя 0,25 mm.

4.2.1.7. Готови плаки за тънкослойна хроматография с алуминиев оксид, Merck F254 или еквивалентни.

4.2.1.8. Солна киселина, концентрирана, d₄²⁰ = 1,19 g/сm³ (ml).

4.2.1.9. Етилацетат.

4.2.1.10. Хлороформ.

4.2.1.11. Диизопропилов етер.

4.2.1.12. Тетрахлорметан.

4.2.1.13. Ледена оцетна киселина.

4.2.1.14. Калиев йодид, 1% (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.15. Платинов тетрахлорид, 0,1% (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.16. Подвижни фази

4.2.1.16.1. Етилацетат (4.2.1.9) : хлороформ (4.2.1.10) : диизопропилов етер (4.2.1.11) : оцетна киселина (4.2.1.13) = 20 : 20 : 10 : 10 (V/V/V/V).

4.2.1.16.2. Хлороформ (4.2.1.10) : оцетна киселина (4.2.1.13) = 90 : 20 (V/V).

4.2.1.17. Реактиви за проявяване на петната

4.2.1.17.1. Непосредствено преди употреба се смесват равни обеми от разтвор (4.2.1.14) и разтвор (4.2.1.15).

4.2.1.17.2. Разтвор на бром, 5% (M/V): 5 g бром се разтварят в 100 сm³ (ml) тетрахлорметан (4.2.1.12).

4.2.1.17.3. Разтвор на флуоресцеин, 0,1% (M/V): 100 mg флуоресцеин се разтварят в 100 сm³ (ml) етанол.

4.2.1.17.4. Хексаамониев хептамолибдат, 10% (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18. Стандартни разтвори

4.2.1.18.1. Меркаптооцетна киселина (4.2.1.1), 0,4% (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.2. 2,2/-дитиоди (оцетна киселина) (4.2.1.2), 0,4% (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.3. 2-меркаптопропионова киселина (4.2.1.3), 0,4% (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.4. 3-меркаптопропионова киселина (4.2.1.4), 0,4% (M/V) разтвор във вода.

4.2.1.18.5. 3-меркаптопропан-1,2-диол (4.2.1.5), 0,4% (M/V) разтвор във вода.

4.2.2. Апаратура

Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

4.2.3. Процедура

4.2.3.1. Подготовка на пробите

Пробата се подкислява с няколко капки солна киселина (4.2.1.8) до рH 1 и, ако е необходимо, се филтрува.

В някои случаи може да се препоръча разреждане на пробата. Ако се процедира по този начин, подкисляването със солна киселина се извършва преди разреждането.

4.2.3.2. Хроматографиране

Върху плаката се нанася 1 µl от разтвора на пробата (4.2.3.1) и по 1 µl от всеки от сравнителните разтвори (4.2.1.18). Внимателно се изсушава на слаб ток от азот и хроматограмата се развива в подвижната фаза (4.2.1.16.1 или 4.2.1.16.2). Плаката се изсушава възможно най-бързо, за да се избегне окислението на тиолите.

4.2.3.3. Проявяване на петната

Плаката се напръсква с един от трите реактива (4.2.1.17.1, 4.2.1.17.3 или 4.2.1.17.4). Ако плаката се напръска с реактив 4.2.1.17.3, след това се обработва с бромни пари (например във вана, съдържаща малка чаша с реактив 4.2.1.17.2), докато петната станат видими. Оцветяването с реактива за напръскване (4.2.1.17.4) ще бъде задоволително, само ако времето за изсушаване на слоя не надхвърля 30 min.

4.2.3.4. Интерпретация

Сравняват се Rf-стойностите и цвета на петната на стандартните разтвори и тези на пробата. Средните Rf-стойности, дадени по-долу, са за груба ориентация и имат само сравнителна стойност. Те зависят от:

– степента на активност на тънкия слой по време на хроматографирането,

– температурата на хроматографската вана.
Примерни Rf-стойности, получени на слой силикагел

Определянето винаги трябва да започва с йодометричния метод.

5.1. Йодометрично определяне

5.1.1. Принцип

Определянето се осъществява чрез окисление на “-SH” групата с йод в кисела среда съгласно уравнението:

2HOOC–CH2SH + J2  (HOOC–CH2–S)2 + 2J– + 2H+

5.1.2. Реактиви

Йод, 0,05 М стандартен разтвор.

5.1.3. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

5.1.4. Процедура

Претегля се 0,5 до 1 g от пробата с точност 0,001 g в конична колба от 150 сm³ (ml) със запушалка, съдържаща 50 сm³ (ml) дестилирана вода. Прибавят се 5 сm³ (ml) солна киселина (4.1.1.2) (рН на разтвора–около 0) и се титрува с разтвор на йод (5.1.2) до поява на жълто оцветяване. Ако е необходимо се използва индикатор (например разтвор на скорбяла или тетрахлорметан).

5.1.5. Изчисления

Съдържанието на меркаптооцетната киселина се изчислява по формулата:

където:

5.1.6. Забележки:

Ако резултатът, изчислен като меркаптооцетна киселина, е 0,1% или повече под разрешената максимална концентрация, тогава не е необходимо да се провеждат по-нататъшни определяния.

Ако резултатът е равен или е над разрешения максимум на концентрацията и идентификацията е показала присъствие на няколко редуциращи агенти, тогава е необходимо да се проведе газ хроматографско определяне.

5.2. Газова хроматография

5.2.1. Принцип

Меркаптооцетната киселина се отделя от другите съставки на продукта чрез утаяване с разтвор на кадмиев диацетат. След метилиране с диазометан, приготвен in situ или предварително в разтвор на диетилов етер, метиловото производно на меркаптооцетната киселина се определя чрез газотечна хроматография при използване на метилоктаноат като вътрешен стандарт.

5.2.2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за газова хроматография”, а водата бидестилирана.

5.2.2.1. Меркаптооцетна киселина, 98%.

5.2.2.2. Солна киселина, d⁴₂₀ = 1,19 g/сm³ (ml).

5.2.2.3. Метанол.

5.2.2.4. Кадмиев диацетат дихидрат, 10% (M/V).

5.2.2.5. Метилоктаноат, 2% (M/V) разтвор в метанол.

5.2.2.6. Ацетатен буферен разтвор (рН 5):

Натриев ацетат трихидрат, 77 g.

Ледена оцетна киселина, 27,5 g.

Деминерализирана вода за получаване на краен обем от 1 l.

5.2.2.7. Солна киселина, 3 М разтвор в метанол (5.2.2.3), приготвен непосредствено преди употреба.

5.2.2.8. 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин.

5.2.2.9. Натриев хидроксид, 5 М разтвор.

5.2.2.10. Йод, 0,05 М стандартен разтвор.

5.2.2.11. Диетилов етер.

5.2.2.12. Разтвор на диазометан, приготвен от н-метил-н-нитрозотолуен-4-сулфонамид (Fieser, Reagents for Organic Synthesis (Wiley), 1967)

Полученият разтвор съдържа около 1,5 g диазометан в 100 сm³ (ml) диетилов етер. Тъй като диазометанът е токсичен и твърде нестабилен газ, всички експерименти трябва да се провеждат в мощна камина и да се избягва използването на стъклария на шлиф (има специални комплекти за тази цел).

5.2.3. Апаратура

5.2.3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2.3.2. Апарат за получаване на диазометан за метилиране in situ (виж Fales,H.M., Jaouni,T.M. and Babashak,J.F., Analyt.Chem. 1973, 45, 2302).

5.2.3.3. Апаратура за предварително получаване на диазометан (Fieser).

5.2.4. Приготвяне на пробата

В центрофужна епруветка от 50 сm³ (ml) се претегля достатъчно количество от пробата с точност 0,001 g, което да съдържа предполагаемо количество от 0,05 до 0,07 g меркаптооцетна киселина.

Подкислява се с няколко капки солна киселина (5.2.2.2) за да се получи рН около 3.

Прибавят се 5 сm³ (ml) деминерализирана вода и 10 сm³ (ml) ацетатен буферен разтвор (5.2.2.6).

Проверява се дали рН е около 5 с хартиен pH-индикатор. След това се прибавят 5 сm³ (ml) разтвор на кадмиев диацетат (5.2.2.4).

Изчакват се 10 min и след това се центрофугира поне 15 min при 4000 rpm. Отстранява се бистрата течност, която може да съдържа неразтворими мазнини (в случай на кремообразни продукти). Тези мазнини не трябва да се бъркат с тиолите, които се събират като компактна маса на дъното на епруветката. Проверява се да няма утаяване при прибавяне на няколко капки разтвор на кадмиев диацетат (5.2.2.4) към бистрата течност.

Ако при предварителната идентификация не е открито присъствие на редуциращи агенти, различни от тиолите, йодометрично се проверява дали присъстващите в бистрата течност тиоли не надхвърлят 6 до 8% от първоначалното количество.

В центрофужната епруветка, съдържаща утайката, се поставят 10 сm³ (ml) метанол (5.2.2.3) и утайката се диспергира фино чрез разбъркване със стъклена пръчка. Отново се центрофугира поне 15 min при 4000 rpm. Бистрата течност се отлива и се проверява за отсъствие на тиоли.

Утайката се промива втори път по същия начин.

В същата епруветка се добавят:

– 2 сm³ (ml) разтвор на метилоктаноат (5.2.2.5),

– 5 сm³ (ml) солна киселина в метанол (5.2.2.7).

Тиолите се разтварят напълно (малко неразтворимо вещество от пълнителя може да остане). Това е разтвор “С”.

С аликвотна част от този разтвор се проверява йодометрично дали съдържанието на тиоли е поне 90% от това, получено по т. 5.1.

5.2.5. Метилиране

Метилирането се провежда или чрез процедура in situ (5.2.5.1), или с предварително приготвен разтвор на диазометан (5.2.5.2).

5.2.5.1. Метилиране in situ.

В апарата за метилиране (5.2.3.2), съдържащ 1 сm³ (ml) етер (5.2.2.11) се въвеждат 50 µl разтвор “С” и се метилира по методика (5.2.3.2) с около 300 mg 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин (5.2.2.8). След 15 min (етерният разтвор трябва да е жълт, което показва излишък от диазометан) разтворът на пробата се прехвърля в шишенце от 2 сm³ (ml) с херметична запушалка. Оставя се в хладилник за една нощ. Едновременно се метилират две проби.

5.2.5.2. Метилиране с предварително приготвен разтвор на диазометан.

В колба със запушалка от 5 сm³ (ml) се поставя 1 сm³ (ml) разтвор на диазометан (5.2.2.12) и след това 50 µl разтвор “С”. Оставя се за една нощ в хладилник.

5.2.6. Приготвяне на стандарта.

Приготвя се стандартен разтвор от меркаптооцетна киселина (5.2.2.1) с позната концентрация, съдържащ около 0,06 g чиста меркаптооцетна киселина (5.2.2.1) в 2 сm³ (ml).

Това е разтвор “Е”.

Утаява се, проверява се и се метилира, както е описано в 5.2.4 и 5.2.5.

5.2.7. Газхроматографски условия

5.2.7.1. Колона

Тип - неръждаема стомана.

Дължина - 2 m.

Диаметър - 3 mm.

5.2.7.2. Пълнеж 20% дидецилфталат / Chromosorb WAW, 80 до 100 mesh.

5.2.7.3. Детектор

Пламъчно-йонизационен. Подходяща чувствителност за електрометъра на пламъчно-йонизационния детектор е 8 х 10-10 А.

5.2.7.4. Газове

Газ-носител - азот.

Налягане - 2,2 bar.

Дебит на потока - 35 сm³ (ml)/min.

Допълнителен газ - водород.

Налягане - 1,8 bar.

Дебит на потока - 15 сm³ (ml)/min.

Захранване на детектора - както е посочено от производителите на апарата.

5.2.7.5. Температурни условия

Инжектор - 200⁰С

Детектор - 200⁰С

Колона - 90⁰С.

5.2.7.6. Скорост на хартията на самописеца: 5 mm/min.

5.2.7.7. Количество за инжектиране: 3 µl. Правят се пет инжектирания.

5.2.7.8. Хроматографските условия са дадени като указание. Те осигуряват разделяне R, равно или по-добро от 1,5, като:

където:

Препоръчва се хроматографирането да завърши с повишаване на температурата от 90 до 150⁰С при скорост 100С/min, за да се елиминира възможността за влияние на лабилните вещества при следващите хроматографирания.

5.2.8. Изчисления

5.2.8.1. Коефициент на пропорционалност на меркаптооцетната киселина. Той е изчислен по отношение на метилоктаноат на базата на стандартна смес.

Ако с “t” се означи меркаптооцетната киселина:

нека:

Ако с “с” се означи метилоктаноата:

нека:

М´c е неговата маса в сместа в mg;

S´c е площта на неговия пик,

тогава:

Този коефициент варира според използваната апаратура.

5.2.8.2. Концентрация на меркаптооцетната киселина в пробата.

Ако с “t” се означи меркаптооцетната киселина:

нека:

kt е нейният корекционен коефициент;

St е площта на нейния пик.

Ако с “с” се означи метилоктаноата:

нека:

Мc е неговата маса в сместа в mg;

Sc е площта на неговия пик;

М е масата на първоначалната проба за изпитване в mg,

тогава % (M/M) на меркаптооцетната киселина в пробата е:

За съдържание на меркаптооцетна киселина от 8% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,8% (M/M).

(¹) виж ISO 5725

ХІХ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХЕКСАХЛОРОФЕН

1. 
   Идентификация
   

Методът е подходящ за всички козметични продукти.

Хексахлорофенът се екстрахира с етилацетат и се идентифицира чрез тънкослойна хроматография.

Всички реактиви трябва да са с квалификация ”чист за анализ“ (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Сярна киселина, 4 М.

3.2. Целит AW.

3.3. Етилацетат.

3.4. Подвижна фаза: бензен, съдържащ 1% (V/V) ледена оцетна киселина.

3.5. Реактив за проявяване на петната I:

Разтвор на родамин В: разтварят се 0,1 g родамин B в смес от 150 сm³ (ml) диетилов етер, 70 сm³ (ml) абсолютен етанол и 16 сm³ (ml) вода.

3.6. Реактив за проявяване на петната II:

Разтвор на 2,6-дибром-4-(хлоримино) циклохекса-2,5-диенон: разтварят се 0,4 g 2,6-дибром-4-(хлоримино)циклохекса-2,5-диенон в 100 сm³ (ml) метанол, приготвен непосредствено преди употреба.

Разтвор на натриев карбонат: разтварят се 10 g натриев карбонат в 100 сm³ (ml) деминерализирана вода.

3.7. Стандартен разтвор:

Хексахлорофен, 0,05% (M/V) разтвор в етилацетат.

4. Апаратура

4.1. Плаки за тънкослойна хроматография Kieselgel F₂₅₄, 20x20 сm или еквивалентни.

4.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4.3. Термостатирана при 26⁰С водна баня, в която се слага хроматографската вана.

5.1. Смесват се добре 1 g от хомогенизираната проба с 1 g целит AW (3.2) и 1 сm³ (ml) сярна киселина (3.1).

5.2. Суши се 2 h при 100⁰С.

5.3. Охлажда се и сухият остатък се стрива на фин прах.

5.4. Екстрахира се двукратно с по 10 сm³ (ml) етилацетат (3.3), центрофугира се след всяка екстракция и етилацетатните слоеве се обединяват.

5.5. Изпарява се при 60⁰С.

5.6. Остатъкът се разтваря в 2 сm³ (ml) етилацетат (3.3).

6. Процедура

6.1. Върху плаката за тънкослойна хроматография се нанасят 2 µl от разтвора на пробата за изпитване и 2 µl от сравнителния разтвор.

6.2. Хроматографската вана се насища с подвижната фаза (3.4).

6.3. Плаката за тънкослойна хроматография се поставя във ваната и хроматограмата се развива, докато фронтът на разтворителя се придвижи на 15 сm.

6.4. Плаката се изважда и се суши в сушилня с вентилатор при около 105⁰С.

6.5. Проявяване на петната

Петната от хексахлорофена се оцветяват както е посочено в 6.5.1 или в 6.5.2.

6.5.1. Плаката се напръсква равномерно с проявяващ реактив I (3.5). След 30 min плаката се разглежда на УВ-лампа при λ=254 nm.

6.5.2. Плаката се напръсква равномерно с разтвор на 2,6-дибром-4-(хлоримино) циклохекса-2,5-диенон – проявяващ реактив II (3.6). След това плаката се напръсква с разтвор на натриев карбонат (3.6). Плаката се суши 10 min при стайна температура, след което се разглежда на дневна светлина.

7. Интерпретация

7.1. Проявяващ реактив I (3.5):

Хексахлорофенът се наблюдава като синкаво петно на жълто-оранжев флуоресциращ фон и има R_f - стойност около 0,5.

7.2. Проявяващ реактив II (3.6):

Хексахлорофенът се наблюдава като небесно-синьо до тюркоазено петно на бял фон и има R_f-стойност около 0,5.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Този метод е приложим за всички козметични продукти.

Съдържанието на хексахлорофен в пробата, определено по този метод се изразява като % (M/M) хексахлорофен.

След превръщане в метилово производно, хексахлорофенът се определя чрез газова хроматография с електрон-улавящ детектор.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за газова хроматография”.

4.1. Етилацетат.

4.2. н-метил-н-нитрозо-п-толуенсулфонамид (diazald).

4.3. Диетилов етер.

4.4. Метанол.

4.5. 2-(2-етоксиетокси) етанол (карбитол).

4.6. Мравчена киселина.

4.7. Калиев хидроксид, 50% (M/M) воден разтвор. Приготвя се непосредствено преди употреба.

4.8. Хексан, за спектроскопия.

4.9. Бромхлорофен (стандарт № 1).

4.10. 4,4´,6,6´-тетрахлор-2,2´-тиодифенол (стандарт № 2).

4.11. 2,4,4´-трихлор-2-хидрокси-дифенилов етер (стандарт № 3).

4.12. Ацетон.

4.13. Сярна киселина, 4 М.

4.14. Целит AW.

4.15. Мравчена киселина / етилацетат, 10% (V/V) разтвор.

4.16. Хексахлорофен.

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Миниапарат за получаване на диазометан (Analyt. Chem., 1973, 45, 2302-2).

5.3. Газов хроматограф с електрон-улавящ детектор, с Ni⁶³-източник.

6.1. Приготвяне на стандартен разтвор

Стандартът се подбира така, че да не взаимодейства с никое вещество, съдържащо се в пълнителя на анализирания продукт. Обикновено най-подходящ е стандарт № 1 (4.9).

6.1.1. В мерителна колба от 100 cm³ (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 50 mg от стандарт № 1, 2 или 3 (4.9, 4.10 или 4.11) и 0,05 g хексахлорофен (4.16) от 100 сm³ (ml). Долива се до марката с етилацетат (4.1) (разтвор А). 10 сm³ (ml) от разтвор А се разрежда до 100 сm³ (ml) с етилацетат (4.1) (разтвор Б).

6.1.2. В мерителна колба от 100 сm³ (ml) се претеглят с точност 0,001 g около 0,05 g от стандарт № 1, 2 или 3 (4.9, 4.10 или 4.11) Долива се до марката с етилацетат (4.1) (разтвор В).

6.2. Приготвяне на пробата (¹)

Претегля се 1 g от хомогенизираната проба с точност 0,001 g и се смесва напълно с 1 сm³ (ml) сярна киселина (4.13), 15 сm³ (ml) ацетон (4.12) и 8 g целит AW (4.14). Сместа се суши до въздушно сухо състояние на парна баня за 30 min, след което се суши за 1 h и 30min. в сушилня с вентилатор. Охлажда се, остатъкът се стрива на фин прах и се прехвърля в стъклена колона. Елуира се с етилацетат (4.1) и се събират 100 сm³ (ml). Прибавят се 2 сm³ (ml) от разтвора на вътрешния стандарт (разтвор Б) (6.1.2).

6.3. Метилиране на пробата

Апаратчето и всички реактиви за получаване на диазометан се охлаждат до 0⁰–4⁰С в продължение на 2 h. Във външното отделение на апаратчето се поставят 1,2 сm³ (ml) от разтвора, получен в 6.2 и 0,1 сm³ (ml) метанол (4.4). В централния резервоар се поставят около 0,2 g диазалд (4.2) и се разтваря чрез добавяне на 1 сm³ (ml) карбитол (4.5) и 1 сm³ (ml) диетилов етер (4.3).

Апаратчето се сглобява, потапя се наполовина в ледена баня при 0⁰С и в централния резервоар се впръсква със спринцовка 1 сm³ (ml) охладен разтвор на калиев хидроксид (4.7). Трябва да се провери дали полученото жълто оцветяване от образуващия се диазометан е трайно. Ако жълтото оцветяване не е трайно, метилирането се повтаря с нови 0,2 g диазалд (4.2) (²).

Апаратчето се изважда от банята след 15 min, след което се оставя затворено 12 h при стайна температура. Апаратчето се отваря, излишъкът от диазометан реагира с прибавените няколко капки разтвор на мравчена киселина в етилацетат (4.15) и органичният разтвор се прехвърля в мерителна колба от 25 сm³ (ml). Долива се до марката с хексан (4.8).

1,5 µl от този разтвор се инжектира в хроматографа.

6.4. Метилиране на стандарта.

Апаратчето и всички реактиви за получаване на диазометан се охлаждат до 0⁰-4⁰С в продължение на 2 h. Във външното отделение на апаратчето се поставят:

0,2 сm³ (ml) разтвор В (6.1.1),

1 сm³ (ml) етилацетат (4.1),

0,1 сm³ (ml) метанол (4.4).

Метилирането продължава, както е описано в 6.3.

1 µl от получения разтвор се инжектира в хроматографа.

7. Газова хроматография

Колоната трябва да дава разделяне R, равно или по-добро от 1,5,

като:

където:

Като подходящи са установени следните условия на хроматографиране:

Колона - неръждаема стомана.

Дължина - 1,7 m.

Диаметър - 3 mm.

Носител - Chromosorb WAW - 80 до 100 mesh.

Стационарна фаза - 10% OV 17.

Температури:

Колона - 280⁰С,

Инжектор - 280⁰С,

Детектор - 280⁰С.

Газ-носител - азот, свободен от кислород.

Налягане - 2,3 bar.

Дебит на потока - 30 сm³ (ml)/min.

8.1. Корекционен коефициент на хексахлорофена

Изчислява се спрямо избрания стандарт във връзка със стандартната смес.

Нека:

тогава:

Нека:

тогава % (M/M) на хексахлорофена в пробата е:

За съдържание на хексахлорофен 0,1% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,005% (M/M).

(¹) Поради широката гама на типовете продукти, които могат да задържат хексахлорофен, важно е да се провери чрез тази процедура извличането на хексахлорофена от пробата, преди да се отчитат резултати. Ако извличането е лошо, трябва да се направят модификации като смяна на разтворителя (бензен вместо етилацетат) и други със съгласието на заинтересованите страни.

(²) Трайността на жълтото оцветяване е указание за излишък на диазометан, който е необходим, за да се осигури пълно метилиране на пробата.

(³) Виж ISO 5725

Методът се отнася за количествено определяне чрез тънкослойна хроматография на натриев тозилхлорамид (хлорамин-Т) в козметични продукти.

Съдържанието на хлорамин-Т в пробата, определено по този метод, се изразява като % (M/M)

Хлорамин-Т се хидролизира напълно до 4-толуенсулфонамид чрез кипене със солна киселина.

Количеството на образувания 4-толуенсулфонамид се определя фотоденситометрично чрез тънкослойна хроматография.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Натриев тозилхлорамид (хлорамин-Т).

4.2. Стандартен разтвор на 4-толуенсулфонамид: 0,05g 4-толуенсулфонамид в 100 сm³ (ml) етанол (4.5).

4.3. Солна киселина, 37,7% (M/M), d₄²⁰ = 1,18 g/сm³ (ml).

4.4. Диетилов етер.

4.5. Етанол, 96% (V/V).

4.6. Подвижна фаза

4.6.1. 1-бутанол : етанол (4.5) : вода =40 : 4 : 9 (V/V/V) или

4.6.2. хлороформ : ацетон = 6 : 4 (V/V).

4.7. Готови плаки за тънкослойна хроматография със силикагел 60, без флуоресцентен индикатор.

4.8. Калиев перманганат.

4.9. Солна киселина, 15% (M/M).

4.10. Реактив за напръскване: 2-толуидин, 1% (M/V) разтвор в етанол (4.5).

5.1. Стандартна лабораторна апаратура.

5.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

5.3. Фотоденситометър.

6.1. Хидролиза

В облодънна колба от 50 сm³ (ml) се претегля около 1 g от пробата (М) с точност 0,001 g. Прибавят се 5 сm³ (ml) вода и 5 сm³ (ml) солна киселина (4.3) и се кипи на обратен хладник в продължение на 1 h. Топлата суспензия веднага се прехвърля с вода в мерителна колба от 50 сm³ (ml). Оставя се да се охлади и се долива до марката с вода. Центрофугира се минимум 5 min при 3000 rpm и се филтрува бистрата течност.

6.2. Екстракция

6.2.1. Вземат се 30 сm³ (ml) от филтрата и се екстрахира три пъти с по 15 сm³ (ml) диетилов етер (4.4). Ако е необходимо, етерните фази се сушат и се обединяват в мерителна колба от 50 сm³ (ml). Долива се до марката с диетилов етер.

6.2.2. Вземат се 25 сm³ (ml) от изсушения етерен екстракт и се изпарява до сухо с ток от азот. Остатъкът се разтваря в 1 сm³ (ml) етанол (4.5).

6.3. Тънкослойна хроматография

6.3.1. Върху плаката за тънкослойна хроматография (4.7) се нанасят 20 µl от етанолния остатък (6.2) и същевременно 8, 12, 16 и 20 µl от стандартния разтвор на 4-толуенсулфонамид (4.2).

6.3.2. Хроматограмата се развива докато фронта на разтворителя достигне 15 сm с подвижната фаза (4.6.1 или 4.6.2).

6.3.3. След пълно изпаряване на подвижната фаза, плаката се поставя за 2-3 min в атмосфера на хлорни пари, които се получават чрез заливане на 2 g калиев пермаганат (4.8) със 100 сm³ (ml) солна киселина (4.9) в затворен съд. Излишъкът от хлор се отстранява чрез загряване на плаката до 100⁰С за 5 min. След това плаката се напръсква с реактив (4.10).

6.4. Измерване

След около 1 h се измерват виолетовите петна с помощта на фотоденситометър при λ=525 nm.

6.5. Построяване на стандартната крива.

На графика, на ординатата се нанасят стойностите на максималната височина на пиковете в mm, установени за четирите петна на 4-толуенсулфонамида, на абсцисата - съответните количества на 4-толуенсулфонамида (т.е. съответно 4, 6, 8 и 10 µg на петно).

Методиката може да се контролира чрез използване на 0,1 или 0,2% (M/V) разтвори на хлорамин-Т (4.1), обработени по същия начин както пробата (6).

Съдържанието на хлорамин-Т в пробата, изразено в % (M/M), се изчислява както следва:

където:

За съдържание на хлорамин-Т около 0,2% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,03% (M/M).

(¹) виж ISO 5725

ХХІ. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩ ФЛУОР В ПАСТИ ЗА ЗЪБИ

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на общ флуор в пасти за зъби, при количества на флуор не повече от 0,25%.

Количеството флуор в пробата, определено по този метод се изразява в % (M/M).

Определянето се извършва чрез газова хроматография. Флуорът от флуор-съдържащи съединения се превръща в кисела среда с хлортриетилсилан (TECS) в триетилфлуорсилан (TEFS) и същевременно се екстрахира с ксилен, съдържащ като вътрешен стандарт циклохексан.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за газова хроматография”.

4.1. Натриев флуорид, изсушен при 120⁰C до постоянна маса.

4.2. Вода, бидестилирана.

4.3. Солна киселина , d₄²⁰=1,19g/cm³ (ml).

4.4. Циклохексан (СН).

4.5. Ксилен, който не дава върху хроматограмата пикове, разположени преди пика на разтворителя, когато последния се хроматографира при същитe условия като пробата (6.1). Ако е необходимо се пречиства чрез дестилация (5.8).

4.6. Хлортриетилсилан (TECS Merck или с еквивалентна чистота).

4.7. Стандартни разтвори на флуор.

4.7.1. Изходен стандартен разтвор, 0,250 mg F^-/cm³ (ml).

Претеглят се точно 138,1 mg натриев флуорид (4.7) с точност 0,001 g и се разтварят във вода (4.2). Разтворът се прехвърля количествено в мерителна колба от 250 cm³ (ml) (5.5). Долива се до марката с вода (4.2) и се разбърква.

4.7.2. Разреден стандартен разтвор 0,050 mg F^-/cm³ (ml).

В мерителна колба от 100 cm³ (ml) (5.5) се прехвърлят с помощта на пипета 20 cm³ (ml) от изходния разтвор (4.7.1). Долива се до марката с вода и се разбърква.

4.8. Разтвор на вътрешен стандарт:

Смесват се 1 cm³ (ml) циклохексан (4.4) и 5 cm³ (ml) ксилен (4.5).

4.9. Хлортриетилсилан – разтвор на вътрешен стандарт:

В мерителна епруветка от 10 cm³ (ml) се поставят с пипета (5.7) 0,6 cm³ (ml) от TECS (4.6) и 0,12 cm³ (ml) от разтвор на вътрешен стандарт (4.8). Долива се до марката с ксилен (4.5) и се разбърква. Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба.

4.10. Перхлорна киселина, 70% (M/V).

4.11. Перхлорна киселина, 20% (M/V).

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газов хроматограф, с пламъчно-йонизационен детектор.

5.3. Хомогенизатор или подобен апарат.

5.4. Клатачна машина (Buhler), тип SMB1 или еквивалентна.

5.5. Полипропиленови мерителни колби, 100 и 250 cm³ (ml).

5.6. Центофужни епруветки (стъклени), 20 cm³ (ml) със запушалки на винт и тефлоново уплътнение, тип Sovirel 611-56 или еквивалентни. Епруветките и запушалките се почистват чрез потапяне в перхлорна киселина (4.11), последвано от петкратно изплакване с вода (4.2) и изсушаване при 100⁰С.

5.7. Автоматични пипети с обхват от 50 до 200 µl с накрайници за еднократна употреба.

5.8. Апаратура за дестилация с дестилационна приставка Schneider с три кълба или еквивалентна колона Vigreux.

6.1. Подготовка на пробата

6.1.1. Избира се неотваряна туба с паста за зъби, разрязва се и цялото съдържание се изстисква в пластмасов съд. Разбърква се добре и се съхранява така, че да не настъпи влошаване на качеството.

6.1.2. В центрофужна епруветка (5.6) се претеглят точно 150 mg (М) от пробата, добавят се 5 cm³ (ml) вода (4.2) и се хомогенизира (5.3).

6.1.3. Добавя се 1 cm³ (ml) ксилол (4.5).

6.1.4. Прибавят се на капки 5 cm³ (ml) солна киселина (4.3) и се хомогенизира (5.3).

6.1.5. В центрофужна епруветка (5.6), с помощта на пипета се прибавят 0,5 cm³ (ml) от разтвор (4.9), състоящ се от хлортриетилсилан и разтвор на вътрешен стандарт.

6.1.6. Епруветката се затваря с капачка на винт (5.6) и се разклаща в продължение на 45 min. в клатачна машина (5.4) при 150 удара (разклащания) за min.

6.1.7. Центрофугира се за 10 min. при скорост, при която се получава ясно разделяне на фазите. Епруветката се отваря, отделя се органичния слой. 3 µl от органичната фаза се инжектира в колоната на газовия хроматограф (5.2).

Забележка: Елуирането на всички компоненти продължава около 20 min.

6.1.8. Инжектирането се повтаря, изчислява се съотношението на средната площ на пиковете (A_TEFS/A_CH) и от стандартната крива (6.3) се отчита съответното количество флуор в mg (M₁).

6.1.9. Общото съдържание на флуор в пробата се изчислява в % спрямо масата на флуора, както е отбелязано в т. 7.

6.2. Хроматографски условия

6.2.1. Колона: от неръждаема стомана

Дължина - 1.8 m

Диаметър - 3.0 mm

Носител - Gaschrom Q 80-100 mesh

Неподвижна фаза - силиконово масло DC 200 или еквивалентно, 20%.

Колоната се кондиционира при 100⁰С за около 12 h (поток на газа носител (азот), 25 сm³/min.). Процедурата се повтаря през 12 h.

След всяко четвърто или пето инжектиране колоната се рекондиционира чрез загряване до 100⁰С за 30 min.

Температури на:

Колона - 70⁰С

Инжектор - 150⁰С

Детектор - 250⁰С

Газ-носител - азот

Скорост на газа-носител - 35 cm³ (ml)/min.

6.3. Построяване на стандартна крива

6.3.1. В серия от 6 центрофужни епруветки (5.6) се поставят с пипети по 0, 1, 2, 3, 4 и 5 cm³ (ml) от разредения стандартен разтвор на флуор (4.7.2). Обемът на всяка епруветка се довежда до 5 cm³ (ml) с вода (4.2).

6.3.2. По-нататък се извършва процедура, описана от 6.1.3 до 6.1.6 включително.

6.3.3. Инжектират се по 3 µl от органичната фаза в газовия хроматограф (5.2).

6.3.4. Инжектирането се повтаря и се изчислява средното съотношение на пиковете (A_TEFS/A_CH).

6.3.5. Начертава се стандартната крива, корелираща с масата на флуора (mg) в стандартния разтвор (6.3.1) и съотношението на площите на пиковете (A_TEFS/A_CH), изчислени съгласно 6.3.4. Точките върху графиката се свързват помежду си с най-подходящата права линия, получена чрез използване на регресионен анализ.

7. Изчисления

Общото съдържание на флуор в пробата в % (M/M) F се изчислява по формулата:

където:

(¹) виж ISO 5725

Методът се отнася за идентификация и определяне на органоживачни съединения, използвани като консерванти в козметични продукти за очи. Приложима е за тиомерсал (INN) (натриев 2-(етилмеркуритио)бензоат) и фенилмеркури и неговите соли.

Органоживачните съединения образуват комплекс с 1,5-дифенил-3-тиокарбазон. След екстракция на дитизоната с тетрахлорметан се провежда тънкослойна хроматография върху силикагел. Петната на дитизонатите имат оранжев цвят.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ”, а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.1. Сярна киселина, 25% (V/V).

2.2. 1,5-дифенил-3-тиокарбазон (дитизон): 0,8 mg в 100 сm³ (ml) тетрахлорметан (2.4).

2.3. Азот.

2.4. Тетрахлорметан.

2.5. Подвижна фаза: хексан : ацетон = 90 : 10 (V/V).

2.6. Стандартен разтвор, 0,001% във вода на:

натриев 2-(етилмеркуритио) бензоат,

етилмеркурихлорид или метилмеркурихлорид,

фенилмеркуринитрат или фенилмеркуриацетат,

меркури дихлорид или меркури диацетат.

2.7. Готови плаки за тънкослойна хроматография със силикагел (напр. Merck ₅₇₂₁ или еквивалентни).

2.8. Натриев хлорид.

3.1. Стандартно лабораторно оборудване.

3.2. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

3.3. Филтър за разделяне на фазите.

4.1. Екстракция

4.1.1. 1 g от пробата се разрежда чрез титруване с 20 сm³ (ml) дестилирана вода в центрофужна епруветка. Постига се максимално диспергиране и се загрява до 60⁰С на водна баня. Прибавят се 4 g натриев хлорид (2.8). Разклаща се. Оставя се да се охлади.

4.1.2. Центрофугира се поне 20 min при 4500 rpm, за да се отдели по-голямата част от твърдата фаза от течността. Филтрува се в делителна фуния и се добавят 0,25 сm³ (ml) разтвор на сярна киселина (2.1).

4.1.3. Екстрахира се няколко пъти с 2 или 3 сm³ (ml) разтвор на дитизон (2.2), докато при последната екстракция органичната фаза остава зелена.

4.1.4. Последователно се филтрува всяка органична фаза през филтъра за разделяне на фазите (3.3).

4.1.5. Изпарява се до сухо с ток от азот.

4.1.6. Разтваря се с 0,5 сm³ (ml) тетрахлорметан (2.4). Този разтвор се третира веднага, както е посочено в 4.2.1.

4.2. Разделяне и идентификация

4.2.1. 50 µl от получения в 4.1.6 тетрахлорметанов разтвор се нанасят незабавно върху плаката със силикагел (2.7). Едновременно с това се обработват 10 сm³ (ml) от стандартния разтвор (2.6), както е посочено в 4.1 и върху същата плака се нанасят 50 µl от разтвора, получен в 4.1.6.

4.2.2. Плаката се поставя в подвижната фаза (2.5) и хроматограмата се развива докато фронтът достигне 15 сm височина. Органоживачните съединения се идентифицират като оцветени петна, чийто цвят е стабилен, ако веднага след изпаряване на разтворителите слоят се покрие със стъклена пластина.

Получават се примерно следните R_f-стойности:

Съдържанието на органоживачни съединения, определено по този метод, се изразява като % (M/M) живак в пробата.

Методът се състои в измерване количеството на присъстващия общ живак. Поради това е необходимо първо да се установи, че в пробата не присъства живак в неорганично състояние и да се идентифицират органоживачните производни, съдържащи се в пробата. След минерализация, освободеният живак се измерва чрез безпламъкова атомно-абсорбционна спектрометрия.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а).

3.1. Концентрирана азотна киселина, d₄²⁰ = 1,41 g/сm³ (ml)

3.2. Концентрирана сярна киселина, d₄²⁰ = 1,84 g/сm³ (ml)

3.3. Бидестилирана вода

3.4. Калиев перманганат, 7% (M/V)

3.5. Хидроксиламин хидрохлорид, 1,5% (M/V)

3.6. Дикалиев пероксодисулфат, 5% (M/V)

3.7. Калаен дихлорид, 10% (M/V)

3.8. Концентрирана солна киселина, d₄²⁰ = 1,18 g/сm³ (ml)

3.9. Стъклена вата, импрегнирана с паладиев дихлорид, 1% (M/M).

4. Апаратура

4.1. Стандартно лабораторно оборудване.

4.2. Апарат за безпламъково атомно-абсорбционно определяне на живак (техника на студените пари), включително необходимата стъклария. Оптичен път на кюветата – минимум 10 сm.

5. Процедура

Вземат се обичайните предпазни мерки за анализ на следи от живак.

5.1. Разлагане на пробата

5.1.1. Претеглят се 0,15 g от пробата (М) с точност 0,001 g. Прибавят се 10 сm³ (ml) азотна киселина (3.1) и се оставя да се разлага 3 h в херметично затворена колба на водна баня при 55⁰С, като се разклаща често. Едновременно се разработва и празна проба на реактивите.

5.1.2. След охлаждане се прибавят 10 сm³ (ml) сярна киселина (3.2) и се връща на водната баня при 55⁰С за 30 min.

5.1.3. Колбата се поставя в ледена баня и внимателно се прибавят 20 сm³ (ml) вода (3.3).

5.1.4. На порции се прибавят по 2 сm³ (ml) от 7% калиев перманганат (3.4), докато разтворът остане оцветен. Връща се във водната баня при 55⁰С за 15 min.

5.1.5. Прибавят се 4 сm³ (ml) разтвор на дикалиев пероксидисулфат (3.6). Продължава се загряването на водна баня при 55⁰С за 30 min.

5.1.6. Оставя се да се охлади и съдържанието на колбата се прехвърля в мерителна колба от 100 сm³ (ml). Колбата се промива с 5 сm³ (ml) хидроксиламинхидрохлорид (3.5) и след това се промива 4 пъти с по 10 сm³ (ml) вода (3.3). Полученият разтвор трябва да бъде напълно безцветен. Долива се до марката с вода (3.3).

5.2. Определяне

5.2.1. 10 сm³ (ml) от разтвора за изпитване (5.1.6) се поставят в стъкления съд за определяне на студени пари живак (4.2). Разрежда се със 100 сm³ (ml) вода (3.3) и последователно се прибавят 5 сm³ (ml) сярна киселина (3.2) и 5 сm³ (ml) калаен дихлорид (3.7). Разбърква се след всяко добавяне. Изчакват се 30 sec., за да се редуцират всички живачни йони до метално състояние и се отчита резултата (n).

5.2.2. Поставя се известно количество стъклен памук, импрегниран с паладиев дихлорид (3.9) между съда за редукция на живака и проточната кювета на инструмента (4.2). Повтаря се процедурата 5.2.1 и се записва резултата. Ако резултатът не е нула, минерализацията е непълна и анализът трябва да се повтори.

Нека:

Количеството живак, изразено като % (M/M) живак, се изчислява по формулата:

7.1. За подобряване на минерализацията може да се започне с разреждане на пробата.

7.2. Ако се предполага абсорбция на живак от субстрата, трябва да се проведе количествено определяне по метода на стандартните добавки.

8. Повторяемост (¹)

За съдържание на живак около 0,007%, разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,00035%.

(¹) виж ISO 5725

ХХІІІ. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АЛКАЛНИ И АЛКАЛОЗЕМНИ СУЛФИДИ

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на сулфиди, присъстващи в козметични продукти. Присъствието на тиоли и други редуциращи агенти (включително сулфити) не пречи.

Концентрацията на сулфиди, определена по този метод, се изразява в % (M/M) сяра.

След подкисляване на средата, сяроводородът се увлича с ток от азот и се свързва под формата на кадмиев сулфид. Последният се филтрува, промива и след това се определя йодометрично.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Концентрирана солна киселина, d₄²⁰ = 1,19 g/сm³ (ml).

4.2. Натриев тиосулфат, 0,1 М стандартен разтвор.

4.3. Йод, 0,05 М стандартен разтвор.

4.4. Динатриев сулфид.

4.5. Кадмиев диацетат.

4.6. Концентриран разтвор на амоняк, d₄²⁰ = 0,90 g/сm³ (ml).

4.7. Амонячен разтвор на кадмиев диацетат: разтварят се 10 g кадмиев диацетат в около 50 сm³ (ml) вода. Добавя се амоняк (4.6), докато първоначално получената утайка отново се разтвори (примерно около 20 сm³ (ml). Долива се с вода до общ обем 100 сm³ (ml).

4.8. Азот.

4.9. Амоняк, 1 М.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Облодънна тригърлена колба на шлиф от 100 сm³ (ml).

5.3. Две конични колби от 100 сm³ (ml) на шлиф, снабдени с приставка, съдържаща потапяща се тръба за подвеждане на газ и странична тръба за неговото отвеждане.

5.4. Фуния с дълга опашка.

6. Процедура

6.1. Увличане и фиксиране на сероводорода

6.1.1. Работи се с опаковка на продукта, която не е била отваряна преди това. В тригърлена колба (5.2) се претегля с точност 0.001 g такава маса (М) от продукта, изразена в g, която да съответства на не повече от 30 mg сулфидни йони. Прибавят се 60 сm³ (ml) вода и няколко капки пеногасител.

6.1.2. Във всяка от двете конични колби (5.3) се поставят по 50 сm³ (ml) от разтвор (4.7).

6.1.3. Към облодънната колба (5.2) се присъединяват: фуния с кран, потапяща се в течността тръба и тръба за отвеждане на газа. Отвеждащата тръба се свързва с конични колби, свързани последователно, с помощта на тръби от PVC.

Забележка: Посочената апаратура трябва да се провери за липса на утечки по следния начин: симулирайки условията на изпитването, изпитваният продукт се замества с 10 сm³ (ml) разтвор на натриев сулфид (приготвен от 4.4), който съдържа “Х” mg сулфид (определен йодометрично). Нека “Y” mg е сулфидът, определен в края на тази операция. Разликата между количество “Х” и количество “Y” не трябва да е повече от 3%.

6.1.4. В продължение на 15 min през облодънната колба (5.2) се продухва азот (4.8) със скорост 2 мехурчета/sec., за да се измести съдържащия се в нея въздух.

6.1.5. Облодънната колба се нагрява до 85 ± 5⁰С.

6.1.6. Спира се подаването на азот (4.8) и през фунията се прибавят капка по капка 40 сm³ (ml) солна киселина (4.1).

6.1.7. Когато е прибавена почти всичката киселина, се пуска отново тока от азот (4.8), като във фунията се оставя минимален слой течност, за да се избегне излитане на сероводород.

6.1.8. Нагряването се прекратява след 30 min. Колбата (5.2) се оставя да се охлади, като подаването на азот продължава поне още 1 h и 30 min.

6.2. Титруване

6.2.1. Кадмиевият сулфид се филтрува през фуния с дълга опашка (5.4).

6.2.2. Коничните колби (5.3) се промиват първо с амонячен разтвор (4.9), който се излива върху филтъра. След това се промиват с дестилирана вода, която се използва за промиване на утайката върху филтъра.

6.2.3. Промиването на утайката завършва с още 100 сm³ (ml) вода.

6.2.4. Хартиеният филтър се поставя в първата конична колба, която съдържа утайката. Добавят се 25 сm³ (ml) (n₁) разтвор на йод (4.3), около 20 сm³ (ml) солна киселина (4.1) и 50 сm³ (ml) дестилирана вода.

6.2.5. Определя се излишъка на йод, като се титрува с разтвор на натриев тиосулфат (n₂) (4.2).

Съдържанието на сулфиди в пробата, изразено като сяра в % (M/M) се изчислява по следната формула:

където:

За съдържание на сулфиди около 2% (M/M), разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава по абсолютна стойност 0,2% (M/M).

(¹) виж ISO 5725

Методът се отнася за откриване на α-моноглицерил 4-аминобензоат (глицерол 1-(4-аминобензоат). Определя се и етил-4-аминобензоат (бензокаин INN), който може да присъства като онечистване.

Идентификацията се извършва чрез тънкослойна хроматография на силикагел с флуоресцентен индикатор и откриване на свободна първична аминогрупа чрез образуване на диазо багрило върху плаката.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата-дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Смес от разтворители: циклохексан : пропан-2-ол : стабилизиран дихлорметан = 48:64:9 (V/V/V).

3.2. Подвижна фаза: петролеев етер (40-60) : бензен : ацетон : разтвор на амониев хидроксид (min 25% NH₃) = 35:35:35:1 (V/V/V/V).

3.3. Реактив за проявяване:

а) Натриев нитрит: 1 g в 100 cm³ (ml) 1 М солна киселина (приготвя се непосредствено преди употреба);

б) 2-нафтол: 0,2 g в 100 cm³ (ml) 1 М калиев хидроксид.

3.4. Стандартни разтвори:

- -моноглицерил 4-аминобензоат: 0,05 g в 100 cm³ (ml) смесен разтворител 3.1;

- етил 4-аминобензоат: 0,05 g в 100 cm³ (ml) смесен разтворител (3.1).

3.5. Плаки със силикагел 60 F₂₅₄ с дебелина на слоя 0,25 mm, 20 х 20 сm.

4. Апаратура

4.1. Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

4.2. Ултразвукова вана.

4.3. Филтър Мillipore FH 0,5 µm или еквивалентен.

5.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба от 10 cm³ (ml) се претеглят 1,5 g с точност 0,001g от изпитвания продукт. Долива се до марката с разтворител (3.1). Колбата се затваря и се оставя поне един час при стайна температура в ултрaзвукова вана (4.2). Филтрува се през филтър Мillipore (4.3) и филтратът се използва за хроматографиране.

5.2. Тънкослойна хроматография

Върху плаката (3.5) се нанасят по 10 µl от разтвора на пробата (5.1) и стандартните разтвори (3.4).

Хроматограмата се развива до 15 сm височина във вана, предварително наситена с подвижната фаза (3.2). Изсушава се при стайна температура.

5.3. Проявяване на петната

5.3.1. Плаката се наблюдава на УВ-светлина с дължина на вълната 254 nm.

5.3.2. Напълно изсушената плака се напръсква с реактив 3.3 (а).

Подсушава се при стайна температура за 1 min и веднага се напръсква с реактив 3.3 (б).

Плаката се изсушава в сушилня при 60⁰С. Появяват се оранжеви петна на -моноглицерил 4-аминобензоат с R_f-0,07 и на етил 4-аминобензоат с R_f-0,55.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на α-моноглицерил 4-аминобензоат. Определя се също и етил 4-аминобензоат. Не може да се определя съдържание, по-голямо от 5% (M/M) -моноглицерил 4-аминобензоат и 1% (M/M) етил 4-аминобензоат.

Съдържанието на -моноглицерил 4-аминобензоат и етил 4-аминобензоат, определени по този метод, се изразяват в % (М/M) от масата на пробата.

Изпитваният продукт се суспендира в метанол и след подходяща обработка на пробата се определя чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

Всички реактиви трябва да са с квалификация за “ВЕТХ ”, а водата-бидестилирана.

4.1. Метанол.

4.2. Калиев дихидрогенортофосфат (KH₂PO₄).

4.3. Цинков диацетат (Zn(CH₃COO)₂.2H₂O).

4.4. Оцетна киселина (d₄²⁰ = 1,05).

4.5. Тетракалиев хексацианоферат (K₄(Fe(CN)₆).3H₂O).

4.6. Етил 4-хидроксибензоат.

4.7. α-моноглицерил 4-аминобензоат.

4.8. Етил 4-аминобензоат.

4.9. Разтвор на фосфатен буфер, 0,02 М: Разтварят се 2,72 g калиев дихидрогенортофосфат (4.2) в един литър вода.

4.10. Подвижна фаза: фосфатен буфер (4.9) : метанол (4.1) = 61:39 (V/V).

Съставът на подвижната фаза може да бъде променен, така че да се постигне разделяне R  1,5.

където:

4.11. Основен разтвор на α-моноглицерил 4-аминобензоат: претегля се около 0,04 g с точност 0,001 g α-моноглицерил 4-аминобензоат и се поставят в мерителна колба от 100 cm³ (ml). Разтварят се в 40 cm³ (ml) метанол (4.1). Долива се до марката с буферен разтвор (4.9) и се разбърква.

4.12. Основен разтвор на етил 4-аминобензоат: претегля се около 0,04g с точност 0,001 g етил 4-аминобензоат и се поставят в мерителна колба от 100 cm³ (ml). Разтваря се в 40 cm³ (ml) метанол (4.1). Долива се до марката с буферен разтвор (4.9) и се разбърква.

4.13. Разтвор на вътрешен стандарт: претегля се около 0,05 g с точност 0,001g етил 4-хидроксибензоат (4.6) и се поставя в мерителна колба от 100 cm³ (ml). Разтваря се в 40 cm³ (ml) метанол (4.1). Долива се до марката с буферен разтвор (4.9) и се разбърква.

4.14. Стандартни разтвори: приготвят се четири стандартни разтвора чрез прибавяне в 100 cm³ (ml) подвижна фаза (4.10) на горните разтвори съгласно следната таблица:

Стан- дартни разтво- ри	α-моноглицерил 4-аминобензоат		етил 4-аминобензоат		етил 4-хидроксибензоат
	(µg/cm3 (ml)*	сm3 (ml) (4.11)	(µg/cm3 (ml)*	cm3 (ml) (4.12)	(µg/cm3 (ml)*	сm3 (ml) (4.13)
I	8	2	8	2	50	10
II	16	4	12	3	50	10
III	24	6	16	4	50	10
IV	40	10	20	5	50	10

(*) Тези стойности са дадени за сведение и съответстват на точните маси от 4.11, 4.12 и 4.13.

4.15. Разтвор на Carrez I: 26,5 g тетракалиев хексацианоферат

(4.5) се разтварят във вода и обемът се довежда до 250 cm³ (ml).

4.16. Разтвор на Carrez II: 54,9 g цинков диацетат (4.3) и 7,5 cm³ (ml) оцетна киселина (4.4) се разтварят във вода и обемът се довежда до 250 cm³ (ml).

4.17. Lichrosorb RP-18 на Merck или еквивалентен, със среден размер на частиците 5 µm.

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. ВЕТХ апарат, снабден с UV-детектор с променлива дължина на вълната и термостат, нагласен на 45^oС.

5.3. Колона от неръждаема стомана: дължина–25 сm; вътрешен диаметър–4,6 mm; пълнеж– Lichrosorb RP-18 (4.17).

5.4. Ултразвукова вана.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата

6.1.1. Претегля се около 1,0 g от пробата с точност 0,001 g в стъклена чаша от 100 cm³ (ml) и се прибавят 10 cm³ (ml) метанол (4.1).

6.1.2. Чашата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 20 min. за получаване на суспензия. Така получената суспензия се прехвърля количествено в мерителна колба от 100 cm³ (ml), използвайки не повече от 75 cm³ (ml) подвижна фаза (4.10). Последователно се прибавят 1,0 cm³ (ml) разтвор на Carrez I (4.15) и 1,0 cm³ (ml) разтвор на Carrez II (4.16), като се разбърква след всяко прибавяне. Долива се до марката с подвижна фаза (4.10), разбърква се отново и се филтрува през нагънат хартиен филтър.

6.1.3. В мерителна колба от 50 cm³ (ml) се прехвърлят с пипета 3,0 cm³ (ml) от получения в 6.1.2 филтрат и 5 cm³ (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.13). Долива се до марката с подвижната фаза (4.10) и се разбърква. Така полученият разтвор се използва за провеждане на хроматографския анализ, съгласно т. 6.2.

6.2. Хроматографиране

6.2.1. Скоростта на потока на подвижната фаза (4.10) се нагласява на 1,2 cm³ (ml)/min, а температурата на колоната на 45⁰С.

6.2.2. Детекторът (5.2) се настройва на 274 nm.

6.2.3. С микроспринцовка в хроматографа се дозират най-малко два пъти 20 µl от разтвора (6.1.3) и се измерват площите на пиковете.

6.3. Стандартна крива

6.3.1. Инжектират се 20 µl от всеки стандартен разтвор (4.14) и се измерват площите на пиковете.

6.3.2. За всяка концентрация се изчислява отношението между площите на пиковете на α-моноглицерил 4-аминобензоата и площите на пиковете на вътрешния стандарт. На графиката тези отношения се нанасят по абсцисата, а по ординатата се нанасят отношенията на съответните маси.

6.3.3. По същия начин се процедира и за етил 4-хидроксибензоата.

7. Изчисления

7.1. От стандартната крива, получена съгласно 6.3, се отчитат съотношенията на масите (RP₁, RP₂), съответстващи на отношенията между площите на пиковете, изчислени в 6.2.3,

където:

RP₁ е масата на α-моноглицерил 4-аминобензоат към масата на етил 4-хидроксибезоата в g;

RP₂ е масата на етил 4-аминобензоата към масата на етил 4-хидроксибензоата в g.

7.2. От получените отношения на масите се изчислява съдържанието на -моноглицерил 4-аминобензоат и етил 4-аминобензоат, изразено в % (M/M), съгласно формулите:

където:

За съдържание на -моноглицерил 4-аминобензоат от 5% (M/M), разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 0,25% (M/M).

За съдържание на етил 4-аминобензоат от 1% (M/M), разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 0,1% (M/M).

9. Забележки

9.1. Преди провеждане на анализите се проверява дали пробата съдържа вещества, които се застъпват с пика на вътрешния стандарт (етил 4-хидроксибензоат) на хроматограмата.

9.2. За да се провери отсъствието на всякакво застъпване, определянето се повтаря при променено относително съотношение на метанола в подвижната фаза с 10%.

(¹) виж ISO 5725


ХХV. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХЛОРБУТАНОЛ

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на хлорбутанол (INN) до максимална концентрация от 0,5% (M/M) във всички козметични продукти, с изключение на аерозолите.

Съдържанието на хлорбутанол, определено по този метод, се изразява в % (M/M) на пробата.

След подходяща обработка на продукта, който ще се анализира, определянето се провежда с газова хроматография, като се използва 2,2,2-трихлоретанол за вътрешен стандарт.

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за газова хроматография”.

4.1. Хлорбутанол (1,1,1-трихлор-2-метилпропан-2-ол).

4.2. 2,2,2-трихлоретанол.

4.3. Абсолютен етанол.

4.4. Стандартен разтвор на хлорбутанол: 0,025 g в 100 cm³ (ml) етанол (4.3) (M/V).

4.5. Стандартен разтвор на 2,2,2-трихлоретанол: 4 mg в 100 cm³ (ml) етанол (4.3) (M/V).

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газ хроматограф с електрон-улавящ детектор, Ni⁶³.

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата

Претеглят се между 0,1 и 0,3 g от пробата с точност 0,001 g (М). Поставят се в мерителна колба от 100 cm³ (ml). Разтваря се в етанол (4.3), прибавя се 1 cm³ (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.5) и се долива до марката с етанол (4.3).

6.2. Газ хроматографски условия

6.2.1. Работните условия трябва да дават разделяне R  1,5.

където:

6.2.2. Като пример, следните работни условия дават желаното разделяне:

В пет мерителни колби от 100 cm³ (ml) се поставя по 1 cm³ (ml) от стандартния разтвор (4.5) и съответно 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 cm³ (ml) от разтвор 4.4, доливат се до марката с етанол (4.3) и се разбъркват. В хроматографа се инжектира по 1 µl от всеки от тези разтвори, съобразно работните условия, описани в 6.2.2 и се построява стандартна крива, като на абцисата се нанася отношението на масата на хлорбутанола към масата на 2,2,2-трихлоретанола, а на ординатата – отношението между съответните площи на пиковете.

6.4. Инжектира се 1 µl от разтвора, получен в 6.1 и се процедира съгласно условията, описани в 6.2.2.

7. Изчисления

7.1. От стандартната крива (6.3) се отчита количеството “а” на хлорбутанола в разтвор 6.1, изразено в µg.

7.2. Съдържанието на хлорбутанол в пробата се изчислява съгласно формулата:

% хлорбутанол (M/M) =

8. Повторяемост (¹)

За съдържание на хлорбутанол от 0,5% (M/M), разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 0,01% (M/M).

Забележка: Ако резултатът е равен или надвишава максимално допустимата концентрация е необходимо да се провери за отсъствие на пречещи вещества.

(¹) виж ISO 5725

Методът се отнася за откриване на хинин в шампоани и лосиони за коса.

Идентификацията се извършва чрез тънкослойна хроматография върху силикагел. Хининът се доказва чрез неговата синя флуоресценция в кисела среда при 360 nm.

За допълнително потвърждение може да се използва изчезването на флуоресценцията при насищане с бромни пари. При насищане на същата плака с амонячни пари петната се появяват повторно с жълтеникава флуоресценция.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Плаки със силикагел без флуоресцентен индикатор, дебелина на слоя 0,25 mm, 20 x 20 сm.

3.2. Подвижна фаза: толуен : диетилов етер : дихлорметан : диетиламин = 20:20:20:8 (V/V/V/V).

3.3. Метанол.

3.4. Сярна киселина, 96% (d₄²⁰ = 1,84).

3.5. Диетилов етер.

3.6. Реактив за проявяване на петната: внимателно се добавят 5 cm³ (ml) сярна киселина (3.4) към 95 cm³ (ml) диетилов етер в охладен съд.

3.7. Бром.

3.8. Разтвор на амониев хидроксид, 28% (d₄²⁰ = 0,90).

3.9. Хинин, безводен.

3.10. Стандартен разтвор: претеглят се около 0,1 g безводен хинин (3.9) с точност 0,001 g и се разтварят в мерителна колба до 100 cm³ (ml) с метанол (3.3).

4.1. Стандартно оборудване за тънкослойна хроматография.

4.2. Ултразвукова вана.

4.3. Филтър Millipore, FH 0,5 µm или еквивалентен, с подходящо оборудване за филтруване.

5.1. Приготвяне на пробата

В мерителна колба от 100 cm³ (ml) се претегля точно такова количество от пробата, което да съдържа около 100 mg хинин, разтваря се и се долива до марката с метанол (3.3).

Колбата се запушва и се поставя за 1 h в ултразвуковата вана (4.2) при стайна температура. Филтрува се (4.3) и филтратът се използва за хроматография.

5.2. Тънкослойна хроматография

Върху плака със силикагел (3.1) се нанасят 1,0 µl от стандартния разтвор (3.10) и 1,0 µl от разтвора на пробата (5.1). Хроматограмата се развива докато фронта на разтворителите достигне 15 сm, като се използва подвижна фаза (3.2) в предварително наситена вана.

5.3. Проявяване на петната

5.3.1. Плаката се изсушава на стайна температура.

5.3.2. Напръсква се с реактив 3.6.

5.3.3. Плаката се оставя да изсъхне 1 h при стайна температура.

5.3.4. Наблюдава се на УВ-светлина с дължина на вълната 360 nm. Хининът се вижда като петно с интензивна синя флуоресценция.

Като пример на таблицата по-долу са дадени R_f-стойностите в същата подвижна фаза на главните алкалоиди, свързани с хинина:

5.3.5. За допълнително потвърждение на присъствието на хинин, плаката се насища около 1 h с бромни пари (3.7). Флуоресценцията изчезва. Когато същата плака се насити с амонячни пари (3.8), петната отново се появяват с кафяв цвят и когато плаката отново се разгледа на УВ-светлина при 360 nm може да се наблюдава жълтеникава флуоресценция.

Откриваем минимум: 0,1 µg хинин.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определянето на хинин. Може да бъде използван за определяне на максимално допустимата концентрация от 0,5% (M/M) в шампоани и 0,2% в лосиони за коса.

Съдържанието на хинин, определено по този метод, се изразява в % (M/M) на продукта.

След подходяща обработка на продукта, който ще се анализира, определянето се извършва чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

Всички реактиви трябва да са с квалификация “за ВЕТХ”, а водата-бидестилирана.

4.1. Ацетонитрил.

4.2. Калиев дихидрогенортофосфат (KH₂PO₄).

4.3. Ортофосфорна киселина, 85% (d₄²⁰=1,7).

4.4. Тетраметиламониев бромид.

4.5. Хинин, безводен.

4.6. Метанол.

4.7. Разтвор на ортофосфорна киселина, 0,1 М: претеглят се 11,53 g ортофосфорна киселина (4.3) и се разтварят в 1000 cm³ (ml) вода в мерителна колба.

4.8. Разтвор на калиев дихидрогенортофосфат, 0,1 М: претеглят се 13,6 g калиев дихидрогенортофосфат (4.2) и се разтварят в 1000 cm³ (ml) вода в мерителна колба.

4.9. Разтвор на тетраметиламониев бромид: разтварят се 15,40 g тетраметиламониев бромид (4.4) в 1000 cm³ (ml) вода в мерителна колба.

4.10. Подвижна фаза: ортофосфорна киселина (4.7) : калиев дихидрогенортофосфат (4.8) : тетраметиламониев бромид (4.9) : вода : ацетонитрил (4.1) = 10:50:100:340:90 (V/V/V/V/V).

Съставът на подвижната фаза може да бъде променен, така че да се постигне разделяне R  1,5.

където: